Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.
Artykuł metodologiczny
Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Shigella flexneri to bakterie chorobotwórcze, które atakują komórki gospodarza wchodząc do wakuoli endocytarnej. Następnie pęknięcie tej zamkniętej błony komory umożliwia bakteriom poruszanie się w cytozolu, namnażanie się i dalszą inwazję sąsiednich komórek. Mycobacterium tuberculosis jest fagocytozowany przez komórki odpornościowe, a ostatnio wykazano, że pęka błona fagosomalna w makrofagach. Opracowaliśmy solidny test do śledzenia przerwania błony fagosomalnej po wniknięciu Shigella flexneri lub Mycobacterium tuberculosis do komórki gospodarza. Podejście to wykorzystuje CCF4, reporter FRET wrażliwy na β-laktamazę, która równoważy się w cytozolu komórek gospodarza. Po inwazji patogenów bakteryjnych na komórki gospodarza sonda pozostaje nienaruszona tak długo, jak długo bakterie znajdują się w komorach zamkniętych w błonie. Po przerwaniu wakuoli aktywność β-laktamazy na powierzchni wewnątrzkomórkowego patogenu rozszczepia CCF4 natychmiast, prowadząc do utraty sygnału FRET i przełączenia jego widma emisyjnego. Ten solidny test ratiometryczny dostarcza dokładnych informacji o czasie pęknięcia wakuolarnego wywołanego przez atakujące bakterie i może być sprzężony z automatyczną mikroskopią i przetwarzaniem obrazu przez wyspecjalizowane algorytmy do wykrywania sygnałów emisyjnych dawcy i akceptora FRET. Co więcej, pozwala na badanie dynamiki zaburzeń wakuolarnych wywoływanych przez bakterie wewnątrzkomórkowe w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach. Wreszcie, doskonale nadaje się do wysokoprzepustowej analizy z rozdzielczością czasowo-przestrzenną przewyższającą poprzednie metody. W tym miejscu podajemy szczegóły eksperymentalne przykładowych protokołów testu pękania wakuolarnego CCF4 na komórkach HeLa i makrofagach THP-1 do eksperymentów poklatkowych lub eksperymentów z punktami końcowymi przy użyciu Shigella flexneri, a także wielu szczepów prątków, takich jak Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis i Mycobacterium tuberculosis.
Wprowadzenie
Liczne patogeny bakteryjne są internalizowane w zamkniętych błonach komór eukariotycznych podczas ich infekcji. Wnikanie do komórek następuje albo poprzez fagocytozę przez wyspecjalizowane komórki gospodarza, jak ma to miejsce w przypadku Mycobacterium tuberculosis, które są spożywane przez makrofagi, albo patogeny aktywnie indukują ich wychwyt do komórek typowo niefagocytarnych. W przypadku wychwytu indukowanego, na przykład w przypadku Shigella flexneri, patogen wstrzykuje białka efektorowe do cytozolu gospodarza, które przejmują między innymi funkcje komórkowe ściśle regulowanej maszynerii sortowania endomembranowego, powodując lokalizację bakterii w kompartmencie endosomalnym 1,2. Następnie Shigella przerywa otaczającą błonę, prowadząc do pęknięcia wakuolarnego i cytozolowego dostępu patogenu, zakłócając transport błony gospodarza i unikając dostarczania do lizosomu. Niedawno odkryto również pęknięcie fagolizosomalnego jako strategię infekcji stosowaną przez Mycobacterium tuberculosis, patogen, który przez długi czas uważano za zlokalizowany wyłącznie w komplemencie związanym z błoną 3,17.
