Eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi

Summary

Eksperymentalne nosicielstwo ludzkiej pneumokoki oferuje naturalny model nosicielstwa i potencjalny model do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek. Technika ta jest cenna, ale złożona i wiąże się z ryzykiem klinicznym związanym z wprowadzeniem patogenu do organizmu człowieka. Opracowaliśmy szczegółowy protokół.

Abstract

Eksperymentalne nosicielstwo ludzkiej pneumokoki (EHPC) jest naukowo ważne, ponieważ nosicielstwo Streptococcus pneumoniae w nosogardzieli jest zarówno głównym źródłem transmisji, jak i warunkiem wstępnym choroby inwazyjnej. Model nosicielstwa pozwoli na dokładne określenie immunologicznych korelatów ochrony, uodparniającego efektu nosicielstwa oraz wpływu nacisku gospodarza na patogen w niszy nosowo-gardłowej. Ponadto można porównać metody wykrywania nosicielstwa przydatne w badaniach epidemiologicznych, w tym w badaniach nad szczepionkami.

Cel

Naszym celem jest opracowanie platformy EHPC, która jest bezpieczną i użyteczną powtarzalną metodą, która mogłaby być wykorzystana do selekcji kandydatów na nowe szczepionki przeciwko pneumokokom z zapobieganiem nosicielstwu jako substytut odporności indukowanej szczepionką. Będzie on pracował nad testowaniem potencjalnych szczepionek i opisami mechanizmów leżących u podstaw EHPC i ochrony poszczepiennej od nosicielstwa¹. Obecnie skoniugowane szczepionki przeciwko pneumokokom chronią dzieci przed chorobami inwazyjnymi, chociaż pilnie potrzebne są nowe szczepionki, ponieważ obecna szczepionka nie zapewnia optymalnej ochrony przed niebakteriemicznym zapaleniem płuc i istnieją dowody na zastąpienie serotypów serotypami^2-4 nieszczepionkowymi.

Metoda

Zaszczepiamy S. pneumoniae zawieszone w 100 μl soli fizjologicznej. Bezpieczeństwo jest głównym czynnikiem w rozwoju modelu EHPC i jest osiągane poprzez intensywne badania przesiewowe i monitorowanie ochotników. Komitet ds. bezpieczeństwa składający się z klinicystów i naukowców, którzy są niezależni od badania, co tydzień dostarcza obiektywnych informacji zwrotnych.

Inokulum bakteryjne jest ustandaryzowane i wymaga, aby ochotnikom nie szczepiono żadnych produktów pochodzenia zwierzęcego (pożywki roślinne i sól fizjologiczna). Dawki wymagane do kolonizacji (10,^4-10,⁵) są znacznie niższe niż te stosowane w modelach zwierzęcych (10,⁷)⁵. Wykrywanie nosicielstwa pneumokoków jest wspomagane przez dużą objętość (najlepiej >10 ml) płynu do płukania nosa, który jest stosunkowo wolny od śluzu. Protokół ten będzie po kolei zajmował się najważniejszymi częściami protokołu. Są to: (a) selekcja ochotników, (b) przygotowanie inokulum pneumokoków, (c) inokulacja, (d) obserwacja i (e) wykrywanie nosicielstwa.

Wyniki

Nasz obecny protokół był bezpieczny dla ponad 100 ochotników w różnych dawkach przy użyciu dwóch różnych serotypów bakteryjnych⁶. Obecnie prowadzone jest badanie zakresu dawek z użyciem S. pneumoniae 6B i 23F w celu określenia optymalnej dawki inokulacji dla 50% nosicielstwa. Przewidywany 50-procentowy wskaźnik nosicielstwa pozwoli modelowi EHPC na wysoką czułość skuteczności szczepionki przy małej liczbie badań.

