Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Podsumowanie

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Streszczenie

Mikrośrodowisko guza odgrywa kluczową rolę w inicjacji guza, progresji, przerzutach i odpowiedzi na terapie przeciwnowotworowe. Trójwymiarowe systemy kohodowli są często wykorzystywane do wyjaśniania interakcji między guzem a zrębem, w tym ich roli w reakcjach na leki. Jednak wiele interakcji zachodzących in vivo w nienaruszonym mikrośrodowisku nie może być w pełni odtworzonych w tych warunkach in vitro. W związku z tym bezpośrednia wizualizacja tych procesów w czasie rzeczywistym stała się ważnym narzędziem w zrozumieniu reakcji guza na terapie i identyfikacji interakcji między komórkami rakowymi a zrębem, które mogą wpływać na te reakcje. W tym miejscu przedstawiamy metodę wykorzystania mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem żywych, znieczulonych myszy do bezpośredniej obserwacji dystrybucji leków, odpowiedzi komórek rakowych i zmian w interakcjach guz-zrąb po podaniu terapii systemowej w modelach raka piersi. Opisujemy procedury znakowania różnych składników guza, leczenie zwierząt w celu obserwacji odpowiedzi terapeutycznych oraz procedurę chirurgiczną polegającą na naświetlaniu tkanek nowotworowych do obrazowania do 40 godzin. Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu to filmy poklatkowe, w których takie procesy jak infiltracja leków, śmierć komórek rakowych i migracja komórek zrębu mogą być oceniane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wprowadzenie

Guzy lite składają się z dwóch głównych przedziałów: komórek rakowych i składników zrębu (zarówno komórkowych, jak i niekomórkowych), które pomagają w utrzymaniu odpowiedniego środowiska do wzrostu guza¹. Te składniki zrębu odgrywają kluczową rolę w rozwoju, progresji i przerzutach wielu rodzajów nowotworów, w tym raka piersi^2-5. Środowisko zrębu wpływa również na odpowiedzi terapeutyczne^2,4,5. W związku z tym określenie, w jaki sposób komórki nowotworowe reagują na konwencjonalne i nowatorskie terapie w kontekście nienaruszonego mikrośrodowiska, jest ważne dla pogłębienia naszego zrozumienia biologii nowotworów i ulepszenia obecnych strategii terapeutycznych. Co więcej, określenie, w jaki sposób interakcje komórka rakowa - zrąb zmienia się po zastosowaniu terapii, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii nawrotu nowotworu.

Organotypowe systemy kohodowli były przydatne do badania interakcji guz-zrąb⁶, ale oczywiste jest, że obecnie dostępne metody nie są w stanie skutecznie odtworzyć nienaruszonego mikrośrodowiska guza in vitro, w szczególności w odniesieniu do funkcji naczyń krwionośnych i rekrutacji komórek odpornościowych. Rzeczywiście, odpowiedzi komórek nowotworowych na terapie obserwowane in vitro często znacznie różnią się od tych obserwowanych in vivo, gdzie mikrośrodowisko jest nienaruszone⁵. W związku z tym modele in vivo do badania interakcji między guzem a zrębem i ich wpływu na odpowiedź terapeutyczną mogą lepiej odzwierciedlać klinicznie istotne mechanizmy⁷.

Podstawowym sposobem badania reakcji na terapię przeciwnowotworową in vivo były pomiary wielkości guza i ocena histologiczna tkanek pochodzących od leczonych zwierząt lub pacjentów. Jednak postępy w mikroskopii i reporterach fluorescencyjnych w ciągu ostatnich dwóch dekad umożliwiły wizualizację procesów między- i wewnątrzkomórkowych w wysokiej rozdzielczości u żywych, znieczulonych zwierząt (obrazowanie przyżyciowe)⁸. Te technologie mikroskopii przyżyciowej okazały się szczególnie cenne dla przestrzennego i czasowego analizowania dynamiki in vivo interakcji guz-zrąb w rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej^8,9.

Procesy, które zostały rozwikłane przez obrazowanie przyżyciowe, obejmują cytotoksyczność przeciwnowotworowych limfocytów T^10,11, interakcje między limfocytami T a komórkami szpikowymi¹², dynamikę zmian w składzie i organizacji kolagenu po leczeniu terapeutycznym¹³, wewnątrznaczynienie i przerzuty komórek rakowych zależnych od makrofagów¹⁴ oraz przepuszczalność naczyń¹⁵.

Istnieją trzy główne wymagania dotyczące obrazowania przyżyciowego. Obejmują one odpowiednie przygotowanie i naświetlanie tkanek do obrazowania, znakowanie fluorescencyjne składników tkanek będących przedmiotem zainteresowania oraz sparowany system mikroskopowo-kamerowy zdolny do pozyskiwania obrazów¹⁶. Najczęstsze strategie stosowane w celu spełnienia tych wymagań obejmują: 1) preparaty heterotopowe (np. inokulacja ucha lub oczodołu), stałe okna obrazowania lub preparaty zewnętrzne (np. grzbietowy płat skóry); 2) transgeniczne reportery fluorescencyjne i fluorescencyjne środki do wstrzykiwań do znakowania składników tkankowych; oraz 3) systemy mikroskopii wielofotonowej lub konfokalnej w połączeniu z lampami fotopowielającymi lub kamerami CCD (Charge-coupled Device), odpowiednio:⁹. Używamy chirurgicznie przygotowanego modelu płata skóry do odsłonięcia pachwinowego gruczołu sutkowego do obrazowania u znieczulonych zwierząt, które wykazują ekspresję transgenów kodujących reportery fluorescencyjne. Obrazy są uzyskiwane w okresie od 12 do 40 godzin za pomocą kamery ze wzmocnionym przetwornikiem CCD (ICCD) w połączeniu z systemem czterolaserowego mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem¹⁷. Obrazowanie w ten sposób pozwoliło nam zbadać takie procesy, jak dystrybucja leków in vivo, zależne od etapu odpowiedzi na chemioterapię, rodzaj śmierci komórek wywołanej chemioterapią i zachowanie komórek szpikowych⁵.