Aby zbadać dynamikę transportu inwazyjnych patogenów przez błony subkomórkowe, osiągnięto znaczne postępy od czasu badań opartych na transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) pod koniec lat 80. 4,5. Na przykład metody oparte na mikroskopii fluorescencyjnej wykorzystujące barwniki, przeciwciała przeciwko składnikom powierzchni bakteryjnej lub markery kolokalizacji z przedziałami subkomórkowymi zajęły ponad 6,7. Jednak nadal nie zapewniają one precyzyjnej rozdzielczości czasoprzestrzennej i odporności na ilościowy pomiar pękania wakuolarnego przez patogeny bakteryjne
.Ta przeszkoda została rozwiązana za pomocą testu opartego na pochodzącym z cefalosporyny reporterze CCF4-AM FRET, który został po raz pierwszy użyty do badania ekspresji genów 8. Następnie wykorzystano go w kontekście biologii infekcji do zbadania wydzielania efektorów i śledzenia wychwytu Neisseria do komórek gospodarza 9,10,11. Opracowaliśmy test wykorzystujący ten reporter do badania pęknięcia wakuolarnego wywołanego przez Shigella flexneri 12 i Mycobacterium tuberculosis17. Zasada naszej metody jest opisana na rysunku 1 przy użyciu Shigella flexneri. Najpierw komórki gospodarza są ładowane substratem FRET CCF4-AM, który jest uwięziony w cytoplazmie po odcięciu ugrupowań estrów AM. Następnie komórki są zakażane Shigella flexneri. β-laktamaza obecna na powierzchni bakterii jest w stanie rozszczepić substrat CCF4, gdy tylko dojdzie do pęknięcia wakuolarnego. Prowadzi to do utraty sygnału FRET, przełączając pik emisji z 535 nm na 450 nm po wzbudzeniu sondy przy 405 nm. Pomiar ratiometryczny intensywności 450/535 nm podkreśla integralność wakuolarną: niskie proporcje odzwierciedlają bakterie zamknięte w błonie lub zewnątrzkomórkowe, podczas gdy wysokie współczynniki odzwierciedlają kontakt między bakteriami a cytozolem gospodarza. Informujemy również o adaptacji tej metody do badania pęknięcia fagosomalnego wywołanego przez Mycobacterium tuberculosis w makrofagach THP-1. Zasady eksperymentu pozostają takie same, chociaż sekwencja jest odwrócona, ładowanie CCF4-AM jest stosowane dopiero po infekcji bakteryjnej.
Tak więc, dzięki ilościowym pomiarom fluorescencji ratiometrycznej na poziomie pojedynczej komórki, pęknięcie wakuolarne Shigella flexneri może być śledzone w czasie rzeczywistym i w ustalonych próbkach z różnych typów komórek 12,13,14. Ponadto metoda ta może być dostosowana do wielu innych inwazyjnych patogenów, jak wykazano w tym badaniu z użyciem Mycobacterium bovis i Mycobacterium tuberculosis. Wreszcie, miniaturyzacja naszego protokołu do formatów 96 dołków (lub 384 dołków) umożliwia badanie przesiewowe wielu warunków przy wysokiej przepustowości.
Protokół
Test działa w różnych formatach, jednak zalecamy zmniejszenie objętości próbki, aby zaoszczędzić odczynniki, szczególnie CCF4-AM. Dlatego następujący protokół opisano dla utrwalonych komórek HeLa lub komórek podobnych do makrofagów THP-1 w formacie 96 dołków, a następnie dla żywych komórek HeLa w 35-milimetrowych szklanych naczyniach dennych. Test można dostosować do innych patogenów. Oprócz zakażenia Shigella opisujemy test na fagocytozę THP-1 różnych szczepówkobakterii.
Ważne, po załadowaniu CCF4-AM, wszystkie odczynniki i, w tym myjące, wymagają obecności probenecydu na poziomie 1 mM. Probenecyd jest inhibitorem kanału anionowego, który wspomaga cytozolowe zatrzymywanie CCF4 na wszystkich etapach protokołu. Utrwalone próbki należy pobrać w ciągu kilku godzin po eksperymencie, ponieważ sygnał CCF4 nie jest stabilny przez długi czas.
1. Test CCF4 na utrwalonych próbkach przy użyciu Shigella flexneri (płytki 96-dołkowe)
- Przygotowanie bakterii do hodowli nocnych. Zaszczepić wstępne kultury bakteryjne szczepów typu dzikiego (M90T AfaI) i zmutowanych (BS176 AfaI) 1 dzień przed zakażeniem w 8 ml bulionu sojowego z kazeiną tryptyczną (TCSB) uzupełnionego ampicyliną (50 μg/ml) w shakerze w temperaturze 37 °C przez noc.
- Posiewanie komórek do infekcji. Nasiona komórek HeLa w 96 dołkach 1 dzień przed zakażeniem w gęstości 5 x 103 komórki na studzienkę w DMEM zawierające 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 1% penicyliny-streptomycyny w inkubatorze 5% CO2 w końcowej objętości 100 μl. W przypadku komórek podobnych do makrofagów THP-1 posiewanie komórek wykonuje się 2 dni przed zakażeniem w gęstości 5 x 104 komórek/dołek i inkubuje się je z 30 nM octanem mirystynianu forbolu (PMA) w RPMI zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 1% penicyliny-streptomycyny i 0,05 mM 2-merkaptoetanolu.