Protocol

1. Selekcja i selekcja wolontariuszy

1. Zdrowi ochotnicy są rekrutowani za pośrednictwem plakatów reklamowych i na stronie internetowej uniwersytetu zgodnie z wytycznymi Komisji ds. Badań i Etyki NHS.
2. Kryteria uczestnictwa są następujące:
   1. Dorośli w wieku 18-60 lat.
   2. Mówi płynnie po angielsku i jest w stanie łatwo komunikować się zarówno przez telefon komórkowy, jak i wiadomości tekstowe.
3. Kryteria wykluczenia z udziału są następujące:
   1. Bliski kontakt z osobami z grupy ryzyka (dzieci, dorośli z obniżoną odpornością, osoby starsze, przewlekle chore).
   2. Obecny palacz lub znacząca historia palenia (>10 paczkolat).
   3. Astma lub inna choroba układu oddechowego.
   4. ciąża.
   5. Alergia na penicylinę lub amoksycylinę.
   6. Obecny udział w innym badaniu klinicznym, chyba że jest to badanie obserwacyjne lub nieinterwencyjne.
   7. Nie można wyrazić w pełni świadomej zgody.
4. Wstępna wizyta przesiewowa, około tygodnia przed szczepieniem, obejmuje ukierunkowany wywiad kliniczny i ukierunkowane badanie kliniczne.
5. Jeśli zostanie stwierdzona wcześniej nierozpoznana nieprawidłowość, ochotnik zostanie wykluczony z badania, a odpowiednie dochodzenie zostanie zorganizowane w ramach podstawowej opieki zdrowotnej.
6. Podczas wstępnej wizyty przesiewowej pobierana jest pełna morfologia krwi, aby upewnić się, że liczba białych krwinek mieści się w normalnym zakresie przed wizytą inokulacyjną. Płukanie nosa przeprowadza się w celu wykluczenia naturalnych nosicieli pneumokoków (patrz 6.1).
7. Przed szczepieniem ochotnicy są edukowani na temat ryzyka związanego z udziałem w badaniu i otrzymują ulotkę dla pacjenta w nagłych wypadkach, termometr cyfrowy, numery telefonów alarmowych i 3-dniową kurację amoksycyliną.