Udostępniamy protokół do przyżyciowego obrazowania odpowiedzi komórek nowotworowych na terapię przeciwnowotworową i interakcje guz-zrąb w mysich modelach raka piersi. Protokół ten może być używany do śledzenia zachowań i śmierci zarówno komórek rakowych, jak i składników zrębu za pomocą szerokiej gamy transgenicznych i wstrzykiwanych znaczników fluorescencyjnych zarówno w modelach transgenicznych, jak i transplantacyjnych przez okres do 40 godzin podczas jednej sesji obrazowania.

Protokół

Wszystkie opisane procedury muszą być przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami dotyczącymi wykorzystania kręgowców, w tym po uzyskaniu uprzedniej zgody lokalnej Instytucjonalnej Komisji ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee).

1. Generowanie guzów piersiowych u myszy do obrazowania (transgenicznych lub ortotopowych)

1. Wywołaj guzy piersi do obrazowania, wykorzystując genetycznie zmodyfikowane modele mysie (np. modele z długim powtórzeniem końcowym wirusa nowotworu piersi myszy [MMTV] i średnim antygenem T poliyomy [PyMT] lub modele z dużym antygenem T SV40 [C3(1)-Tag] sterowanym przez szczurzy promotor C3(1)) lub modele transplantacji ortotopowej (syngeniczne, allogeniczne lub ksenogeniczne).
2. Znakuj komórki nowotworowe poprzez krzyżowanie modeli genetycznie zmodyfikowanych z transgenicznymi liniami reporterowymi (np. ACTB-ECFP) lub stosując manipulacje ex vivo pierwotnych komórek nowotworowych bądź linii komórkowych (np. transdukcję), a następnie transplantację. Przykładowy protokół transplantacji ortotopowej znajduje się w punkcie ¹⁸.

2. Wizualizacja elementów mikrośrodowiska guza lub komponentów wewnątrzkomórkowych

1. Wizualizacja komponentów guza przy użyciu znaczników transgenicznych. Przeprowadź krzyżowanie genetycznie zmodyfikowanych modeli nowotworowych z transgenicznymi myszami reporterowymi (np. c-fms-EGFP dla komórek mieloidalnych lub ACTB-H2B-EGFP dla jąder komórkowych) lub wykorzystaj takie myszy jako biorców przeszczepionych, znakowanych tkanek. Pozwala to odpowiednio na wizualizację interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami zrębu w odpowiedzi na terapię lub zmian nuclearnych związanych ze śmiercią komórek.
2. Wizualizacja mikrośrodowiska przy użyciu substancji wstrzykiwalnych. Szeroka gama czynników (np. przeciwciała znakowane fluorescencyjnie lub barwniki chemiczne) może być wykorzystana do znakowania różnych komponentów guza. W zależności od okresu półtrwania barwnika oraz reakcji, którą zamierzamy śledzić, substancję wstrzykiwalną można podać przed rozpoczęciem obrazowania lub podczas sesji obrazowania, drogą dożylną (i.v.) lub dosytniej (i.p., Rysunek 1).

3. Mikroskopy i oprogramowanie do obrazowania

1. Mikroskop. Do obrazowania żywych myszy można wykorzystać różne systemy mikroskopowe i oprogramowanie. Najczęściej stosowanymi systemami są mikroskopy konfokalne lub wielofotonowe. Wykorzystujemy konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem i mikrosoczewkami (Solamere Technologies, Salt Lake City, UT) z kamerą ICCD (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA).
2. Oprogramowanie do obrazowania. Używamy oprogramowania open source μManager (Vale Lab, University of California, San Francisco [UCSF]).
3. Analiza obrazu. Do analizy obrazów wykorzystujemy programy Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer) oraz ImageJ (National Institute of Health [NIH]).

4. (Przed-)Przygotowanie zwierząt do obrazowania

1. Guzy gruczołów mlekowych pachwinowych są optymalne do obrazowania zgodnie z naszym protokołem, gdy ich największa średnica mierzona suwmiarką wynosi około 8 mm lub mniej.
2. W przypadku obrazowania zwierząt leczonych inhibitorem małocząsteczkowym, przeciwciałem terapeutycznym lub lekiem chemioterapeutycznym, należy rozpocząć leczenie przed obrazowaniem lub w jego trakcie, zgodnie z wymogami eksperymentu. Na przykład obrazowanie ekstrawasacji i dystrybucji leku wymaga podania go po rozpoczęciu obrazowania (Filmy 1 i 2), natomiast obrazowanie śmierci komórek indukowanej lekiem chemioterapeutycznym doksorubicyną najlepiej przeprowadzić, rozpoczynając obrazowanie 24 hr lub później po podaniu leku (Filmy 3 i 4).

5. Przygotowanie soli fizjologicznej do utrzymania nawodnienia i osmolalności krwi zwierzęcia podczas obrazowania

1. Nabrać około 1 ml 1x PBS do strzykawki o pojemności 1 ml. Do roztworu tego można dodać jodek propidyny (PI, Invitrogen, 1 mg/ml, rozcieńczony 1:15), który będzie okresowo podawany (i.p.) podczas sesji obrazowania. Pozwoli to na obrazowanie jąder martwych lub obumierających komórek o przepuszczalnych błonach komórkowych. PI ma bardzo krótki okres półtrwania w naczyniach krwionośnych, dlatego musi być podawany wielokrotnie w trakcie sesji obrazowania.
2. Podłączyć zestaw do infuzji z wingsami (igła 23 G, długość ¾ cala, dren o długości 12 cali) do strzykawki i przetłaczać roztwór przez dren, aż kropla soli fizjologicznej pojawi się na końcówce igły na końcu drenu.
3. Zdjąć strzykawkę z zestawu do infuzji i ponownie napełnić ją odpowiednim roztworem soli fizjologicznej.
4. Ponownie podłączyć strzykawkę do zestawu do infuzji, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do linii.