- Przygotowanie bakterii do subkultury. Zaszczepić nocne kultury bakterii w rozcieńczeniu 1/100 w TCSB uzupełnionym 50 μg/ml ampicyliny w wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez 2,5 godziny (OD600 = 0,3 do 0,4).
- Ładowanie komórek za pomocą CCF4-AM. Przygotować mieszaninę ładującą CCF4-AM na końcową objętość 25 μl na studzienkę, zawierającą 1 mM probenecydu (Sigma), 1,5 μM CCF4-AM (6 μM w przypadku THP-1) i 1,25 μl roztworu ładującego B (100 mg/ml środka powierzchniowo czynnego Pluronic-F127 w DMSO/0,1% kwasu octowego dostarczonego wraz z zestawem ładującym CCF4-AM LiveBlazer firmy Invitrogen) w buforze EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM glukozy, 25 mM HEPES przy pH 7,3). Umyj komórki raz PBS i dodaj 25 μl mieszanki ładującej CCF4-AM na dołek w temperaturze pokojowej w ciemności przez 2,5 godziny.
- Przygotowanie bakterii do infekcji. Wirować 1 ml subkultur bakteryjnych z prędkością 9 000 obr./min przez 1 min. Przemyć raz 500 μl PBS, wirować z prędkością 9 000 obr./min przez 1 minutę i ponownie zawiesić w 500 μl PBS uzupełnionym 10 μg/ml poli-L-lizyny (Sigma) i 40 μg/ml β-laktamazy (Sigma). Po 10 minutach inkubacji na obracającym się kole w temperaturze pokojowej przemyć raz 500 μl PBS i ponownie zawiesić bakterie w 500 μl buforu EM/1 mM probenecydu.
- Infekcja komórkowa i utrwalenie. Przemyć komórki raz 150 μl PBS/1 mM probenecydu, przygotować mieszaninę 10 μl bakterii zawieszonych w końcowej objętości 100 μl buforu EM/1 mM probenecydu i rozprowadzić ją do każdej studzienki. Po 15 minutach inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej, przestawić płytkę na 37 °C na 1 godzinę (90 minut w przypadku THP-1), przemyć 150 μl PBS/1 mM probenecydu i utrwalić 50 μl paraformaldehydu 4%/1 mM probenecydu przez 10 minut w ciemności. Następnie przemyć 150 μl PBS/1 mM probenecydu, inkubować przez 30 minut z 30 μl 10 μM jądra barwnika Draq5 (Biostatus), przemyć 150 μl PBS/1 mM probenecydu i pozostawić próbki w 100 μl PBS/1 mM probenecydu.
- Ustawienia akwizycji utrwalonych próbek. Akwizycja odbywa się za pomocą (i) odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem pneumatycznym N-Plan o powiększeniu 20x (0,5 apertury numerycznej (NA), odległości roboczej 2,1 (WD)) lub 40x (0,75 NA, 0,72 WD) lub (ii) mikroskopie konfokalnym z obiektywem 10x. Obrazowanie fluorescencyjne odbywa się ze wzbudzeniem przy 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) i emisją wykrywaną przez filtry 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) i 535 nm (Semrock, FF01-520/35-25) przy czasach naświetlania 5 ms (światło przechodzące), 1 000 ms (535 nm) i 500 ms (450 nm). Obrazowanie konfokalne wykonuje się przy następujących czasach naświetlania: 240 ms (450 nm) i 360 ms (535 nm) dla lasera 405 nm (870 μW), 640 ms (Draq5) dla lasera 640 nm (2560 μW).
- Analiza po przejęciu. Następnie obrazy są analizowane przez algorytm komputerowy, który umożliwia automatyczną ocenę sygnału fluorescencji dla każdej pojedynczej komórki. Oprogramowanie takie jak Metamorph 7.1 lub Acapella może być wykorzystane do stworzenia skryptu do pomiaru stosunku między sygnałami emisji 450 nm i 535 nm (dostępny na życzenie). Warto zauważyć, że zastosowanie urządzenia do kalibracji ostrości sprzężonego z mikroskopią automatyczną podczas akwizycji pozwala na uzyskanie dziesiątek różnych pozycji w wielu dołkach w tym samym czasie.
