Izolacja i analiza sekwestrowanych w mózgu leukocytów myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA

Summary

Opisano metodę izolacji przylegających leukocytów zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych Plasmodium berghei ANKA. Metoda umożliwia kwantyfikację oraz charakterystykę fenotypową wyizolowanych leukocytów po barwieniu przeciwciałami fluorescencyjnymi, a następnie analizie za pomocą cytometrii przepływowej.

Abstract

Opisujemy metodę izolacji i charakterystyki przylegających komórek zapalnych z naczyń krwionośnych mózgu myszy zakażonych P. berghei ANKA. Zakażenie podatnych szczepów myszy tym szczepem pasożyta powoduje indukcję eksperymentalnej malarii mózgowej, zespołu neurologicznego, który podsumowuje pewne ważne aspekty ciężkiej malarii u ludzi za pośrednictwem Plasmodium falciparum ^1,2 . Dojrzałe formy malarii we krwi wykazują ekspresję białek pasożytniczych na powierzchni zakażonego erytrocytu, co umożliwia im wiązanie się z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych. Proces ten indukuje przeszkody w przepływie krwi, co prowadzi do niedotlenienia i krwotoków ³ , a także stymuluje rekrutację leukocytów zapalnych do miejsca sekwestracji pasożytów.

W przeciwieństwie do innych infekcji, tj. wirusów neutrotopowych^4-6, zarówno pasożytujące na malarii czerwone krwinki (pRBC), jak również związane z nimi leukocyty zapalne pozostają odizolowane w naczyniach krwionośnych, a nie infiltrują miąższ mózgu. Tak więc, aby uniknąć zanieczyszczenia sekwestrowanych leukocytów niezapalnymi komórkami krążącymi, w tej procedurze wymagana jest rozległa perfuzja wewnątrzsercowa zakażonych myszy przed ekstrakcją narządu i przetwarzaniem tkanek w celu usunięcia przedziału krwi. Po perfuzji mózgi są zbierane i preparowane na małe kawałki. Struktura tkanki jest dodatkowo zaburzona przez enzymatyczne traktowanie kolagenazą D i DNAzą I. Uzyskany homogenat mózgu jest następnie odwirowywany w gradiencie Percoll, który umożliwia oddzielenie leukocytów sekwestrowanych w mózgu (BSL) od mieliny i innych szczątków tkankowych. Wyizolowane komórki są następnie myte, liczone za pomocą hemocytometru i barwione przeciwciałami fluorescencyjnymi w celu późniejszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Ta procedura pozwala na kompleksową charakterystykę fenotypową leukocytów zapalnych migrujących do mózgu w odpowiedzi na różne bodźce, w tym udar oraz infekcje wirusowe lub pasożytnicze. Metoda ta stanowi również użyteczne narzędzie do oceny nowych metod leczenia przeciwzapalnego w przedklinicznych modelach zwierzęcych.

