Artykuł metodologiczny

Elektroporacja tyłomózgowia w celu śledzenia trajektorii aksonów i celów synaptycznych w zarodku pisklęcia

DOI:

10.3791/50136

⸱

29 maja 2013

 ,  ,  , 
1Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Medical Neurobiology, The Hebrew University of Jerusalem

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak sieci neuronowe są tworzone w embrionalnym mózgu, jest fundamentalnym pytaniem w neurobiologii rozwojowej. Połączyliśmy technikę elektroporacji z nowatorskimi narzędziami genetycznymi, takimi jak plazmidy Cre/Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac w tyłomózgowiu ptaków, aby oznaczyć interneurony grzbietowe i śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne na różnych etapach rozwoju.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja embrionalnej cewy nerwowej piskląt ma wiele zalet, takich jak szybkość i skuteczność ekspresji obcych genów w komórkach neuronalnych. W tym manuskrypcie przedstawiamy metodę, która w unikalny sposób pokazuje, jak elektrorazować DNA do ptasiego tyłomózgowia w E2.75 w celu specyficznego oznakowania podzbioru neuronalnych komórek progenitorowych oraz jak śledzić ich projekcje aksonalne i cele synaptyczne w znacznie zaawansowanych stadiach rozwoju, aż do E14.5. Wykorzystaliśmy nowatorskie narzędzia genetyczne, w tym specyficzne elementy wzmacniające, plazmidy na bazie Cre / Lox i system transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac, aby napędzać ekspresję GFP w podtypie komórek tyłomózgowia (najbardziej grzbietowa podgrupa interneuronów, dA1). Trajektorie aksonów i cele aksonów dA1 są śledzone we wczesnych i późnych stadiach embrionalnych w różnych regionach pnia mózgu. Strategia ta przyczynia się do zaawansowanych technik celowania w komórki będące przedmiotem zainteresowania w embrionalnym tyłomózgowiu oraz śledzenia tworzenia się obwodów na wielu etapach rozwoju.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tyłomózgowie stanowi kluczowy węzeł przekaźnikowy układu nerwowego, komunikując się między centralnym i obwodowym układem nerwowym za pośrednictwem rosnących i opadających sieci neuronowych. Reguluje podstawowe funkcje, w tym oddychanie, świadomość, słuch i koordynację ruchową 1-3. We wczesnym rozwoju embrionalnym tyłomózgowie kręgowców jest przejściowo podzielone wzdłuż osi przednio-tylnej (AP) na powtarzające się rombomery, w których tworzą się odrębne typy komórek neuronalnych i generują wiele centrów jąder pnia mózgu 4. Tyłomózgowie jest również podzielone wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej (DV) na płytkę podstawną i alarową, na której wyodrębniają się dyskretne neuronalne komórki progenitorowe i różnicują się w różnych lokalizacjach DV 3,5,6. W dużej mierze nie wiadomo, w jaki sposób wczesne wzorce neuronalne specyficzne dla AP i DV rządzą ustanawianiem funkcjonalnych obwodów pnia mózgu.

Aby zdobyć wiedzę na temat tego fundamentalnego pytania, potrzebne są narzędzia do oznaczania konkretnych podzbiorów neuronów we wczesnym tyłomózgowiu oraz śledzenia ich trajektorii aksonalnych i połączeń w bardziej zaawansowanych stadiach. Wcześniej wykorzystaliśmy specyficzne elementy wzmacniające oraz system ekspresji warunkowej oparty na Cre / LoxP do śledzenia trajektorii aksonalnej grzbietowych interneuronów rdzeniowych we wczesnym zarodku piskląt 7-9. W obecnym manuskrypcie skupiliśmy się na tyłomózgowiu i ulepszyliśmy eksperymentalny paradygmat znakowania późnoembrionalnych interneuronów tyłomózgowia, aksonów i ich celów synaptycznych, używając zmodyfikowanej strategii elektroporacji i transpozycji DNA za pośrednictwem PiggyBac. Nasza nowa strategia pozwala na znakowanie odrębnych podtypów neuronów po jednej stronie tyłomózgowia i śledzenie ich projekcji aksonalnych i miejsc synaptycznych na różnych etapach embrionalnych, od 2 do 12 dni po elektroporacji. Opierając się na tej metodzie, oznaczyliśmy najbardziej grzbietową podgrupę interneuronów tyłomózgowia (komórki dA1 / Atoh1 +) i ujawniliśmy dwa kontralateralne wznoszące się wzorce projekcji aksonalnej, z których każdy pochodzi z innej lokalizacji AP i wydłuża się w odrębnym funiculus. Stwierdzono, że aksony dA1 wystają i tworzą synapsy w jądrach słuchowych, śródmózgowiu i w wielu warstwach móżdżku 10.