6. Przygotowanie systemu znieczulenia izofluranem

1. Dolej wodę do nebulizatora i przykręć go na miejscu. Pozwoli to na nawilżenie gazów dostarczanych do zwierzęcia, co zapobiega podrażnieniu płuc i przedłuża przeżywalność zwierząt podczas długotrwałej anestezji.
2. Napełnij zbiornik z izofluranem do górnej linii. UWAGA: Izofluran jest silnym środkiem znieczulającym, który może wpływać również na badacza. Należy zapewnić odpowiednie systemy odciągu, aby nadmiar gazów był usuwany z pomieszczenia.
3. Otwórz butlę z tlenem oraz butle z azotem i wyreguluj przepływ. Przepływ azotu powinien wynosić około 1.0 L/min, natomiast przepływu tlenu około 0.2 L/min (~21%).
4. Włącz odciąg (próżnię stacjonarną). Przepływ odciągu powinien wynosić około 1.2 L/min.
5. Upewnij się, że linia anestezji do komory indukcyjnej jest otwarta, a linie prowadzące do obszaru operacyjnego i mikroskopu są zamknięte.
6. Sprawdź, czy lateksowy worek oddechowy podłączony do systemu anestezji jest nadmuchany. Jeśli worek się nie napełnia, należy go wymienić.
7. Sprawdź gumową membranę w każdym z lejków nosowych dostarczających znieczulenie do stolika mikroskopu i platformy chirurgicznej. Jeśli guma zaczyna się przecierać, należy ją wymienić.

7. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych i platformy chirurgicznej

1. Włącz sterylizator kuleczkowy i poczekaj, aż osiągnie temperaturę >200 °C.
2. Umyj narzędzia chirurgiczne w wodzie z mydłem (jedną parę pęset [najlepiej z ząbkami] i nożyczki do rozcięcia skóry zwierzęcia, jedną parę pęset [najlepiej karbowanych] i nożyczki do dalszej ekspozycji guza).
3. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne przez co najmniej 30 s za pomocą sterylizatora kuleczkowego (alternatywnie narzędzia chirurgiczne można wysterylizować wcześniej w autoklawie).
4. Pozostaw narzędzia chirurgiczne do ostygnięcia, dbając o to, aby nie zanieczyścić wysterylizowanych przyborów.
5. Przygotuj pokrywę styropianowej skrzynki transportowej. Będzie ona służyć jako platforma chirurgiczna.
6. Połóż kawałek chłonnej podkładki laboratoryjnej na wierzchu styropianowej pokrywy (w ilości wystarczającej do jej zakrycia).
7. Przymocuj do podkładki laboratoryjnej taśmą laboratoryjną (najlepiej 1") lejek nosowy z przewodem podłączonym do systemu anestezjologicznego. Wbij igłę 18 G x1½" przez taśmę w styropianową pokrywę po obu stronach lejka nosowego, aby go unieruchomić.
8. Przygotuj betadynę, jałową gazę, dwie chusteczki z 70% izopropanolem, szkiełko przedmiotowe, klej typu Krazy Glue oraz 4 kawałki taśmy laboratoryjnej (szerokość ½").

8. Przygotowanie mikroskopu

1. Włącz mikroskop, kamerę oraz komputer sterujący mikroskopem.
2. Włącz matę grzewczą.
3. W przypadku użycia mikroskopu odwróconego należy zaprojektować niestandardową wkładkę do stolika z otworami obrazującymi odpowiadającymi lokalizacji pachwinowych gruczołów mlekowych. Dokładnie umyj wkładkę do stolika wodą z mydłem i osusz. Użyj taśmy laboratoryjnej (najlepiej o szerokości ½"), aby przymocować szkiełko podstawowe (grubość #1.5) nad otworami obrazującymi, a następnie oczyść całą powierzchnię 70% izopropanolem. Przykryj stolik sterylną gazą, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Umieść wkładkę w stoliku i pozostaw do wyschnięcia.
4. Oderwij od 4 do 6 kawałków taśmy laboratoryjnej (szerokość 1"), o długości około 6 cali i przyklej je do boku mikroskopu. Kawałki taśmy te będą służyć do pozycjonowania i mocowania lejka do znieczulenia zwierzęcia.
5. Oderwij dwa kolejne kawałki taśmy (szerokość ½ cala) o długości około cala. Będą one służyć do unieruchomienia igły motylkowej podającej PBS myszy oraz szkiełka mikroskopowego używanego do odsłonięcia guza.

9. Odsłanianie gruczołu mlekowego pachwinowego do obrazowania

1. Zanurz zwierzę w narkozie w komorze indukcyjnej, stosując 4% izofluranu z 21% tlenem i azotem jako gazem nośnym (przepływ około 1,0 L/min). Powinno to zająć 2-4 min.
2. Gdy zwierzę zacznie oddychać głęboko i powoli, przenieś mysz na platformę chirurgiczną stroną brzuszną do góry. Otwórz linię znieczulającą do platformy chirurgicznej, a następnie zamknij linię znieczulającą do komory indukcyjnej — w tej kolejności, aby uniknąć zbyt wysokiego ciśnienia w systemie anestezjologicznym. W tym momencie zmniejsz stężenie izofluranu z 4% do 2,5%.
3. Sprawdź odruch cofania łapy, aby potwierdzić, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone do procedury chirurgicznej, wykonując ucisk poduszki stopy. Zwierzę jest odpowiednio znieczulone, jeśli nie reaguje (np. nie drży ani nie zwija ogona) na ucisk poduszki stopy. Jeśli zwierzę reaguje na ucisk poduszki stopy, zwiększ stężenie izofluranu.
4. Przymocuj kończyny myszy do platformy chirurgicznej za pomocą taśmy laboratoryjnej (najlepiej sprawdza się taśma ½").
5. (Opcjonalnie) Po przymocowaniu zwierzęcia do platformy chirurgicznej można usunąć sierść z powierzchni brzusznej za pomocą golarki elektrycznej. Jeśli preferowane jest chemiczne usuwanie owłosienia, należy je przeprowadzić na 24-48 h przed operacją. Usunięcie sierści przed zabiegiem pomaga zapobiec zanieczyszczeniu miejsca obrazowania, ponieważ pojedyncze włosy mogą wywołać silne i ostre reakcje immunologiczne.
6. Zdezynfekuj powierzchnię brzuszną zwierzęcia chusteczkami z 70% izopropanolem oraz betadyną.
7. Używając pierwszej pary sterylnych nożyczek i pęsety (z ząbkami), wykonaj podskórne nacięcie w linii środkowej brzucha, biegnące od około 3 mm powyżej cewki moczowej do wyrostka mieczowatego. Należy uważać, aby nie przebić ani nie przeciąć otrzewnej.
8. Używając drugiej pary sterylnych nożyczek i pęsety (karbowanej), delikatnie oddziel skórę wraz z przylegającym gruczołem piersiowym pachwinowym od jamy otrzewnej.
9. Weź szklany szkiełko przedmiotowe i przyłóż je do płata skóry utworzonego w poprzednim kroku. Ustaw szkiełko w taki sposób, aby główna część guza przylegała płasko po umieszczeniu myszy na stoliku i nie ograniczała ruchomości kończyn tylnych.
10. Po prawidłowym ustawieniu szkiełko przedmiotowe przymocuj do zewnętrznej powierzchni skóry za pomocą superglue (np., Krazy Glue).