Protocol

1. Zakażenie myszy P. berghei-ANKA

1. Rozmrozić podwielokrotność kriokonserwowanego P. berghei ANKA pRBC.
2. Unieruchomić odporną na malarię mózgową mysz dawcę BALB/c (8-12 tygodni) za pomocą techniki krępowania oburęcznego. Wstrzyknąć myszu 100-200 μl pRBC za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml (igła 28G). Rutynowo wstrzykuje się 1-2 myszy dawców.
3. W 4-5 dniu po zakażeniu (p.i) wyjmij mysz dawcy z klatki i umieść ją na stacji roboczej lub jednorazowej podkładce roboczej.
4. Delikatnie przytrzymaj mysz za koniec ogona i za pomocą małych nożyczek odetnij końcówkę ogona (około 1 mm). Alternatywnie można wykonać małe nakłucie ogona za pomocą igły o sile 25 G.
5. Umieść kroplę krwi z żyły ogonowej myszy w pobliżu końca szkiełka mikroskopowego z matowym końcem.
6. Umieść drugi szkiełko (rozsiewacz) pod kątem 45° i włóż go z powrotem do kropli krwi. Gdy krew rozprzestrzeni się wzdłuż krawędzi, dociśnij szkiełko rozsiewacza równomiernie po szkiełku mikroskopu, aby rozmazać krew. Pozostaw rozmaz do wyschnięcia na powietrzu.
7. Utrwal rozmazy krwi w 100% metanolu przez 30 sekund, a następnie zaplamić szkiełka w świeżo przygotowanym Giemsie na 10 minut.
8. Płukać rozmaz krwi bieżącą wodą przez 1 minutę, pozostawić do wyschnięcia na powietrzu i zbadać szkiełko pod mikroskopem (100x, zanurzenie w olejku). Wylicz pRBC w obrębie 1,000 erytrocytów i oblicz procent parazytemii. Myszy dawcy powinny osiągnąć poziom parazytemii między 2,5-5%, zanim będzie można je wykrwawić z powodu zakażenia zwierząt doświadczalnych.
9. Pobrać krew od myszy dawcy przez krwawienie zaoczodołowe za pomocą heparynizowanej mikrohematokrytu rurki kapilarnej. Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z wymogami Komisji ds. Etyki Zwierząt Instytutu Waltera i Elizy Hall. W zależności od wymagań lokalnej Komisji Etyki Zwierząt mogą być stosowane inne procedury wykrwawiania. Rozpuścić wymaganą ilość krwi w pożywce RPMI w końcowym stężeniu 1X10⁶ pRBC/0,2 ml. Weź pod uwagę, że normalny hematokryt myszy to ~6x10⁹ czerwonych krwinek/1 ml.
10. Zakażone eksperymentalne myszy C57BL/6 (w wieku 8-12 tygodni) należy wstrzyknąć dootrzewnowo (i.p) 1x10⁶ pRBC/0,2 ml.
11. Aby monitorować poziom pasożyta u zakażonych myszy, wykonaj kroki 1.3-1.8. Parazytemię należy oznaczać co 2-3 dni, począwszy od 2 lub 3 dnia.
12. Początek ciężkiej malarii u myszy C57BL/6 może objawiać się zgarbionym wyglądem, marszczoną sierścią i niską aktywnością. Niektóre myszy mogą wyzdrowieć na tym etapie, ale postęp do utraty odruchu samoprostowania wskazuje na nieodwracalną chorobę i zwierzęta muszą zostać poddane eutanazji.