Połączenie elektroporacji piskląt, genetycznego śledzenia neuronów i analizy miejsc projekcji na bardzo zaawansowanych etapach rozwoju stanowi unikalną platformę do badania powstawania sieci neuronowych w mózgu i wyjaśnienia mechanizmów molekularnych, które rządzą powstawaniem obwodów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Elektroporacja tyłomózgowia

1.1 Obchodzenie się z jajami

  1. Umieścić jaja poziomo w nawilżanym inkubatorze (37-38,5 °C). Zarodki są elektroporowane po 65-70 godzinach inkubacji, gdy osiągną stadium 16-17 (HH) (25-30 somitów).
  2. Wyjąć jaja z inkubatora; pozostają one w pozycji poziomej.

1.2 Przygotowania

  1. Wyciągnij szklane kapilary (średnica 0,5 mm).
  2. Podłącz wygięte złote elektrody Genetrodes w kształcie litery L (średnica 3 mm) z uchwytem adaptera do generatora impulsów. Parametry elektroporacji obejmują 25 woltów, 5 liczb impulsów, długość impulsu 45 ms, interwały impulsów 300 ms.
  3. Przygotuj pipetę do jamy ustnej, igłę do strzykawki o pojemności 10 ml, paski parafilmu, miękką szczoteczkę, ostre nożyczki preparacyjne i 25 ml sterylnego roztworu PBS. Ta ilość jest zwykle wystarczająca do obsługi tacki na jajka (18 jaj).
  4. Przygotuj odpowiednią mieszaninę plazmidów DNA (po 5 μg/μl każdy) i dodaj około 0,025% barwnika Fast Green, aby uwidocznić wstrzyknięcie DNA. Zazwyczaj do wstrzyknięcia tacki wystarcza objętość 4 μl.

1.3 Okienkowanie, iniekcja i elektroporacja

  1. Oczyść skorupki jaj 70% etanolem.
  2. Dotykaj jednego jaja na raz, aby zminimalizować czas ekspozycji zarodka na powietrze.
  3. Kończami nożyczek zrób dziurę w słupku jajka i usuń strzykawką 3-4 ml albuminy. Nie usuwaj większej ilości albuminy, ponieważ zmniejsza to żywotność.
  4. Otwórz małe owalne okienko (o wymiarach 2,5 x 2 cm) w górnej środkowej części skorupki jajka za pomocą nożyczek do preparowania.
  5. Wlej kilka kropli PBS na wierzch zarodka, aby zapobiec wysuszeniu podczas całego procesu.
  6. Załaduj niewielką ilość mieszaniny DNA do szklanej kapilary za pomocą pipety doustnej.
  7. Umieść zarodek tylnym końcem do siebie. Na tym etapie nie jest wymagane wstrzykiwanie atramentu, ponieważ zarodek jest wyraźnie widoczny. Unikanie wstrzykiwania atramentu zwiększa przeżywalność zarodka. Przeniknij do ogona tyłomózgowia, przytrzymując naczynia włosowate pod kątem ~45°. Nie usuwaj żadnej błony z okolic zarodka. Ostrożnie wstrzyknąć roztwór DNA do światła tyłomózgowia i wydychać powietrze bez tworzenia pęcherzyków powietrza. Roztwór DNA rozprzestrzenia się do przodu.
  8. Natychmiast po wstrzyknięciu DNA umieść równoległe elektrody w precyzyjnej pozycji AP i DV w tyłomózgowiu, do której dążysz. Lekko popchnij elektrody brzusznie, nie dotykając serca, ponieważ może to zmniejszyć żywotność. Impulsuj elektroporator. Elektrody powinny być pokryte pęcherzykami, aby wskazać przewodność elektryczną (rysunek 1A).
  9. Ostrożnie wyjmij elektrody i wlej kilka kropli PBS, aby schłodzić zarodek i usunąć pęcherzyki. Prawidłowo uszczelnij otwór jaja paskiem parafilmowym, aby zapobiec wysuszeniu podczas inkubacji. Umyj elektrody w PBS miękką szczotką.
  10. Umieść jajo w inkubatorze na żądany czas. Przeżywalność zarodków wynosi około 90% 2-3 dni po elektroporacji i zmniejsza się do 50% 12 dni po elektroporacji.

