Ex vivo Test hemolizy krwinek czerwonych do oceny czynników endosomolitycznych reagujących na pH do cytozolowego dostarczania leków biomakromolekularnych

Podsumowanie

Test hemolizy może być używany jako szybkie, wysokoprzepustowe badanie cytokompatybilności i aktywności endosomolitycznej systemów dostarczania leków do wewnątrzkomórkowego dostarczania ładunków. Test mierzy rozerwanie błon erytrocytów w funkcji pH środowiska.

Streszczenie

Dwuwarstwowe fosfolipidy, które tworzą pęcherzyki endolizosomalne, mogą stanowić barierę dla dostarczania leków biologicznych do celów wewnątrzkomórkowych. Aby pokonać tę barierę, zaprojektowano szereg syntetycznych nośników leków, które aktywnie zakłócają błonę endosomalną i dostarczają ładunek do cytoplazmy. W tym miejscu opisujemy test hemolizy, który może być stosowany jako szybkie, wysokoprzepustowe badanie przesiewowe pod kątem cytozgodności i aktywności endosomolitycznej wewnątrzkomórkowych systemów dostarczania leków.

W teście hemolizy, ludzkie czerwone krwinki i materiały testowe są współinkubowane w o określonych pH, które naśladują środowiska zewnątrzkomórkowe, wczesne endosomalne i późne endolizomalne. Po etapie wirowania w celu osadzenia nienaruszonych krwinek czerwonych, ilość hemoglobiny uwalnianej do pożywki jest mierzona spektrofotometrycznie (405 nm dla najlepszego zakresu dynamiki). Procent rozerwania czerwonych krwinek jest następnie oznaczany ilościowo w stosunku do pozytywnych próbek kontrolnych poddanych lizie z detergentem. W tym systemie modelowym błona erytrocytów służy jako substytut dwuwarstwowej błony lipidowej, która otacza pęcherzyki endolizosomalne. Pożądanym rezultatem jest znikoma hemoliza przy fizjologicznym pH (7,4) i silna hemoliza w endolizosomalnym zakresie pH od około 5,8 do pH.

Wprowadzenie

Chociaż wewnątrz komórki znajduje się wiele potencjalnych celów terapeutycznych o dużym wpływie, wewnątrzkomórkowe dostarczanie środków stanowi poważne wyzwanie. Często leki, zwłaszcza biologiczne, są internalizowane przez komórki i transportowane do pęcherzyków, które albo prowadzą do degradacji ich zawartości przez szlak endolizosomalny, albo są transportowane z powrotem z komórki przez egzocytozę. ¹ W tym ostatnim procesie wewnętrzne pH pęcherzyków jest zakwaszane do około 5-6, co jest optymalnym pH dla aktywności enzymów działających w tym kompartmencie, takich jak lizozym. ^{cyfra arabska}

Ostatnio, wiele materiałów zostało specjalnie zaprojektowanych, aby wykorzystać zakwaszenie endosomów do ułatwienia cytozolowego dostarczania ich ładunku. Jednym z przykładów takiego podejścia są syntetyczne, polimerowe nanocząstki miceli, których rdzeń jest jonowy i neutralny pod względem ładunku przy fizjologicznym pH (tj. 7,4). Jednak przy pH 6,0 - 6,5 polimery ulegają protonacji i uzyskują dodatni ładunek netto, który destabilizuje rdzeń miceli, a odsłonięte segmenty polimeru oddziałują z błoną endosomalną i ją zakłócają. Wykazano, że aktywność ta sprzyja endosomalnej ucieczce leków opartych na peptydach i kwasach nukleinowych, umożliwiając im dostęp do celów cytozolowych. ^3,4 Inne przykłady metod opracowanych w celu pośredniczenia w ucieczce endosomalnej, które zakłócają barierę błonową, obejmują "fuzogenne" peptydy lub białka, które mogą pośredniczyć w fuzji błonowej lub przejściowym tworzeniu porów w dwuwarstwie fosfolipidowej. ⁵ Homopolimery anionowych alkilowych kwasów akrylowych, takie jak poli(kwas propyloakrylowy), to kolejne dobrze zbadane podejście, aw tych polimerach stan protonacji wiszącego kwasu karboksylowego dyktuje przejście w stan hydrofobowy, zakłócający błonę w endolizosomalnych zakresach pH. ^6,7