10. Pozycjonowanie myszy na stole przedmiotowym

1. Usuń taśmę laboratoryjną mocującą kończyny zwierzęcia do platformy chirurgicznej.
2. Otwórz linię znieczulającą prowadzącą do stolika mikroskopowego, a następnie zamknij linię znieczulającą prowadzącą do platformy chirurgicznej, w tej kolejności.
3. Szybko przenieś zwierzę na stolik mikroskopowy.
4. Po przeniesieniu zwierzęcia odpowiednio ustaw i przymocuj linię znieczulającą oraz stożek nosowy (używając np. taśmy laboratoryjnej), aby upewnić się, że mysz pozostaje pod narkozą i znajduje się w wygodnej pozycji.
5. Odsłoń guz w taki sposób, aby znajdował się on na górze i w centrum jednego z portów obrazujących pokrytych szkiełkiem podstawowym w stoliku mikroskopowym.
6. Za pomocą okularów zweryfikuj, czy guz jest prawidłowo ustawiony, a następnie delikatnie przymocuj taśmą preparat szkiełka mikroskopowego. Szkiełko powinno być przymocowane luźno, aby nie utrudniać przepływu krwi do tkanki. Przymocowanie szkiełka mikroskopowego pomaga zminimalizować artefakty obrazowania wywołane oddychaniem zwierzęcia.
7. Wprowadź stały kaniulę doprzewodową do jamy otrzewnej z zestawem infuzyjnym ze skrzydełkami, podłączoną do strzykawki 1 ml zawierającej sterylny 1x PBS lub sól fizjologiczną (opcjonalnie z dodatkiem barwnika, np. PI) przygotowaną zgodnie z punktem #5. Wstrzyknij zwierzęciu 100 μl w momencie wprowadzenia linii i.p. Od tego momentu aż do końca sesji obrazowania wstrzykuj zwierzęciu 50 μl soli fizjologicznej w odstępach 1 h (lub 25 μl soli fizjologicznej z PI co 30 min).
8. Aby monitorować funkcje życiowe zwierzęcia, podłącz sondę oksymetru (np. system MouseOx firmy Starr Life Sciences, Inc.)¹⁹.
9. Przykryj mysz kocem grzewczym, aby zapobiec hipotermii.

11. Pozyskiwanie obrazów

Do akwizycji obrazów time-lapse wykorzystuje się oprogramowanie open source μManager (Vale Lab, UCSF). Surowe dane są kompilowane w oprogramowaniu Imaris (Bitplane) i mogą być oceniane ręcznie przez niezależnych obserwatorów lub analizowane w programie Imaris bądź innym oprogramowaniu do analizy obrazu (np. Volocity [PerkinElmer] lub ImageJ [NIH]).

12. Eutanazja

Po zakończeniu sesji obrazowania (1-40 h, w zależności od analizowanego rodzaju procesu), zwierzę zostaje uśmiercone.

1. Stężenie izofluranu zwiększa się do 4%.
2. Zwierzę obserwuje się do 30 s po zaprzestaniu oddychania, a następnie usuwa się je z platformy.
3. Wykonuje się zwichnięcie karku, aby upewnić się, że zwierzę zostało uśmiercone.

13. Reprezentatywne wyniki

Obrazowanie przyżyciowe z zastosowaniem tej metody umożliwia bezpośrednią wizualizację różnych procesów, w tym dostarczania leków do guzów, ekstrawazacji i dystrybucji leku po dotarciu do guza, śmierci komórek po leczeniu terapeutycznym oraz interakcji między guzami a zrąbkiem w odpowiedzi na śmierć komórek⁵. Aby zaobserwować dotarcie leku do guza oraz jego dystrybucję po ekstrawazacji do tkanek nowotworowych, iniekcję u zwierzęcia wykonuje się podczas akwizycji obrazów. Chociaż niektóre klasy chemioterapeutyków wykazują słabą fluorescencję (np. doksorubicyna), wiele z nich jej nie posiada. Dextrany sprzężone z fluoroforami mogą być wykorzystywane jako markery zastępcze dla dostarczania leków i ich dyfuzji do tkanek. Rycina 2 oraz Film 1 przedstawiają dotarcie do guza myszy MMTV-PyMT;ACTB-ECFP dextranu 2 MD sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Invitrogen, 1 mg/ml 1xPBS), podanego i.v.

Po dotarciu leku do guza można obrazować ekstrawasację i dyfuzję przez tkanki, aby określić zarówno okres półtrwania leku w naczyniach krwionośnych, jak i rozkład leku⁵. Film 2 przedstawia ekstrawasację i rozkład dekstranu 10 kD sprzężonego z Alexa Fluor-647 (Invitrogen, 1 mg/ml w 1 x PBS), wstrzykniętego i.v. myszy C3(1)-Tag;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP podczas obrazowania. Po zestawieniu filmów time-lapse w programie Imaris (Bitplane) dokonuje się ilościowego oznaczenia okresu półtrwania w naczyniach krwionośnych oraz rozkładu leku. Aby zmierzyć okres półtrwania w naczyniach krwionośnych, oblicza się średnią intensywność fluorescencji w naczyniach krwionośnych guza dla każdego punktu czasowego i nanosi ją na wykres w funkcji czasu. Rozkład leku określa się jako procent powierzchni w stosunku do całkowitej powierzchni guza, która jest pozytywna pod kątem obecności leku.