2. Analiza zarodków

2.1 Przygotowanie do montażu płaskiego i immunofluorescencja

  1. Preparacje tyłomózgowia z płaskim mocowaniem można wykonać do E6,5, aby łatwo uwidocznić aksony pod mikroskopem lub mikroskopem stereoskopowym.
  2. Ostrożnie wypreparuj zarodek, oddzielając go od otaczających błon i naczyń krwionośnych. Umieść zarodek na małej pokrytej silikonem szalce Petriego zawierającej PBS. Przymocuj zarodek do naczynia za pomocą wolframowych szpilek skierowanych grzbietowo. Wykonaj szczelinę grzbietową w tylnej płycie dachowej mózgu za pomocą ostrych szklanych naczyń włosowatych.
  3. Za pomocą ostrej pęsety i mikronożyczek przytrzymaj górną część głowy i bardzo ostrożnie pociągnij tkankę tylnego mózgu od rostralnego do ogonowego. Po oddzieleniu tyłomózgowia usuń pozostałe tkanki brzuszne, aby uzyskać czysty preparat.
  4. Inkubuj tyłomózgowie z 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej (RT). Umyj tyłomózgowie PBT (PBS/0,1% Triton X-100) w celu usunięcia PFA.
  5. W celu immunofluorescencji w płasko zamontowanym tyłomózgowiu dodać 500 μl roztworu blokującego (5% koziej surowicy w PBT i inkubować przez 2 godziny w RT Inkubować z 1st przeciwciałem ON w temperaturze 4 °C. Przemyć PBT (15 min x 3). Inkubować z 2nd przeciwciałem przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przemyć PBT (15 min x 3).
  6. Umieść tyłomózgowie skierowane grzbietowo na szklanym szkiełku. Dodaj fluorescencyjny nośnik montażowy na tyłomózgowie. Użyj szklanych naczyń włosowatych lub igieł wolframowych, aby spłaszczyć tyłomózgowie na szkiełku.
  7. Dodaj niewielką ilość tłuszczu w każdym rogu, aby zapobiec ściskaniu chusteczki przez szkiełko nakrywkowe. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na tylnym mózgowiu i unikaj pęcherzyków powietrza. Aby uzyskać przyczepność, dodaj lakier do paznokci na krawędzie szkła.