2. Przygotowanie zapasów do inokulacji

1. Przygotowanie zapasów do zaszczepiania musi odbywać się w czystym środowisku. Używane pipety powinny być używane wyłącznie do przygotowania inokulum. Wszystkie wyroby szklane i plastikowe powinny być sterylne. Zalecamy, aby zapasy do szczepień były przygotowywane w przeznaczonym do tego pomieszczeniu, przy użyciu dedykowanego dygestorium i inkubatora.
2. Szczepy pneumokokowe zaszczepia się na płytce z agarem z krwią. Płytki inkubuje się w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 przez} noc. Następnego dnia wszystkie bakterie są zeskrobywane z płytki agarowej z krwią i zaszczepiane do systemu konserwacji bulwiaków. Te naboje z kulek są używane do przygotowania wywaru do inokulacji. Przetestuj zapasy kulek pod kątem zanieczyszczenia i jednorodności kolonii przed przygotowaniem wywaru do inokulacji.
3. Aby przygotować wywar do zaszczepiania, należy zaszczepić płytkę z agarem z krwią dwoma kulkami z pożądanego bulionu serologicznego pneumokoków, tworząc smugi pokrywające całą płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 przez} noc. Wszystkie kolejne inkubacje będą wykorzystywać te same warunki. Inkubuj również pożywkę Vegitone przez noc, aby zapewnić sterylność.
4. Następnego ranka przetrzyj połowę płytki, uważając, aby nie usunąć agaru z krwią, i dodaj do 12 ml podgrzanego bulionu Vegitone. Powtórz czynność używając drugiej połowy płytki. Pozostawić dwie fiolki o pojemności 12 ml w temperaturze 37 °C na 2 godziny lub do momentu, gdy zmiana zmętnienia stanie się widoczna, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
5. Dodaj 12 ml do 40 ml podgrzanego bulionu Vegitone i dokładnie wymieszaj. Powtórzyć te czynności dla pozostałej fiolki o pojemności 12 ml. To jest punkt czasowy = 0. Usunąć 100 μl, aby odczytać gęstość optyczną (OD) przy 600 nm. Usunąć 20 μl w celu ilościowego określenia bakterii za pomocą liczby jednostek tworzących kolonie (CFU) przy użyciu odmiany metody Milesa i Misry (M&M)⁷. Inkubować obie fiolki.
   1. W przypadku M&M podziel płytkę z agarem z krwią na sześć sekcji. Dodać 180 μl sterylnego PBS do sześciu dołków 96-dołkowej płytki (U-bottom). Dodaj 20 μl bulionu do wierzchu i dobrze wymieszaj. Seryjnie rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:10 sześć razy i wyrzucić 20 μl z szóstego dołka. Umieść trzy krople o wielkości 10 μl od góry w pierwszej części płytki z agarem do krwi. Powtórz tę czynność dla pozostałych pięciu dołków. Upewnij się, że płytka jest sucha przed odwróceniem i inkubacją.
   2. Następnego dnia policz liczbę widocznych kolonii w każdej sekcji rozcieńczenia i zapisz. Korzystając z sekcji rozcieńczania z liczbą od 30 do 300, podziel liczbę widocznych kolonii przez trzy, aby uzyskać średnią.
   3. Pomnóż średnią liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie podziel przez 10 (ilość kropli 10 μl). Daje to CFU/μl.
   4. Pomnóż tę liczbę przez 1,000, aby uzyskać jtk/ml.
6. Wykonuj odczyty OD 600 i oznaczanie ilościowe bakterii metodą M&M co godzinę, aż do osiągnięcia wczesnej fazy środkowej logarytmu, OD 0,25.
7. Po osiągnięciu tego OD dodać wysterylizowany 10% glicerol do jednej fiolki i przygotować 1 ml porcji. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
8. W celu uzyskania bardziej skoncentrowanego wywaru, odwirować drugą fiolkę o stężeniu 3,345 x g przez 15 minut i usunąć supernatant. Zawiesić osad w 22,5 ml pożywki Vegitone i dodać 10% glicerolu. Przygotować 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
9. Pozostawić zapasy w temperaturze -80 °C na co najmniej 48 godzin przed rozmrożeniem i oceną ilościową.
10. Określić ilościowo zamrożony materiał bakteryjny metodą M&M. Przetestuj trzy probówki wyjściowe indywidualnie, aby zapewnić powtarzalność. Uzyskaną wartość należy wykorzystać do rozcieńczenia wywaru do pożądanego stężenia inokulum w roztworze soli, jak opisano poniżej.
11. W przypadku inokulacji ilość pneumokoków w inokulum oblicza się przed i po inokulacji. To oznaczanie ilościowe bakterii metodą M&M służy do określenia średniej liczby pneumokoków w inokulum, co odpowiada czasowi potrzebnemu do zakończenia całej procedury.
    1. Przygotować inokulum, rozcieńczając do pożądanego stężenia, i przeprowadzić oznaczanie ilościowe metodą M&M dla liczby "przed inokulacją".
    2. W naszym Ośrodku Badań Klinicznych wykonanie całej procedury inokulacji zajmuje zespołowi 30 minut. Zawiesiny pneumokokowe w soli fizjologicznej zwykle wykazują zmniejszoną liczbę w tym okresie. Aby to uwzględnić, pozostawiamy rozcieńczone inokulum w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie przeprowadzamy "poinokulacyjną" ocenę ilościową bakterii metodą M&M.
    3. Weź średnią przed i po, aby określić końcowe stężenie inokulacji. Dostosuj czas "siedzenia" zgodnie z protokołem klinicznym, ale utrzymuj odstęp tak krótki, jak to możliwe.
12. Wszystkie nowe zapasy powinny zostać wysłane do laboratorium referencyjnego w celu potwierdzenia czystości i tożsamości stada.