2. Test CCF4 na żywych próbkach przy użyciu Shigella flexneri (format szklanego dna 35 mm, MatTek)
- Przygotowanie bakterii do hodowli nocnych. Postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem.
- Posiewanie komórek do infekcji. Umieść komórki HeLa w 35-milimetrowych szklanych szalkach hodowlanych (MatTek 10 mm Microwell, korporacja MatTek) 1 dzień przed infekcją w gęstości 2 x 105 komórek/szalkę w końcowej objętości 2 ml.
- Przygotowanie bakterii do subkultury. Postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem.
- Ładowanie komórek za pomocą CCF4-AM. Przygotować mieszankę ładującą CCF-AM zgodnie z wcześniejszym opisem dla końcowej objętości 2 ml na naczynie. Przed załadowaniem umyj ogniwa raz za pomocą PBS.
- Przygotowanie bakterii do infekcji. Postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem.
- Ustawienia akwizycji żywych próbek. Akwizycja odbywa się przez 60 minut co 90 sekund za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego przy użyciu obiektywu powietrznego N-Plan o powiększeniu 20x (0,5 NA, 2,1 WD) lub 40x (0,75 NA, 0,72 WD) w komorze grzewczej o temperaturze 37 °C. Obrazowanie fluorescencyjne wykonuje się ze wzbudzeniem przy długości fali 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) i emisją wykrywaną przez filtry 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) i 535 nm (Semrock, FF01-520/35-25) przy czasach naświetlania 5 ms (światło przechodzące), 200 ms (535 nm) i 100 ms (450 nm).
- Zakażenie komórek i pozyskiwanie żywca. Umyć komórki raz 2 ml PBS/1 mM probenecydu, dodać 2 ml probenecydu EM/1 mM, zamontować naczynie na stoliku mikroskopu i rozpocząć akwizycję. Po 6 minutach (punkt czasowy 4) wstrzymaj akwizycję, dodaj 250 μl rekompozycji bakterii na wierzch komórek i wznów akwizycję.
- Analiza po przejęciu. Filmy można wizualizować za pomocą Metamorph lub ImageJ. Współczynniki intensywności 450/535 nm dla każdej pojedynczej komórki można uzyskać za pomocą ImageJ. Jak wspomniano wcześniej, użycie urządzenia do kalibracji ostrości sprzężonego z mikroskopią automatyczną podczas akwizycji pozwala na uzyskanie wielu różnych pozycji w zależności od filmu poklatkowego.
3. Test CCF4 na stałych próbkach przy użyciu prątków (format 96 dołków)
- Przygotowanie bakterii. Szczepy prątków należy hodować do środkowej fazy logarytmicznej w 7H9 zawierających albuminowo-dekstrozę katalazę (ADC) w temperaturze 30 °C (dla Mycobacterium marinum) lub 37 °C (dla Mycobacterium bovis BCG i Mycobacterium tuberculosis).
- Posiewanie komórek do infekcji. Makrofagi THP-1 na płytce 2 dni przed zakażeniem, inkubując je z 30 nM PMA w RPMI zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 1% penicyliny-streptomycyny i 0,05 mM 2-merkaptoetanolu w inkubatorze 5% CO2 w końcowej objętości 100 μl przy gęstości 5 x 104 komórki / studzienkę.
- Przygotowanie bakterii do infekcji. Zebrać kultury, umyć i ponownie zawiesić za pomocą PBS przed sonikacją i filtracją przez strzykawkę, aby uniknąć zbrylania. Oznaczyć stężenie każdego szczepu za pomocą pomiaru OD600 i zainfekować komórki THP-1 przy MOI 1:1 w temperaturze 30 °C (dla Mycobacterium marinum) lub 37 °C (dla Mycobacterium bovis BCG i Mycobacterium tuberculosis) w pożywce RPMI z 5% CO2. Po 2 godzinach usunąć pożywkę, przemyć 3 razy PBS i dodać kompletną świeżą pożywkę na 1 do 2 dni (w przypadku Mycobacterium marinum) lub 3 do 7 dni (w przypadku Mycobacterium bovis BCG i Mycobacterium tuberculosis).