Oprócz śledzenia kinetyki dostarczania leku do guzów, często istotne jest określenie, w jaki sposób guzy reagują na terapię. Ponieważ terapie przeciwnowotworowe mają wywoływać śmierć komórek, barwienie jodkiem propidym (PI) lub strukturalne zmiany jądrowe mogą być stosowane jako marker indukowanej lekiem śmierci komórkowej⁵. Rysunek 3 przedstawia odpowiedź guza na cytotoksyczny lek chemioterapeutyczny doksorubicynę u myszy MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP. U tego potrójnego zwierzęcia transgenicznego MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP ECFP znakuje komórki raka piersi (kolor niebieski), a EGFP znakuje komórki mieloidalne (kolor zielony). Zwierzę obrazowane podczas tej sesji otrzymało doksorubicynę 18 hr przed rozpoczęciem obrazowania, a PI było podawane i.p. przez cały czas trwania sesji obrazowania, zgodnie z powyższym opisem. Komórki nowotworowe (znakowanie ACTB-ECFP) widoczne są na niebiesko, a komórki martwe lub obumierające na czerwono (barwienie PI). Przedstawiona tutaj seria czasowa pokazuje indukcję zależnej od doksorubicyny śmierci komórek w czasie. Aby ilościowo określić indukcję śmierci komórek w guzach, stosuje się ten sam typ analizy, który wykorzystano do wyznaczenia rozkładu leku, gdzie wynikiem ilościowym jest procent powierzchni dodatniej dla PI w stosunku do całkowitej powierzchni guza.

Obrazowanie przy dużym powiększeniu może dostarczyć informacji na temat rodzaju śmierci komórkowej, której ulegają komórki nowotworowe⁵. Film 3 przedstawia wyniki eksperymentu obrazowania mającego na celu śledzenie zmian w jądrach komórkowych typowych dla apoptycznej śmierci komórki w odpowiedzi na terapię systemową doksorubicyną. Aby zwizualizować jądra, zwierzę obrazowane podczas tej sesji posiada reporter ACTB-H2B-EGFP zamiast reportera c-fms-EGFP, dzięki czemu jądra komórek nowotworowych są znakowane na zielono. Zwierzęciu MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;ACTB-H2B-EGFP podano doksorubicynę (8 mg/kg w 1 x PBS) i.p. 24 h przed rozpoczęciem filmu, a następnie wykonywano godzinowe iniekcje 1 x PBS zawierającego PI (Invitrogen, roztwór 1 mg/ml rozcieńczony 1:15). Zmiany strukturalne w jądrach komórek nowotworowych można zaobserwować w komórce apoptycznej obok komórek, które uległy nekrozie (komórki PI-dodatnie wykazujące minimalne zmiany w morfologii jądra). Jądra komórek apoptycznych ostatecznie stają się czerwone z powodu pobrania barwnika PI (nie pokazano). Liczbę zdarzeń nekrotycznych i apoptycznych określa się ręcznie dla każdego punktu czasowego na podstawie dodatniości PI oraz morfologii jądra.

Śmierć komórek nowotworowych indukowana chemioterapią często prowadzi do reaktywnej rekrutacji komórek odpornościowych do guzów^2,4,5. Rycina 4 przedstawia przykład takiej odpowiedzi zrębowej na ostre leczenie doksorubicyną. Zwierzę MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP obrazowane tutaj otrzymało doksorubicynę (8 mg/kg w 1 x PBS) i.p. około 20 godzin przed rozpoczęciem obrazowania oraz otrzymywało godzinowe iniekcje PI i.p. przez cały czas trwania eksperymentu w celu wizualizacji śmierci komórek. Wskazane czasy reprezentują liczbę godzin po leczeniu doksorubicyną, a pasek skali reprezentuje 100 μm. W tym eksperymencie komórki mieloidalne infiltrują obszary śmierci komórek, co wskazują białe strzałki. Aby ilościowo określić infiltrację komórek mieloidalnych do guzów po podaniu doksorubicyny, stosuje się ten sam typ analizy, który służy do wyznaczania dystrybucji leku i odpowiedzi guza na chemioterapię, gdzie wynikiem ilościowym jest procent powierzchni w stosunku do całkowitej powierzchni guza wykazujący pozytywny sygnał dla EGFP.

Oprócz wizualizacji ogólnej odpowiedziy zrębu na chemioterapię, można również wizualizować wyspecjalizowane odpowiedziy zrębu⁵. Film 4 przedstawia fagocytozę materiału z martwiczych komórek przez komórkę sąsiednią. Widać, jak czerwony materiał jądrowy jest pochłaniany przez komórkę z dużym, nienaruszonym zielonym jądrem, co jest typowe dla makrofagów. Zwierzę MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;ACTB-H2B-EGFP obrazowane podczas tej sesji otrzymało doxorubicinę (8 mg/kg w 1 x PBS) i.p. 24 h przed rozpoczęciem filmu. Zwierzę otrzymywało godzinowe iniekcje 1 x PBS zawierającego PI (Invitrogen, roztwór 1 mg/ml rozcieńczony 1:15). Jądra komórkowe (znakowanie ACTB-EGFP) są zielone, ale zmieniają kolor na czerwony w miarę jak komórki ulegają martwicy.

Rycina 1. Przykładowe znakowanie różnych komponentów guza przy użyciu znaczników transgenicznych i wstrzykiwalnych. Jest to zwierzę potrójnie transgeniczne MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP, w którym komórki nowotworowe są znakowane na niebiesko poprzez ekspresję ECFP, a komórki mieloidalne na zielono poprzez ekspresję EGFP pod kontrolą promotora specyficznego dla linii mieloidalnej. Podczas sesji obrazowania zwierzęciu wstrzyknięto jodek propidyny (PI, czerwony, ~0.07 mg/ml w 1x PBS) w celu wizualizacji śmierci komórek. PI znakuje DNA, lecz przenika przez błony komórkowe tylko martwych lub obumierających komórek. Pasek skali = 100 μm.

Rycina 2. Przeciekanie i dystrybucja leku w guzach. W tym podwójnie transgenicznym zwierzęciu MMTV-PyMT;ACTB-ECFP, w którym komórki nowotworowe są znakowane na niebiesko poprzez ekspresję ECFP, podczas sesji obrazowania wstrzyknięto 2 MD dekstran sprzężony z FITC (zielony), aby zwizualizować, w jaki sposób leki docierają do guzów po wstrzyknięciu i.v. (niebieski). Wskazano czas od rozpoczęcia obrazowania. Pasek skali = 100 μm.