3. Przygotowanie inokulum

1. Przygotowanie inokulum należy rozpocząć na 30 minut przed planowanym terminem szczepienia ochotnika.
2. Wyjąć jedną z wcześniej przygotowanych probówek z zamrażarki w temperaturze -80 °C, rozmrozić ją i obracać probówkę w mikrowirówce o stężeniu 17 000 x g przez 3 minuty.
3. Ciepłe płytki z agarem z krwią w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Przygotować 96-dołkową płytkę do oznaczania ilościowego bakterii metodą M&M i przygotować probówki rozcieńczające zgodnie z pożądaną dawką.
4. Usunąć supernatant bulionowy z probówki odwirówkowej i ponownie zawiesić osad w 1 ml soli fizjologicznej. Ten krok usuwa bulion z inokulum.
5. Powtórz etap wirowania.
6. Usunąć supernatant soli fizjologicznej i ponownie zawiesić osad w 1 ml soli fizjologicznej.
7. Wykonać zestaw do rozcieńczania dla pożądanego stężenia inokulum i określić ilościowo metodą M&M.
8. Zanieś inokulum na spotkanie z ochotnikiem i po zaszczepieniu ochotników powtórz oznaczanie ilościowe w laboratorium. Oznaczyć probówkę datą i dawką inokulum i przechowywać w temperaturze -80 °C.
9. Aby zapewnić spójność od inokulacji do inokulacji, ważne jest, aby za każdym razem używać tych samych pipet i dedykowanego sprzętu laboratoryjnego.

4. Szczepienie

1. Ochotnicy powinni siedzieć wygodnie w pozycji półleżącej.
2. Za pomocą pipety P200 i sterylnych końcówek filtrujących pobrać 100 μl inokulum i wprowadzić końcówkę bezpośrednio do jamy nosowej.
3. Powoli wydal inokulum na błonę śluzową nosa okrężnymi ruchami.
4. Bardzo ważne jest, aby końcówka pipety nie stykała się z błoną śluzową nosa, ponieważ naruszenie integralności nabłonka może spowodować przedostanie się bakterii do krwiobiegu.
5. Ważne jest również, aby inokulum nie było umieszczone zbyt daleko z tyłu, ponieważ będzie spływać do gardła; powinno znajdować się w jamie nosowej.
6. Powtórz dla drugiego naris.
7. Niech ochotnik pozostanie w pozycji półleżącej przez 10 minut bez wąchania lub wydmuchiwania nosa. Daje to czas na rozproszenie się bakterii po błonie śluzowej.

5. Monitorowanie

1. Ochotnicy są monitorowani codziennie po zaszczepieniu. Obejmuje to codzienną wiadomość tekstową wysyłaną przez wolontariusza do śledczych przed godziną 14.
2. Jeśli wiadomość nie zostanie otrzymana do godziny 14, skontaktujemy się z wolontariuszem w celu zapewnienia mu dobrego samopoczucia. Jeśli wolontariusz nie odpowie, skontaktuje się z wyznaczoną mu najbliższą rodziną w celu zapewnienia dobrego samopoczucia wolontariusza.
3. Wolontariusze proszeni są o zgłaszanie wszelkich objawów ze strony górnych dróg oddechowych podczas każdej wizyty. Personel kliniczny poprosi ochotnika o opisanie jego objawów i podejmie działania następcze w przypadku wszelkich dolegliwości.
4. Antybiotyki podawane ochotnikom mogą być przyjmowane tylko w trzech okolicznościach: w przypadku, gdy chorzy są chorzy i zostali poinstruowani, aby je przyjąć przez zespół badawczy, jeśli są nosicielami pneumokoków pod koniec badania lub jeśli źle się czują i nie są w stanie skontaktować się z zespołem badawczym. Ochotnik jest zachęcany do noszenia tego pakietu ratunkowego przy sobie przez cały czas trwania badania i jest proszony o codzienne kontaktowanie się z zespołem badawczym przez następne 7 dni.
5. Nasz zespół jest dostępny 24 godziny na dobę, 7 dni w tygodniu, z pielęgniarką kontaktową w godzinach pracy i dwoma lekarzami dostępnymi poza godzinami pracy. Wszystkie zapytania są rozpatrywane telefonicznie i/lub w trybie natychmiastowym. W razie potrzeby dostępne są przepisy umożliwiające natychmiastowe, bezpośrednie przyjęcie na oddział chorób zakaźnych.