- Ładowanie komórek za pomocą CCF4-AM i mocowanie. Przemyć komórki raz PBS i przygotować mieszaninę ładującą CCF4-AM zgodnie z wcześniejszym opisem dla końcowej objętości 25 μl na studzienkę, stosując końcowe stężenie CCF4-AM wynoszące 6 μM. Ładowanie odbywa się w temperaturze pokojowej w ciemności przez 2 godziny przed myciem 150 μl PBS/1 mM probenecydu i utrwalaniem przy użyciu 50 μl paraformaldehydu w stężeniu 4% uzupełnionego 1 mM probenecydu przez 30 minut w ciemności. Następnie przemyć 150 μl PBS/1 mM probenecydu i pozostawić próbki w 100 μl PBS/1 mM probenecydu.
- Ustawienia akwizycji i analiza po przejęciu. Postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem w pierwszym akapicie, używając Shigella flexneri.
Protokół uzupełniający
Testy fluorymetryczne są wykonywane w celu sprawdzenia aktywności β-laktamazy na powierzchni bakterii. Należy to zrobić dla każdego szczepu bakteryjnego przeznaczonego do użycia w opisanym teście. W tym celu umyte bakterie kontaktuje się ze 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 μg/ml ekstraktów z wątroby esterazy świńskiej (sigma) w 1 ml PBS przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ciemności. Laktamaza rozpuszczalna 1 mg/ml (Invitrogen) może być stosowana jako kontrola pozytywna. Następnie wykonywany jest skan emisyjny przy wzbudzeniu 405 nm za pomocą fluorymetru PTI Quantamaster i kuwety kwarcowej o pojemności 1 ml. Utrata FRET przy 535 nm i pojawienie się wysokiego piku 450 nm są wizualizowane po dodaniu bakterii do sondy CCF4.
Wyniki
Podejście z wykorzystaniem CCF4-AM/β-laktamazy jest niezawodną i czułą metodą śledzenia pękania wakuol patogenów wewnątrzkomórkowych, takich jak Shigella flexneri (Rycina 1). Szczepy Shigella użyte w niniejszym badaniu nazwano M90T AfaI oraz BS176 AfaI. M90T AfaI to szczep Shigella flexneri, który wykazuje ekspresję adhezyny AfaE, zdolnej do wydajnego wiązania CD55 na powierzchni komórek nabłonkowych 15. W związku z tym szczepy wykazujące ekspresję AfaE posiadają znacznie wyższe zdolności inwazyjne w komórkach nabłonkowych w porównaniu ze szczepem dzikim M90T. BS176 AfaI jest mutantem szczepu Shigella flexneri wykazującym ekspresję AfaE, pozbawionym plazmidu wirulencji Shigella. Szczep ten nie jest w stanie zainfekować komórek HeLa. Niemniej jednak szczep ten może wnikać do komórek THP-1, ponieważ pobieranie w tej linii komórkowej opiera się wyłącznie na klasycznej fagocytozie i nie wymaga funkcjonalnego systemu sekrecji typu 3. Oba szczepy wykazują ekspresję β-laktamazy i przejawiają aktywność β-laktamazy na swojej powierzchni ze względu na obecność plazmidu kodującego AfaE. Po 1 h infekcji komórek HeLa nieinwazyjnym szczepem BS176 AfaI sonda FRET CCF4 pozostaje nienaruszona, co widać na Rycynie 2A jako sygnał zielony (535 nm). Przeciwnie, infekcja wirulentnym szczepem M90T AfaI przez 1 h prowadzi do zmiany sygnału na niebieski (450 nm), co wskazuje na rozszczepienie sondy w cytozolu. Aby to ilościowo określić, opracowaliśmy skrypt dla oprogramowania Metamorph i Acapella, który umożliwia zautomatyzowaną detekcję komórek oraz pomiar intensywności w kanałach 535 i 450 nm w celu wyznaczenia sygnału ratiometrycznego. Jak pokazano na Rycynie 2B, jądra i cytozol komórek są segmentowane z wykorzystaniem kanału Draq5. Następnie algorytm jest w stanie wykryć populacje komórek dodatnich dla 450 nm i 535 nm, aby obliczyć stosunki między dwiema intensywnościami dla każdej pojedynczej komórki, co przedstawiono w formie histogramu na Rycynie 2C. Dla szczepu mutanta uzyskano niskie stosunki, natomiast dla szczepu wirulentnego stosunki były wysokie. Choć ten reprezentatywny eksperyment infekcyjny przeprowadzono z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej, mikroskopia epifluorescencyjna również