Jednym z użytecznych modelowych systemów do badania zachowań endosomolitycznych jest test hemolizy ex vivo zależny od pH. ⁸ W tym systemie modelowym błona erytrocytów służy jako substytut dwuwarstwowej błony lipidowej, która otacza pęcherzyki endolizosomalne. Ten uogólniony model został wykorzystany przez innych do oceny endosomolitycznego zachowania peptydów penetrujących komórki i innych polimerowych systemów dostarczania genów. ^8-11 W tym eksperymencie ludzkie krwinki czerwone i materiały testowe są jednocześnie inkubowane w o określonych pH, które naśladują środowiska zewnątrzkomórkowe (7,4), wczesne endosomalne (6,8) i późne endolizomalne (< 6,8). Ilość hemoglobiny uwalnianej w okresie inkubacji określa się ilościowo jako miarę lizy czerwonych krwinek, która jest normalizowana do ilości hemoglobiny uwalnianej w dodatnich próbkach kontrolnych poddanych lizie detergentu.

Z badania przesiewowego małej biblioteki potencjalnie endosomolitycznych materiałów testowych, można wywnioskować, że próbki, które nie wytwarzają hemolizy przy pH 7,4, ale znacznie podwyższoną hemolizę przy pH < 6,5, będą najbardziej skutecznymi i cytokompatybilnymi kandydatami do dostarczania leków cytozolowych. Oczekuje się, że materiały, które spełniają te kryteria, pozostaną obojętne i nie będą bezkrytycznie niszczyć dwuwarstwowych błon lipidowych (tj. To może powodować cytotoksyczność), dopóki nie zostaną wystawione na spadek lokalnego pH po internalizacji do kompartmentów endolizosomalnych.

W tym protokole, erytrocyty są izolowane od ludzkiego dawcy i jednocześnie inkubowane przy pH 5,6, 6,2, 6,8 lub 7,4 z eksperymentalnymi środkami do dostarczania leków endosomolitycznych. Nienaruszone erytrocyty są granulowane, a supernatanty (zawierające hemoglobinę uwalnianą z lizowanych erytrocytów) są analizowane pod kątem charakterystycznej absorbancji hemoglobiny za pomocą czytnika płytek (ryc. 1).

Protokół

1. Przygotowanie i sterylizacja i czynników testowych

1. Bufor 150 mM NaCl: Rozpuść 4,383 g kryształów NaCl w 500 ml wody nanoczystej.
2. pH: Przygotuj fosforanowe o pH 5,6, 6,2, 6,8 i 7,4, mieszając odpowiednie ilości jednozasadowego i dwuzasadowego fosforanu sodu. Jeżeli próbki mają być badane przy niższych wartościach pH (tj. pH < 5,6), należy użyć bardziej odpowiedniego buforu, takiego jak bufor cytrynianowy. Receptury są łatwo dostępne, a przykładowe odniesienie znajduje się tutaj. ¹²
3. Wysterylizuj wszystkie wymienione powyżej za pomocą butelkowego aparatu do filtracji próżniowej i ponownie sprawdź pH buforu.
4. 20% Triton X-100 (kontrola pozytywna): Wymieszaj 20 ml czystego Triton X-100 w 80 ml wody nanoczystej. Energicznie wirować i sonikować do rozpuszczenia. Pozostaw w temperaturze pokojowej na noc przed użyciem.

2. Przygotowanie erytrocytów

1. Pobrać 25 ml krwi od anonimowego dawcy ludzkiego, pobranej bezpośrednio do probówek Vacutainer pokrytych K_2-EDTA, aby zapobiec krzepnięciu.

UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wstępnie zatwierdzone przez odpowiednią Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB), a nakłucie żyły i pobranie krwi musi być wykonane przez wyszkolonego flebotomistę, aby zminimalizować ryzyko dla dawcy. Standardowe procedury flebotomii zostały opublikowane w innym miejscu. ¹³