6. Procedura płukania nosa (NW)

1. Płukanie nosa (NW) wykonuje się podczas wstępnej wizyty przesiewowej, a także 48 godzin, 7 i 14 dni po szczepieniu. Zastosowana metoda NW została zaczerpnięta z Naclerio et al.⁸ Ochotnicy naturalnie skolonizowani przez S. pneumoniae są wykluczeni z inokulacji i obserwacji.
2. Ochotnik siedzi wygodnie, a głowa jest odchylona do tyłu o 30° od pionu.
3. Poproś ochotnika, aby wziął głęboki wdech i wstrzymał oddech, jednocześnie popychając język w górę i do tyłu na podniebienie. Będąc w tej pozycji, wolontariusz jest proszony o zasygnalizowanie, że jest gotowy.
4. Strzykawkę wypełnioną 20 ml soli fizjologicznej wprowadza się do przedniej przestrzeni nosowej i wydala się 5 ml soli fizjologicznej. Następnie ochotnik natychmiast pochyla się do przodu i wydala płyn, szybko wydychając powietrze przez nos do foliowej miski.
5. Powtórz tę procedurę jeszcze 3 razy, tak aby każdy naris został umyty dwukrotnie i zużyto pełne 20 ml.
6. Zebrać wszystkie próbki razem w probówce wirówkowej i wysłać do laboratorium w temperaturze pokojowej w celu przetworzenia.

7. Przetwarzanie płukania nosa

1. Odwirowywać próbki przez 10 minut przy 3,345 x g.
2. Usunąć supernatant i przechowywać w postaci 1 ml podwielokrotności w oznakowanych probówkach Eppendorfa w temperaturze -80 °C.
3. Do granulatu dodać 100 μl pożywki STGG⁹ i dokładnie wymieszać. Upewnij się, że całkowita objętość w probówce w tym momencie jest określona. Rozcieńczenie to zostanie wykorzystane do obliczenia CFU NW o dodatnim przewodzeniu.
4. Umieścić na płytce o objętości 20 μl kropli STGG zawierającej ponownie zawieszony osad na płytce z agarem z krwią zawierającej gentamycynę i pokryć ją smugami.
   1. Jeżeli NW jest po inokulacji, usunąć 10 μl z STGG zawierającego ponownie zawieszony osad i użyć do oznaczania ilościowego bakterii metodą M&M.
5. Dodaj kolejne 800 μl STGG do probówki NW i dokładnie wymieszaj.
6. Umieść 25 μl na płytce z agarem z krwią i 25 μl na płycie z agarem czekoladowym, rozsypując smugi na całej płytce.
7. Pozostałą ilość bakterii zawieszonych w pożywce STGG podzielić na 2 kriowiale i przechowywać w temperaturze -80 °C.
8. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc w 5% CO₂ .
9. Następnego dnia należy zbadać płytki pod kątem pneumokoków i innych potencjalnych patogenów układu oddechowego.
10. Pneumokoki są identyfikowane na płytkach na podstawie morfologii kolonii. Kolonie alfa hemolityczne o morfologii rysownika są hodowane na agarze z krwią za pomocą krążka optochiny i inkubowane przez noc.
11. Przypuszczalne kolonie pneumokoków, które są wrażliwe na optochinę, są barwione metodą Grama w celu potwierdzenia Gram-dodatnich diplocokoków i serotypowane przy użyciu zestawu Statens Serum Institut Pneumotest-Latex.