nadaje się do tego zadania. Ryciny 3 i 4 przedstawiają przykłady z wykorzystaniem dwóch różnych typów ludzkich komórek: komórek nabłonkowych HeLa i komórek podobnych do makrofagów THP-1. Po infekcji wirulentnym szczepem Shigella M90T AfaI przez 1 h i 90 min w przypadku komórek HeLa i THP-1, obserwuje się zmianę sygnału z zielonego (535 nm) na niebieski (450 nm) w porównaniu z komórkami zainfekowanymi BS176 AfaI (Ryciny 3A i 4A). Skrypt opracowany w oprogramowaniu MetaMorph bezpośrednio wykrywa populację komórek dodatnich dla CCF4 i oblicza stosunek intensywności w kanałach 450 i 535 nm dla każdej pojedynczej komórki. Następnie komórki są klasyfikowane w zależności od ich stosunku przy użyciu makra opracowanego w programie Excel, co pozwala na uzyskanie histogramów pokazujących rozkład komórek. Podobnie jak w przypadku drugiego skryptu opracowanego dla Acapella, komórki zainfekowane BS176 AfaI charakteryzują się niskimi stosunkami, podczas gdy komórki zainfekowane M90T AfaI wykazują wysokie stosunki przy użyciu algorytmu MetaMorph w komórkach HeLa i makrofagach THP-1 (Ryciny 3B i 4B). Na koniec, na Rycynie 5 przedstawiono adaptację tej metody do badania prątków. Mycobacterium bovis BCG przebywa w fagosomie przez cały przebieg eksperymentu, co odzwierciedla silny sygnał 535 nm wykrywany w całym czasie trwania badania. W przeciwieństwie do niego, Mycobacterium tuberculosis wywołuje pękanie błony fagosomalnej w makrofagach THP-1 po ponad 3 dniach infekcji, co podkreśla sygnał 450 nm w 7. dniu infekcji (Rycina 5A i 5B). Stosując ten sam algorytm, co w przypadku badania pękania wakuol przez Shigella, stwierdzono, że komórki zainfekowane Mycobacterium tuberculosis wykazują wyższe stosunki 450/535 nm niż komórki zainfekowane Mycobacterium bovis BCG po 7 dniach infekcji (Ryciny 5C i 5D).
Rycina 1. Schemat przedstawiający zasadę działania testu CCF4-AM/β-laktamaza do monitorowania pękania wakuoli Shigella flexneri. CCF4-AM swobodnie dyfunduje przez błonę komórkową do cytoplazmy, gdzie grupy estrowe są odcinane przez esterazy cytozolowe, co prowadzi do powstania anionów CCF4. Reakcja ta zapobiega przedostawaniu się CCF4 do jakichkolwiek przedziałów błoniastych. Na tym etapie CCF4 wywołuje sygnał FRET przy 535 nm po wzbudzeniu przy 405 nm. Sonda pozostaje nienaruszona do momentu, gdy bakterie wykazujące ekspresję β-laktamazy doprowadzą do pęknięcia wakuoli endocytycznej. Wówczas sygnał FRET zanika, ponieważ CCF4 zostaje rozszczepione przez β-laktamazę, co powoduje zmianę emisji z 535 nm na 450 nm po wzbudzeniu przy 405 nm.
Rycina 2. Śledzenie pękania wakuol Shigella flexneri za pomocą mikroskopii konfokalnej. (A) Po 2 h 30 min ładowania CCF4-AM, komórki HeLa są infekowane szczepem mutantem Shigella flexneri BS176 AfaI wykazującym ekspresję β-laktamazy lub zjadliwym szczepem M90T AfaI przez 1 h, a następnie utrwalane 4% paraformaldehydem przez 10 min. Następnie jądra są barwione Draq5, a komórki obrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 10x. Wybrano reprezentatywne zdjęcia z następującymi połączonymi kanałami: nienaruszona sonda CCF4 pojawia się przy 535 nm (zielony), a rozszczepiona sonda CCF4 pojawia się przy 450 nm (niebieski). (B) Przykłady zdjęć przedstawiające system detekcji naszego automatycznego algorytmu w oprogramowaniu Acapella. Segmentację komórek (jądra+cytozol) uzyskano za pomocą kanału Draq5. Komórki dodatnie pod kątem CCF4 uzyskano poprzez połączenie kanałów 450 i 535 nm. (C) Histogram pokazujący wynik naszej automatycznej analizy w programie Acapella z zastosowaniem szczepu mutantem Shigella flexneri BS176 AfaI lub zjadliwego szczepu M90T AfaI. Średni stosunek reprezentuje stosunek intensywności w kanałach 450 i 535 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.