2. Perfuzja wewnątrzsercowa myszy i ekstrakcja mózgu

1. Zmontuj ręczny system perfuzji grawitacyjnej, mocując zbiornik o pojemności 500 ml do uchwytu kolumny przymocowanego do górnej części stojaka kolumny o średnicy 60 cm. Podłącz plastikową rurkę do dolnego końca zbiornika i zabezpiecz rurkę clamp, aby kontrolować przepływ bufora. Przymocuj rurkę do igły 23 G. Napełnij zbiornik PBS (utrzymywanym w temperaturze 22 °C), otwórz zacisk i pozwól, aby bufor przepłynął przez rurkę, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
2. Eutanazja myszy zakażonej P. berghei ANKA przez wdychanie CO₂ . Potwierdź śmierć przez brak reakcji na pedał, orbitę i oddech.
3. Przypnij uśpioną mysz tylną i przednią łapą grzbietowo do styropianowej deski preparacyjnej umieszczonej w plastikowej tacy. W zależności od wymagań lokalnej Komisji Etyki Zwierząt, znieczulenie może być podane przed rozpoczęciem pefuzji śródsercowej.
4. Przetrzyj stronę brzuszną 70% etanolem.
5. Użyj dużych nożyczek i kleszczy, aby otworzyć skórę wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić klatkę piersiową. Złóż i przypnij skórę do boków.
6. Przytrzymaj mostek cienkimi kleszczami i przetnij przeponę oraz wzdłuż obu stron mostka, przecinając żebra. Uważaj, aby nie uszkodzić żadnych dużych naczyń krwionośnych.
7. Przypnij klatkę piersiową za mostek luźno obok głowy.
8. Przytrzymaj komory cienkimi kleszkami i ostrożnie naciąć prawy przedsionek cienkimi nożyczkami.
9. Włóż igłę 23G przymocowaną do systemu perfuzji grawitacyjnej do lewej komory w kierunku aorty wstępującej podczas pracy PBS. Włożyć tylko 0,5 cm końcówki igły.
10. Używaj myszy przez 5 minut lub do momentu, gdy ścieki będą czyste.
11. Odepnij mysz i połóż ją na jej brzuchu. Przetrzyj głowę 70% etanolem.
12. Za pomocą dużych nożyczek wykonaj cięcie tuż nad obszarem szyjnego rdzenia kręgowego.
13. Użyj cienkich nożyczek, aby wykonać środkowe cięcie ogonowo-rostralne, zaczynając od podstawy czaszki i oderwij skórę, aby odsłonić czaszkę.
14. Trzymając głowę, umieść ostrza małych nożyczek w każdej jamie oczodołu i wykonaj cięcie między oczodołami.
15. Wykonaj podłużne cięcie wzdłuż szwu strzałkowego i ostrożnie oderwij czaszkę na każdej półkuli mózgu na zewnątrz.
16. Za pomocą szpatułki delikatnie podnieś mózg i umieść go w 10 ml probówce wirówkowej zawierającej pożywkę RPMI.

3. Izolacja leukocytów sekwestrowanych w mózgu (BSL)

1. Pracując w komorze bezpieczeństwa, umieść świeżo pobrany mózg na sitku do komórek ze stali nierdzewnej (rozmiar oczek 40-60) na szalce Petriego zawierającej 3-5 ml pożywki do hodowli tkankowych RPMI.
2. Pokrój tkankę mózgową na małe kawałki.
3. Przepchnij małe kawałki tkanki mózgowej przez sitko komórkowe za pomocą kryształowego tłoka.
4. Przenieść homogenat mózgu do probówki o pojemności 10 ml i wirować przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Rozpuścić osad w 3 ml pożywki RPMI, zawierającej 0,05% kolagenazy D i 2U/ml DNAzy I.
6. Obracaj mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć resztki komórek, przepychając mieszaninę przez sitko z nylonu o wielkości 70 μm i/lub inkubując na lodzie przez 5 minut.
7. Ułożyć homogenat mózgu na poduszce Percoll o pojemności 7 ml 30% i wirować przy 400 x g (bez hamulców) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
8. Zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek i inkubować na lodzie przez 5 minut w celu lizy przylegających pRBC, których nie można było usunąć z mózgu przez perfuzję wewnątrzsercową.
9. Dodać 9 ml pożywki RPMI, przemyć komórki i odwirować w temperaturze 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
10. Zawiesić osad zawierający BSL w 50-100 μl pożywki RPMI i przenieść komórki do probówki Eppendorfa.
11. Rozcieńczyć 5-10 μl podwielokrotności próbki komórki w stosunku 1:2 w błękitu trypanowym w celu identyfikacji komórek żywotnych.
12. Policz żywe komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Od 6 dnia p.i., kiedy myszy zakażone P. berghei ANKA wykazują objawy neurologiczne, można odzyskać 20 000-100 000 BSL.