Rysunek 3. Odpowiedź komórek nowotworowych na terapię systemową. Zwierzę MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP poddane leczeniu chemioterapeutykiem doksorubicyną przed obrazowaniem, z wstrzykniętym PI (czerwony, ~0,07 mg/ml w 1x PBS) w celu znakowania śmierci komórek. Ta seria obrazów pokazuje akumulację barwienia PI w czasie (wskazaną białymi strzałkami), co reprezentuje indukcję śmierci komórek po leczeniu doksorubicyną. Podany czas to czas po leczeniu doksorubicyną. Obrazy stanowią maksymalne projekcje intensywności stosu z trzech obrazów w osi z. Pasek skali = 100 μm.

Rysunek 4. Odpowiedź komórek mieloidalnych na chemioterapię u potrójnie transgenicznej myszy MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP, której 20 h przed obrazowaniem podano doksorubicynę. Zwierzę otrzymywało godzinne wstrzyknięcia i.p. PI (czerwony, ~0,07 mg/ml w 1x PBS) w celu znakowania martwych komórek. Ta seria obrazów pokazuje akumulację komórek mieloidalnych wykazujących ekspresję EGFP (wskazanych białymi strzałkami) w czasie po leczeniu doksorubicyną. Wykazano, że ta reaktywna odpowiedź immunologiczna utrudnia odpowiedź terapeutyczną na kilka klas chemioterapii^4,5. Wskazany czas to czas po leczeniu doksorubicyną. Obrazy stanowią projekcje maksymalnej intensywności ze stosu z-stack zawierającego trzy obrazy w osi z. Pasek skali = 100 μm.

Film 1. Dostarczanie leku do guza. Jest to zwierzę podwójnie transgeniczne MMTV-PyMT;ACTB-ECFP, w którym komórki nowotworowe są znakowane na niebiesko poprzez ekspresję ECFP. Podczas sesji obrazowania zwierzęciu wstrzyknięto dekstran sprzężony z FITC o masie 2 MD (zielony), aby zwizualizować, w jaki sposób leki docierają do guzów po wstrzyknięciu i.v.. Pasek skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić film.

Film 2. Infiltracja leku do tkanki guza. Potrójnie transgeniczne zwierzę C3(1)-Tag;ACTB-ECFP;c-fms-EGFP, w którym komórki nowotworowe są znakowane na niebiesko poprzez ekspresję ECFP, a komórki mieloidalne na zielono poprzez ekspresję EGFP, otrzymało wstrzyknięcie i.v. dekstranu 10 kD sprzężonego z Alexa Fluor 647 (czerwony). Pole widzenia pokazano bezpośrednio po wstrzyknięciu dekstranu. Dekstran początkowo znakuje naczynia krwionośne, następnie szybko przenika do tkanki guza, a na koniec jest pobierany przez makrofagi. Pasek skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 3. Obrazowanie zmian jądrowych po śmierci komórkowej wywołanej chemioterapią. To zwierzę potrójnie transgeniczne MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;H2B-EGFP otrzymało wtrysk doksorubicyny przed obrazowaniem. Morfologia jądra (zielona), śledzona dzięki ekspresji białka fuzyjnego H2B-EGFP, umożliwia bezpośrednią wizualizację wywołanych chemioterapią zmian strukturalnych jądra typowych dla apoptozy, co widać w przypadku komórki w prawym górnym rogu. Zwierzę otrzymywało wstrzyknięcia PI (czerwony) drogą i.p. co pół godziny przez cały czas trwania sesji obrazowania w celu znakowania komórek martwych i obumierających. Wskazany czas to czas po leczeniu doksorubicyną +24 hr. Obrazy pozyskano przy użyciu obiektywu o dużym powiększeniu (40x, NA 1.1, soczewka wodna). Pasek skali = 15 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Film 4. Obrazowanie zmian jądrowych i wychwytu materiału z martwych komórek po śmierci komórkowej wywołanej chemioterapią. To potrójne zwierzę transgeniczne MMTV-PyMT;ACTB-ECFP;H2B-EGFP zostało wstrzyknięte doksorubicyną przed obrazowaniem. Morfologia jądra (zielony), śledzona dzięki ekspresji białka fuzyjnego H2B-EGFP, umożliwia bezpośrednią wizualizację strukturalnych zmian jądra wywołanych chemioterapią. Zwierzę otrzymywało wstrzyknięcia i.p. PI (czerwony) co pół godziny przez cały czas trwania sesji obrazowania w celu znakowania komórek martwych i obumierających. Obrazy pozyskano przy użyciu obiektywu o dużym powiększeniu (40 x, NA 1.1, soczewka wodna). Brak istotnych zmian strukturalnych przed znakowaniem PI oraz zmiana morfologii jądra i utrata sygnału GFP wskazują na śmierć komórkową o charakterze nekrozy. Widoczny jest wychwyt martwego materiału przez komórkę z dużym jądrem, co jest typowe dla makrofagów. Wskazany czas to czas po leczeniu doksorubicyną +24 hr. Pasek skali = 10 μm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Reakcje nowotworów na terapie ogólnoustrojowe in vivo mogą być dramatycznie różne od reakcji komórek nowotworowych in vitro, ponieważ mikrośrodowisko wpływa zarówno na ostrą odpowiedź, jak i nawrót⁵. Jedną z największych przeszkód w wyjaśnieniu szlaków chemooporności in vivo jest złożoność interakcji między komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskiem. W szczególności, ponieważ guzy lite rozwinęły równowagę między rakiem a komórkami zrębu, zaburzenia jednego składnika, takie jak śmierć komórki, która występuje podczas leczenia przeciwnowotworowego, mogą mieć dramatyczny wpływ na organizację tkanek.