Rysunek 3. Śledzenie pękania wakuol Shigella flexneri w komórkach HeLa przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. (A) Po 2 godz. 30 min obciążania CCF4-AM, komórki HeLa są zakażane szczepem mutantem Shigella flexneri BS176 AfaI wykazującym ekspresję β-laktamazy lub wirulentnym szczepem M90T AfaI przez 1 godz., a następnie utrwalane 4% paraformaldehydem przez 10 min. Następnie komórki są obrazowane za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem 20x. Wybrano reprezentatywne zdjęcia w następujących kanałach: nienaruszona sonda CCF4 535 nm (zielony) i rozszczepiona sonda CCF4 450 nm (niebieski). (B) Histogram przedstawiający wynik zautomatyzowanej analizy w oprogramowaniu MetaMorph. Pojedyncze komórki są rozłożone w funkcji stosunku intensywności w kanałach 450 i 535 nm.
Rycina 4. Monitorowanie pękania wakuol Shigella flexneri w komórkach THP-1 przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. (A) Po 2 h 30 min ładowania CCF4-AM komórki THP-1 są zakażane szczepem mutantem Shigella flexneri BS176 AfaI wykazującym ekspresję β-laktamazy lub wirulentnym szczepem M90T AfaI przez 1 h 30 min, a następnie utrwalane 4% paraformaldehydem przez 10 min. Następnie obrazy komórek są rejestrowane przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem 20x. Wybrano reprezentatywne zdjęcia w następujących kanałach: nienaruszona sonda CCF4 535 nm (zielony) oraz rozszczepiona sonda CCF4 450 nm (niebieski). (B) Histogram przedstawiający wynik zautomatyzowanej analizy przeprowadzonej za pomocą oprogramowania MetaMorph. Poszczególne komórki są rozłożone w funkcji stosunku intensywności w kanałach 450 i 535 nm.
Rysunek 5. Monitorowanie pękania fagosomów Mycobacterium bovis BCG i Mycobacterium tuberculosis w makrofagach THP-1 przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej. (A,B) Komórki THP-1 zostały zainfekowane ekspresującym β-laktamazę Mycobacterium bovis BCG lub Mycobacterium tuberculosis przez 2 hr i hodowane od 3 do 7 dni. Po przemyciu komórki inkubowano z CCF-4-AM przez 2 hr i utrwalono 4% paraformaldehydem przez 30 min przed obrazowaniem za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z obiektywem 40x. Wybrano reprezentatywne zdjęcia w następujących kanałach: nienaruszona sonda CCF4, 535 nm (zielony); rozszczepiona sonda CCF4, 450 nm (niebieski). (C,D) Histogramy przedstawiające wynik analizy automatycznej przeprowadzonej przy użyciu oprogramowania MetaMorph. Poszczególne komórki są rozłożone w funkcji stosunku intensywności w kanałach 450 i 535 nm.
Dyskusja
Test CCF4-AM/β-laktamazy jest prostą metodą śledzenia zaburzeń wakuolarnych wywołanych przez wewnątrzkomórkowe Shigella flexneri i prątki w różnych typach komórek. Wykorzystuje wrażliwy na laktamazę cytoplazmatyczny reporter FRET, który jest rozszczepiany przez enzym aktywny na powierzchni bakterii.