4. Immunofenotypowanie BSL za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

1. Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 50 μl buforu barwiącego (PBS, 1% płodowa surowica cielęca (FCS), 2 mm EDTA).
2. Dodać 1 μl oczyszczonego przeciwciała anty-CD16/32 (Fcblock).
3. Inkubuj komórki przez 10 minut na lodzie.
4. Umyj komórki 1 ml buforu barwiącego. Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
5. Zawiesić komórki w 50 μl buforu barwiącego zawierającego z góry określone optymalne rozcieńczenia wymaganych przeciwciał fluorescencyjnych, tj. anty-CD4, anty-CD8, anty-TCR i anty-NK1.1.
6. Inkubować przez 1 godzinę na lodzie.
7. Umyj komórki 1 ml buforu barwiącego. Odwirować komórki przy 250 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant.
8. Zawieś komórki w 100 μl PBS.
9. Przenieś komórki do plastikowej rurki do cytometrii przepływowej.
10. Za pomocą cytometru przepływowego uzyskaj co najmniej 5 000-10 000 zdarzeń. W razie potrzeby należy dołączyć odpowiednie niebarwione kontrole komórkowe i próbki kompensacji fluorochromu.
11. Analizuj wyniki za pomocą odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej.

Results

Wyniki na Rys. 2 pokazują procenty i bezwzględne liczby różnych populacji BSL odzyskanych z mózgów myszy zakażonych malarią lub niezakażonych malarią i wcześniej nieleczonych. Izolowane BSL wybarwiono przeciwciałami PE-anty-NK1.1 i APC-anty-TCR-β, jak wskazano w tekście Protokołu. Zgodnie z wcześniejszymi ustaleniami ^7-9, limfocyty T αβTCR ⁺ stanowiły dużą część puli BSL w mózgach myszy zakażonych malarią z perfuzją (dzień 6 p.i.). Populacja ta wydawała się być znacznie niedostatecznie reprezentowan...

Discussion

Izolacja i analiza BSL to metoda, która umożliwia charakterystykę i kwantyfikację komórek zapalnych migrujących do mózgu w odpowiedzi na uszkodzenie tkanki lub infekcję w eksperymentalnych modelach mysich. Wprowadzenie etapu perfuzji wewnątrzsercowej w celu usunięcia przedziału krwi przed ekstrakcją narządu i późniejszą izolacją komórek jest przydatne, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek zapalnych niezapalnymi krążącymi leukocytami. Może to nie być niezbędne w przypadku zakażeń neurotropowych, takich jak wirus mysiego ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwory i
Roztwór błękitu metylenowego azur Giemsy	Merck Millipore	1.09204.0500	1:10 rozcieńczenie w wodzie destylowanej
Pożywka			Toniczność myszy
PBS			20 mM Fosforan sodu, 0,149 NaCl, pH 7,3
0,4%Trypan Blue	Sigma Aldrich	T-8154	Rozcieńczenie 1:2
Kolagenaza D	Worthington Biochemiczna
deoksyrybonukleaza (DNAse) I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	Z trzustki bydlęcej
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	30% roztwór w PBS
Ultrapure Tris	Invitrogen	15505-020
Chlorek amonu (NH4Cl)	AnalaR	10017
		do lizy krwinek czerwonych	17 mM Tris, 14 nM NH4Cl, pH 7,2
FCS	Gibco	1009
EDTA sól disodowa	Merck	10093.5V	0.1M, pH 7.2
Przeciwciała i koniugaty
Anty-mysie CD16/CD32 (blok Fc), klon 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 & l w 50 μ l bufor do barwienia (0,5 mg/50 ml)
FITC-anty-myszy CD4, klon H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-anty-mysz NK1.1, klon PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-anty-myszy CD8, klon 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-anty-myszy TCR-β, klon H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-anty-myszy CXCR3, klon 220803	R& D Systems	FAB1685P
Biotynylowany-anty-mysz CCR5, klon C34-3448	BD Pharmingen	559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
Sprzęt i materiał
Szkiełko mikroskopowe SuperFrost	Lomb Menzel-Glä ser
Kleszcze preparacyjne, nożyczki	REDA Instrumente
500 ml Zbiornik PBS	Nalgene
Rurka
igła 23G	BD PrecisionGlide	302008
Zestaw do dysocjacji komórek zawierający metalowe sito	Sigma Aldrich	CD-1
70 μ m nylonowe sitko do komórek	BD Falcon	352350
Hemocytometr	GmbH Neubauer	717810
Rurki do cytometrii przepływowej	BD Falcon	352008