Results

Mamy doświadczenie w szczepieniu 159 osób, z których 35 było nosicielami pneumokoków. Najniższa dawka, jaką osiągnęliśmy przy użyciu serotypu 6B, wynosiła 11 100 CFU/100 μl na naris, najwyższa dawka to 313 000 CFU/100 μl na naris. Najniższa dawka, jaką uzyskaliśmy przy użyciu serotypu 23F, wynosiła 9 000 CFU/100 μl na naris, najwyższa dawka to 84 500 CFU/100 μl na naris.

Nasza metoda oceny nosicielstwa to płukanie nosa, wybrane, ponieważ ostatnie badanie¹⁰ wykazało, że 91% ochotników uznało płukanie nosa za wygodniejsze niż wymaz z nosogardzieli; płukanie nosa było również bardziej prawdopodobne do wykrywania patogenów za pomocą hodowli mikrobiologicznej. Flora bakteryjna odzyskana na płytkach z agarem z krwią zaszczepionymi NW może być zmienna i trudna do odczytania. Gentamycyna jest używana na pierwszej płytce agaru z krwią w celu selekcji pneumokoków. Płytka z agarem czekoladowym i druga płytka z agarem z krwią służą do wykrywania innych potencjalnych patogenów układu oddechowego, które mogą pomóc lub utrudnić kolonizację pneumokoków. Przykład płytki z agarem z krwią zaszczepionej NW, która jest łatwa do odczytania, pokazano na rysunku 1a; trudna tabliczka zawierająca wiele rodzajów flory jest pokazana na rysunku 1b.

Na każdym spotkaniu ochotnicy byli proszeni o opisanie wszelkich objawów ze strony górnych dróg oddechowych, jeśli występowały, a porównania między nosicielami i osobami niebędącymi nosicielami były podkreślane. Spośród 145 osób, które zostały niedawno zaszczepione przeciwko pneumokokom, 28 skarżyło się na objawy (Tabela 1). Ośmiu z nich było nosicielami, dwudziestu nie. Najczęstszymi objawami były niespecyficzne objawy ze strony nosa (tab. 1). Spośród przypadków, w których zgłaszano objawy ogólnoustrojowe, w tym gorączkę i/lub złe samopoczucie, żadne z podjętych badań nie wykazało dowodów na chorobę pneumokokową, a objawy były zgodne ze współistniejącą infekcją wirusową, z wyjątkiem jednego przypadku zapalenia migdałków. Dwóch ochotników z dodatnim wynikiem testu na pneumokoki leczono antybiotykami. Jedna z nich skarżyła się na ból gardła i ucha, a po spotkaniu z lekarzem prowadzącym badanie zalecono jej zapobiegawcze przyjmowanie antybiotyków. U drugiego ochotnika zdiagnozowano klinicznie zapalenie migdałków. U wszystkich ochotników objawy ustąpiły szybko.

Rysunek 1. Płytka z agarem z krwią zaszczepiona NW. Płytki agaru z krwią zaszczepione NW mogą być trudne do odczytania. 1a jest przykładem tabliczki, która jest łatwa do odczytania z wyraźnie widocznymi pneumokokami. 1b to płytka z dużą ilością współkolonizującej flory, co utrudnia wykrycie, czy obecne są pneumokoki.

Objawy   Wózek (n=32) Brak wózka (n=112) Wszystkie objawy   24% 18% Systemowe Gorączka 3 proc. 4 proc.   Złe samopoczucie* 9 proc. 4 proc. lokalny Uszy 9 proc. 3 proc.   nos 0 10%   gardło 12% 3 proc.

Tabela 1. Charakterystyka objawów zgłaszanych przez ochotników po zaszczepieniu S. pneumoniae 6B. Wszystkie skargi zostały rozpatrzone przez zewnętrzną komisję ds. bezpieczeństwa i po przeprowadzeniu pełnego dochodzenia żadne objawy nie zostały przypisane chorobie pneumokokowej. Najczęstszymi objawami były ból gardła, zatkany nos i choroba grypopodobna.

Discussion

Platforma EHPC ma szereg potencjalnych zastosowań, w tym jako model szczepionki błony śluzowej oraz jako substytut ochrony do testowania nowych szczepionek białkowych. Metoda opiera się na spójnej technice inokulacji i wysokiej jakości NW.