Utraty substratu CCF4-AM można łatwo uniknąć, dodając probenecyd do wszystkich roztworów po załadowaniu substratu. Jak wykazano, test można dostosować do wielu typów komórek (komórki nabłonkowe, komórki fagocytarne) i formatów (96 dołków, 35-milimetrowe szklane płytki, płytki 6/12/24-dołkowe). W przypadku użycia płytki 6/12/24 dołka, sterylne szkiełka nakrywkowe są rozprowadzane na dnie każdej studzienki przed wysiewem komórek. Pod koniec eksperymentu szkiełka nakrywkowe są przenoszone na szkiełka w medium montażowym, takim jak odczynnik Prolong Gold Antifade (Invitrogen). W ten sposób sygnał jest stabilny przez dłuższy czas po oznaczeniu w porównaniu z formatem 96 dołków, w którym próbki są przechowywane w PBS po utrwaleniu. Przed określeniem objętości próbki należy wziąć pod uwagę wysoki koszt substratu CCF4-AM. Dlatego zalecamy ich skalowanie w dół. Eksperymenty są droższe w formacie 6/12/24, ale sygnały są stabilne przez kilka dni. Wręcz przeciwnie, eksperymenty są tańsze w formacie 96 dołków, ale próbki muszą być analizowane w dniu eksperymentu. Warto zauważyć, że eksperymenty na żywo mogą być również przeprowadzane w formacie 96 dołków lub 384 dołków. Pozwala to na przeprowadzanie eksperymentu na żywo przy użyciu kilkudziesięciu warunków jednocześnie (zmutowane bakterie, MOI, transfekcja plazmidu lub siRNA, chemikalia itp.) z liczbą pozycji na studzienkę. Chociaż nadaje się do Shigella flexneri, podkreślamy, że "prawdziwe" eksperymenty w czasie rzeczywistym lub poklatkowe nie są wykonalne w badaniach prątków, ponieważ cykl infekcji przekracza mierzalne stężenia CCF4, które mogą zostać zatrzymane w cytozolu. Z tego powodu substrat CCF4-AM nakłada się na komórki dopiero po osiągnięciu inwazji.
W przypadku, gdy do akwizycji i analizy wykorzystywane jest oprogramowanie MetaMorph, zalecamy skorzystanie z modułu "akwizycja ekranu", który pozwala na pobranie całej płytki dołka 96/384 z określoną liczbą zdjęć na dołek. Co więcej, moduł "review screen data" pozwala (i) na wizualizację zszytej mozaiki obrazu każdej studni dla dowolnego kanału w tym samym czasie na dużym "plakacie" oraz (ii) zapętlenie specjalistycznego algorytmu do pomiaru intensywności w kanałach 535 i 450 nm. Mimo że udało nam się zmierzyć pęknięcie wakuolarne przez pojedyncze bakterie za pomocą mikroskopii poklatkowej, chcielibyśmy ostrzec, że aktywność enzymatyczna na powierzchni poszczególnych bakterii jest różna, co utrudnia precyzyjne skorelowanie liczby bakterii wewnątrzkomórkowych ze skutecznością pęknięcia wakuolarnego.
Biorąc pod uwagę solidność testu, nadaje się on do podejść o wysokiej przepustowości w formatach 96 lub 384 dołków. Udało nam się również dostosować ten protokół do analizy FACS w celu zbadania infekcji komórek w zawiesinie 16. Test może być również stosowany do badania innych bakterii lub nośników prezentujących laktamazę na swojej powierzchni, co prowadzi do szerokiego zakresu zastosowań. Na przykład podejście to można wykorzystać do badania pęknięcia wakuolarnego wywołanego przez inne patogeny, takie jak β-laktamaza eksprymująca Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes lub Salmonella typhimurium 12. Ponieważ Listeria monocytogenes ma krótki cykl infekcji porównywalny do Shigella flexneri, możliwe są eksperymenty poklatkowe. Z drugiej strony, ponieważ Legionella pneumophila i Salmonella typhimurium wykazują długie cykle infekcji, sugerujemy przeprowadzenie eksperymentów w punktach końcowych.
Różnorodność możliwych zastosowań sprawia, że test CCF4-AM/β-laktamazy jest interesującą metodą fluorometryczną do śledzenia pęknięcia wakuolarnego wywołanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe w ustalonych próbkach lub w czasie rzeczywistym.
Oświadczenia
Nie mamy nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Agence Nationale pour la Recherche oraz przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Chronić przed światłem, w magazynie - 80 stopni / podwielokrotności |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lizyna | Sigma | P9155 | |
| μ CLEAR-PLATE,, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm naczynia ze szklanym dnem | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecyd | Sigma | P8761 | |
| β-laktamaza | Sigma | P0389 |
Bibliografia
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271(2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507(2012).
Przedruki i uprawnienia