Przedstawiona tutaj technika obrazowania przyżyciowego pozwala na bezpośrednią wizualizację interakcji komórka rakowa-zrąb w guzach żywych, znieczulonych myszy podczas leczenia lekami przeciwnowotworowymi. Używamy mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem, która ma stosunkowo ograniczoną głębokość penetracji (patrz ¹⁷), ale nasze techniki chirurgiczne i znakowania mogą być stosowane z innymi rodzajami mikroskopii. Filmy uzyskane z tych eksperymentów mogą być wykorzystane do śledzenia procesów, które obejmują zmiany intensywności fluorescencji (np. z powodu infiltracji znakowanej populacji lub indukcji śmierci komórki), ruchliwości komórek, dystrybucji zastrzyków (np. w celu śledzenia przecieku naczyniowego) i kolokalizacji sygnałów fluorescencyjnych^5,12,17,20.

Rutynowo obrazujemy myszy przez ponad 6 godzin, a także wykonujemy obrazowanie przez ponad 18 godzin. Wymaga to ciągłego utrzymywania myszy w znieczuleniu przez tak długi czas. Przy odpowiednim znieczuleniu ponad 90% naszych zwierząt przeżywa 6 godzin, a około 80% przeżywa ponad 18 godzin. Szczegóły dotyczące sposobu wykonywania długotrwałego znieczulenia zostały opublikowane wcześniej¹⁹. Z naszego doświadczenia wynika, że pięć czynników ma kluczowe znaczenie: unikanie hipotermii, unikanie odwodnienia, utrzymywanie fizjologicznego poziomu nasycenia krwi tlenem, stosowanie wilgotnego gazu nośnego dla izofluranu oraz utrzymywanie zwierząt na najniższym poziomie znieczulenia, przy którym nie wykazują oznak bólu. Aby utrzymać temperaturę ciała, trzymamy myszy pod podgrzewanym kocem (w temperaturze 38 °C). Aby uniknąć odwodnienia, wstrzykujemy małe objętości soli fizjologicznej przez cały czas trwania procedury obrazowania. Aby utrzymać fizjologiczny poziom nasycenia krwi tlenem, zaczynamy od 21% tlenu w gazie nośnym (zamiast powszechnie stosowanych 100%). Pozwala nam to zwiększyć poziom wdychanego tlenu, jeśli mysz - po kilku godzinach eksperymentu - wykaże spadek nasycenia krwi tlenem. Z naszego doświadczenia wynika, że zwiększenie poziomu wdychanego tlenu w tym czasie (np. do 30-40%) prawie zawsze ustabilizuje zwierzę, pozwalając na wielogodzinne dodatkowe obrazowanie. Optymalny poziom znieczulenia dla większości myszy osiąga się przy użyciu 1-1,5% izofluranu i skutkuje częstością oddechów 60-65/min i częstością tętna 400-450/min. W naszych eksperymentach obrazowych wykorzystujemy przede wszystkim transgeniczne modele myszy (MMTV-PyMT i C3[1]-Tag), w których guzy są wieloogniskowe, co pozwala na obrazowanie wielu zmian na różnych etapach progresji guza równolegle w wielu pozycjach x,y podczas jednej sesji obrazowania. Zmniejsza to obawy dotyczące zmienności między myszą a myszą w odniesieniu do eksperymentów mających na celu identyfikację odpowiedzi terapeutycznych zależnych od etapu i zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do obrazowania.

Model MMTV-PyMT (i inne spontaniczne modele raka) przechodzą przez postępujące stadia histopatologiczne, które można rozpoznać podczas obrazowania przyżyciowego, chociaż patologiczne stadium zmian nowotworowych, które można wykonać podczas obrazowania przyżyciowego, jest inne i mniej szczegółowe niż w przypadku odcinków histologicznych^5,17. W przeciwieństwie do tego, modele transplantacyjne mają tendencję do najlepszego odzwierciedlania guzów w późnym stadium, ponieważ komórki rakowe są zwykle izolowane z zaawansowanych guzów. Takie modele są zatem bardziej podatne na badanie interakcji guz-zrąb w późnych stadiach nowotworów niż różnic w tych interakcjach między różnymi stadiami.

Pokazujemy przykłady, jak obrazować zmiany strukturalne jądra, które zachodzą po śmierci komórki wywołanej terapią. W przypadku braku leczenia przeciwnowotworowego, ta strategia znakowania może być zamiast tego wykorzystana do obrazowania podziału komórek in situ, wyjaśniając na przykład, w jaki sposób mikrośrodowisko wpływa na proliferację i spoczynek komórek. W przyszłości znakowanie fluorescencyjne składników mitochondrialnych może umożliwić obrazowanie zmian mitochondrialnych, które zachodzą podczas apoptotycznej śmierci komórki.

W tym protokole pokazaliśmy również przykłady, jak obrazować interakcje komórka rakowa - komórka odpornościowa po terapii, ale inne elementy mikrośrodowiskowe mogą być również wizualizowane i obrazowane. Istniejące transgeniczne linie reporterowe dla składników zrębu obejmują te dla fibroblastów (np. FSP1-EGFP¹⁷, αSMA-RFP²¹, COL1A1-EGFP²¹) lub komórek układu krwionośnego (np. Tie2-GFP²²; VEGF-GFP²³).

Obrazowanie przyżyciowe pozwala na wizualizację w czasie rzeczywistym interakcji i procesów zachodzących in vivo po podaniu chemioterapii. Dzięki obecnie dostępnej technologii poczyniliśmy znaczne postępy w zrozumieniu, w jaki sposób komórki szpikowe wpływają na odpowiedź terapeutyczną; Jednak ze względu na to, że mikrośrodowisko guza jest tak złożone, nadal potrzebne są znaczne postępy, aby zacząć mechanicznie zagłębiać się w procesy leżące u podstaw oporności na leki za pośrednictwem środowiska. Jednym z najważniejszych postępów, które są nadal wymagane, jest identyfikacja lepszych markerów dla określonych populacji komórek. Znaczenie lepszych markerów jest dobrze zilustrowane przez dwa z najważniejszych składników komórek zrębu mikrośrodowiska guza piersi, fibroblasty i komórki odpornościowe. α-Aktyna mięśni gładkich (αSMA) jest często używana do identyfikacji fibroblastów, ale białko to jest również wyrażane przez komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych i komórki mioepitelialne²⁴. Tak więc, chociaż istnieją myszy reporterowe αSMA-GFP, określenie konkretnego typu komórki, która jest śledzona podczas eksperymentu obrazowania przyżyciowego, jest trudne. Podobnie, pojedynczy marker fluorescencyjny, taki jak EGFP, wyrażony pod wpływem promotora c-fms, często identyfikuje wiele subpopulacji komórek odpornościowych^12,17. Tak więc, chociaż idealnie byłoby użyć pojedynczego markera do identyfikacji określonego typu komórki, złożoność podstawowej biologii stanowi poważne wyzwanie przy stosowaniu tego podejścia.