Odtwarzalność może być problemem w przypadku inokulum. Ze względu na zmienny charakter zamrożonych podwielokrotności bakteryjnych odtworzenie pożądanej dawki może być trudne. Uważa się, że zmniejszenie o połowę lub podwojenie pożądanej dawki mieści się w zakresie. Bardzo ważne jest, aby kwantyfikacja bakterii została przeprowadzona bezpośrednio przed i po inokulacji, w celu dokładnego określenia ilościowego stężenia bakterii na podstawie liczby CFU. Z tego powodu może być pomocne, jeśli spotkania z ochotnikami odbywają się równocześnie, tak aby trzeba było przygotować tylko jedno inokulum, a posiew kwantyfikacyjny wykonany przed i po inokulacji odbywa się w odstępie nie dłuższym niż 30 minut.

Metoda NW wymaga współpracy wolontariusza i nie byłaby idealną metodą u dzieci. Jeśli wydajność jest mniejsza niż 5 ml, procedurę można powtórzyć, używając do dodatkowych 20 ml. Noszenie protez zębowych może zmniejszyć wydajność NW. Jeśli ochotnik ma zatkany nos, a sól fizjologiczna wypływa z przodu po włożeniu, przedmuchaj nos, włóż strzykawkę nieco dalej do tyłu i w razie potrzeby odchyl głowę bardziej do tyłu.

NW to technika, która staje się lepsza wraz z praktyką. Zwykle część objętości zostanie utracona, więc celem jest zwrot co najmniej 10 ml. Jeśli ochotnik odczuwa smak soli fizjologicznej podczas NW, oznacza to, że połączenie między tylną częścią nosogardzieli a częścią ustno-gardłową nie zostało odpowiednio zamknięte przez język ochotnika. Jeśli ochotnik połknie większość soli fizjologicznej, wyjaśnij procedurę ponownie, kładąc nacisk na dociskanie języka do podniebienia. Następnie powtórz procedurę, aby zwiększyć zwróconą głośność.

Jeśli NW zawiera znaczną ilość śluzu, najlepiej usunąć go przed odwirowaniem. Spulchnij próbkę, aby poluzować wszystko, co może być związane ze śluzem, a następnie usuń jak najwięcej dużych kawałków, usuwając jak najmniej soli fizjologicznej.

Poprzednie badanie EHPC w USA zostało przeprowadzone bezpiecznie i nie wykazało żadnych zdarzeń niepożądanych¹¹. Aby zapewnić ciągłe bezpieczeństwo platformy EHPC, ustaliliśmy protokół awaryjny, który opiera się na 24-godzinnym dostępie do zespołu badawczego. Ochotnicy otrzymują dane kontaktowe, dzięki czemu mają dostęp do zespołu badawczego 24 godziny na dobę. Wszelka potrzebna opieka medyczna jest świadczona w Szpitalu Uniwersyteckim Royal Liverpool. Jako kolejny środek ochrony, komitet ds. bezpieczeństwa składający się z klinicystów i naukowców spoza grupy badawczej otrzymuje cotygodniowy raport bezpieczeństwa. Raport zawiera dawkę bakteryjną, którą otrzymał każdy ochotnik oraz informację, czy zgłoszono jakiekolwiek objawy lub chorobę. Raport ten pozwala na zewnętrzną krytykę bezpieczeństwa badania bez uprzedzeń. Komitet ds. bezpieczeństwa jest również dostępny 24 godziny na dobę w mało prawdopodobnym przypadku wystąpienia sytuacji awaryjnej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Fisher	G/0650/08
0,9% Chlorek sodu	B. Braun	3627667
Odtłuszczone mleko w proszku	Fluka	70166
Bulion sojowy tryptonowy	Becton Dickinson	211768
Glukoza	BDH	284504S
Columbia Agar z czekoladową krwią końską	Oxoid	PB0124
Pneumotest-zestaw lateksowy	Statens Serum Institut	51823