2.2 Kriosekcje i immunofluorescencja

  1. Kriowycinki pnia mózgu można wykonać na dowolnym etapie, aby uwidocznić trajektorie aksonów. Jednak po E6,5 powinna to być preferowana metoda ze względu na trudność w wizualizacji aksonów w płasko zamontowanym zarodku, który staje się zbyt gruby. Co więcej, demonstracja działania synaps wymaga przekroju tkanki i obejrzenia jej w dużym powiększeniu pod mikroskopem.
  2. Wypreparuj zarodek i usuń wszystkie otaczające tkanki. Spłucz PBS. Przetnij zarodek w ogonowej części rdzenia za pomocą mikronożyczek i ostrej pęsety. Wykonaj szerokie nacięcie między móżdżkiem a śródmózgowiem i usuń cały pień mózgu. Tkanka powinna zawierać rdzeń, most i móżdżek.
  3. Utrwalić pień mózgu w 4% PFA na noc (ON) w temperaturze 4 °C, spłukać PBS (10 min x 3) i inkubować z 30% sacharozą w celu ON w temperaturze 4 °C aż do zatonięcia.
  4. Osadź tyłomózgowie w krioformie ze związkiem OCT (optymalna temperatura cięcia) i umieść je w temperaturze -20 °C do momentu zamrożenia, jak opisano w innym miejscu 11.
  5. Umieść blok OCT w kriostacie na żądanej osi przekroju. Szerokość przekroju wynosi 12 μm.
  6. Wysuszyć szkiełka. Dodać 100 μl roztworu blokującego na każde szkiełko przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Dodać 100 μl przeciwciał (rozcieńczonych w roztworze blokującym do pożądanego stężenia). Okres inkubacjidla 1. i 2. przeciwciał wynosi ON odpowiednio w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej. Na każdy czas inkubacji delikatnie dodaj pasek parafilmu na wierzch szkiełka, aby zapobiec wysuszeniu. Przemyć PBS (10 min x 3) między przeciwciałami. W razie potrzeby dodać 1:1 000 Dapi (4'-6-Diamidino-2-fenyloindol), rozcieńczonego w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Spłukać PBS.
  7. Zamontuj szkiełko za pomocą fluorescencyjnych nośników montażowych. Pozostaw do wyschnięcia na 1 godzinę przed analizą.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został ostatnio wykorzystany do odkrycia wzorców aksonalnych i miejsc projekcji podgrupy dA1 interneuronów w tyłomózgowiu piskląt 10. Aby specyficznie oznaczyć te aksony, potwierdzono, że element wzmacniający (Atoh1), który wcześniej został scharakteryzowany jako specyficzny dla neuronów rdzenia kręgowego dI1 8,12,13, ulega ekspresji w komórkach dA1 tyłomózgowia 10. Pierwiastek sklonowano przed rekombinazą Cre i poddano elektropostacji w E2,75 wraz z zależnym od Cre cytoplazm...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja in ovo jest wykonalnym, niezawodnym i skutecznym narzędziem do badania specyfikacji komórek i prowadzenia aksonów podczas rozwoju układu nerwowego piskląt 20. W tym protokole opisujemy tryb elektroporacji w tyłomózgowiu pisklącia przy E2,75 przy użyciu elementów wzmacniających, które umożliwiają warunkowe znakowanie określonych interneuronów. Strategia ta jest połączona z systemem transpozycji, w którym pośredniczy PiggyBac, w celu wprowadzenia obcych genów do genomu pisklęcia, co umożl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Yuvalowi Gottlieb-Drorowi za ilustrację do elektroporacji. Praca ta była wspierana przez granty dla DSD z Narodowego Instytutu Psychobiologii w Izraelu oraz z programu współpracy badawczej Niedersachsen-Izrael oraz przez granty dla AK z Izraelskiej Fundacji Naukowej, izraelskiego Ministerstwa Zdrowia i partnerstwa The Center of Excellence-Legacy Heritage Biomedical Science.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Złote Genetrody w kształcie litery L Elektrody 3 mmBTX, Generator impulsów Harvard Apparatus45-0162
, ECM 830BTX, Aparat Harvarda45-0002
OCT (Optymalna temperatura cięcia)Tissue-Tek Sakura4583 O.C.T. Compound
Lakier do paznokciod dowolnego komercyjnego dostawcy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
  2. Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
  3. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
  4. Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
  5. Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
  6. Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
  7. Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
  8. Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21(2009).
  9. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792(2010).
  10. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
  11. Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
  14. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141(2009).
  15. Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
  16. Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
  17. Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
  18. Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
  19. Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
  20. Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
  21. Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
  22. Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
  23. Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikroiniekcja DNAmikroskopia fluorescencyjnakriotomiaprzygotowanie preparat w typu flat mounttranspozon PiggyBac

Powiązane artykuły