Jednym z częściowych rozwiązań tego problemu jest użycie etykiet do wstrzykiwań w celu dalszego różnicowania subpopulacji komórek wykazujących ekspresję tego samego reportera fluorescencyjnego. Na przykład fluorescencyjne dekstrans są wychwytywane przez makrofagi i mogą być używane do znakowania subpopulacji makrofagów, które są znakowane przez transgeniczne myszy reporterowe c-fms-EGFP i Fsp1-EGFP¹⁷. Przeciwciała sprzężone z sondami fluorescencyjnymi zostały również wykorzystane do identyfikacji określonych subpopulacji (np. populacji komórek szpikowych Gr1-dodatnich znakowanych przez reporter c-fms-EGFP¹⁷).

W przeciwieństwie do krzywych odpowiedzi guza generowanych przez pomiar suwmiarkowy, które dostarczają niewiele mechanistycznych informacji o tym, jak i dlaczego guzy reagują na podane serie terapeutyczne lub histologiczne pochodzące z tkanek pobranych w różnych punktach czasowych, które wymagają dużych kohort zwierząt, nasza technika dostarcza bezpośrednich, wymiernych informacji na temat dynamiki śmierci komórek i interakcji komórek zrębu z komórkami rakowymi w małych kohortach. W związku z tym zaletą stosowania opisanej tutaj procedury jest to, że dostarcza ona dynamicznych informacji na temat odpowiedzi leków w kontekście nienaruszonego mikrośrodowiska guza w czasie rzeczywistym. Takie informacje mogą prowadzić do ważnych spostrzeżeń na temat procesów leżących u podstaw reakcji terapeutycznych⁵.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reagent
MMTV-PyMT myszy	Jackson Laboratory	2374
C3(1)-Tag myszy	Jackson Laboratory	13591
myszy ACTB-ECFP	Laboratory	3773
myszy ACTB-H2B-EGFP	Jackson Laboratory	5418
1 x PBS	Made in-house
Invitrogen	D-7137	sprzężony z fluoresceiną	Rozpuszcza się w dH2O (4 mg/ml, przechowywać w temperaturze -20 ° C); rozcieńczyć do 1 mg/ml w 1 x PBS
10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-sprzężony	Invitrogen	D-22914	Rozpuścić w dH2O (4 mg/ml, przechowywać w temperaturze -20 ° C); rozcieńczyć do 1 mg/ml w 1 x PBS
Chlorowodorek doksorubicyny	Sigma-Aldrich	44583	Rozpuścić w dH2O i przechowywać w temperaturze 4 ° C; rozcieńczyć w 1 x PBS
Isothesia (Isoflurane)	Butler Animal Health Supply	029450	250 ml
Jodek Propidium	Invitrogen	P3566	1 mg / ml; rozcieńczyć 1:15 w 1 x PBS
Tlen
azotowy
Sprzęt
18G x 1½ " igła stożkowa regularna	BD	305196
μ Kierownik	Vale Lab, UCSF	www.micro-manager.orgOprogramowanie	typu open source
Wacik nasączony alkoholem	BD	326895	Waciki z 70% alkoholu izopropylowego
System anestezjologiczny	Produkty do obrazowania molekularnego, Co.
Szkło nakrywkowe	Corning	2940-245	nr 1½, 24x50 mm; dezynfekować chusteczkami 70% izopropanolu
Ciekawostki gąbki z gazy (sterylne)	Kendall	6939
Szkiełka mikroskopowe	Corning	2948-75x25	Wstępnie oczyszczone; jeśli nie zostały wstępnie oczyszczone, zdezynfekuj chusteczkami z 70% izopropanolu
Utwardzone drobne nożyczki	Narzędzia do nauki o jakości	14090-11	2 pary; stal nierdzewna, ostre-ostre końcówki, końcówka prosta, krawędź tnąca 26 mm, długość 11 cm
Podgrzewany koc	Gaymar Industries
Sterylizator gorących koralików	Fine Science Tools	18000-45	Włącz około 30 minut przed użyciem; sterylizować narzędzia w > 200 stopni Celsjusza; C przez 30 sekund
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Krazy Glue	Elmer’ s Produkty	KG484
Taśma laboratoryjna ( ½ ")
Taśma laboratoryjna (1")
Pokrywka do styropianowej chłodnicy			Będzie to używane jako platforma chirurgiczna
kleszcze preparacyjne	Roboz	RS-5153	1x2 zęby, lekka krzywizna, 0,8 mm szerokość końcówki, długość 4"
Mikro kleszcze preparacyjne	Roboz	RS-5135	Ząbkowane, lekka krzywa, końcówka 0,8 mm Szerokość; Mikroskop o długości
			Konfokal z wirującym dyskiem, stolik piezoelektryczny XYZ, zdolność epifluourescencji17,25
Wkładka stolika mikroskopu	Stosowane oprzyrządowanie		Wykonane na zamówienie, z dwoma okrągłymi portami obrazowania
Pulsoksymetr MouseOx, oprogramowanie i czujniki	STARR Nauki przyrodnicze	www.starrlifesciences.com
Nasączki laboratoryjne Nalgene Super Versi-Dry	Thermo Scientific	74218-00	Pocięte na ćwiartki do wyłożenia platformy chirurgicznej
Nebulizator	Salter Labs	8901	Służy do nawilżania gazów; zapobiega podrażnieniom tkanek płuc
Jednorazowa strzykawka tuberkulinowa z końcówką wsuwaną (1 ml)	BD	309659
Zestaw do infuzji ze skrzydełkami Surflo	Terumo	SV-23BLK	23G x ¾ " ultra cienka igła, rurka 12"
Betadine Spray	Purdue Pharma	BASP3H