2. Odwirować krew o stężeniu 500 x g przez 5 minut i zaznaczyć poziom hematokrytu (czerwona, dolna warstwa) i osocza (żółtawa, górna warstwa) na probówce.
3. Delikatnie odessać osocze za pomocą mikropipetora, dodać do wybielacza i wyrzucić do odpadów niebezpiecznych biologicznie.
4. Napełnij probówkę hematokrytu do zaznaczonej linii (oryginalny poziom osocza) roztworem NaCl o stężeniu 150 mM. Zakręć i odwróć kilka razy, aby delikatnie wymieszać. Wirować przy 500 x g przez 5 min.
5. Powtórz krok 2.3-2.4, aby ponownie umyć krwinki. Następnie odessać supernatant i zastąpić PBS o pH 7,4. Odwróć, aby wymieszać.
6. Podziel krew równomiernie na cztery probówki, odpowiadające każdemu pH, które będzie badane. Oznaczyć probówki zgodnie z każdym badanym pH (5.6, 6.2, 6.8, 7.4).
7. Odwirować probówki z krwią o stężeniu 500 x g przez 5 minut. Zaznaczyć poziomy na probówkach, a następnie odessać supernatant.
8. Napełnić każdą probówkę do oznaczonej linii buforem o odpowiednim pH (jak wskazano w ppkt 2.6).
9. Oznaczyć cztery stożkowe probówki o pojemności 50 ml (po jednej na pH do testu) i odpipetować 49 ml PBS o odpowiednim pH do każdej stożkowej probówki.
10. Dodać 1 ml erytrocytów (o tym samym pH) do odpowiedniej probówki w celu rozcieńczenia w stosunku 1:50. Sprawdź wzrokowo rozcieńczoną krew, która powinna być mętna i opadnie, jeśli nie zostanie zakłócona. Jeśli nie tworzy się osad, komórki uległy lizie.

3. Test lizy 96 Konfiguracja płytki dołkowej i kwantyfikacja

1. Przygotować roztwory podstawowe wszystkich eksperymentalnych środków do dostarczania leków, o 20-krotnym pożądanym stężeniu końcowym do badania (test wymaga 10 μl środka dostarczającego lek + 190 μl rozcieńczonych czerwonych krwinek, co prowadzi do rozcieńczenia 1:20 oryginalnego środka dostarczającego lek do końcowej mieszaniny testowej). Sugerowane są zapasy 20, 100 i 800 μg/ml, co daje końcowe stężenia testowe odpowiednio 1, 5 i 40 μg/ml.
2. Odpipetować 10 μl każdego roztworu podstawowego do 96-dołkowych płytek z dnem w kształcie litery V. Aby uzyskać optymalne wyniki, załaduj każdą próbkę w trzech lub czterech egzemplarzach.

UWAGA: Dla ułatwienia, zaleca się, aby dla każdego badanego pH przygotować oddzielną 96-dołkową płytkę, z każdą próbką (przy każdym stężeniu) załadowaną na n=3-4 na płytkę.

3. W przypadku studzienek kontroli pozytywnej dodać 10 μl 20% Triton X-100.
4. W przypadku studzienek kontroli ujemnej dodać 10 μl buforu fosforanowego. Użyj buforu o tym samym pH, który ma być badany.
5. Odmierzyć pipetę 190 μl rozcieńczonych erytrocytów (patrz 2.10) do każdej studzienki, upewniając się, że roztwór podstawowy komórki pozostaje jednorodny podczas przenoszenia. Wskazówka: Użyj pipety wielokanałowej, aby uprościć to zadanie.
6. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez godzinę (opcjonalnie: użyć wytrząsarki orbitalnej lub kołyski).
7. Wirować na płytkach przez 5 minut przy 500 x g, aby osadzać nienaruszone erytrocyty. Uwaga: podczas wyjmowania płytki z wirówki i transportowania jej do następnego etapu należy obchodzić się z nią ostrożnie i upewnić się, że nie naruszysz osadu komórkowego.
8. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl supernatantu z każdej studzienki do przezroczystej, płaskodennej płytki 96-dołkowej. Uwaga: jeśli osad komórkowy zostanie przypadkowo naruszony w przypadku którejkolwiek próbki (próbek), można ponownie odwirować płytkę, a następnie przystąpić do przenoszenia supernatantu.
9. Zmierzyć absorbancję supernatantów za pomocą czytnika płytkowego. Należy pamiętać, że można stosować różne długości fal (400 - 541 nm).

UWAGA: Różne czytniki płytek mogą mieć różne punkty nasycenia i czułości, więc wybór długości fali do pomiarów zależy od tego, czy dane hemolizy z próbek eksperymentalnych mogą być wiarygodnie znormalizowane w stosunku do maksymalnej hemolizy wywołanej przez leczenie detergentem. Wymaga to dokładnego pomiaru wartości absorbancji dodatnich próbek kontrolnych.

10. Korzystając z programu Microsoft Excel lub podobnego oprogramowania do analizy danych, znajdź średnią odczytów absorbancji tła z próbek kontroli ujemnej ustawionych dla każdego pH (krok 3.4). Odejmij tę wartość absorbancji tła od wszystkich innych próbek, które zostały zmierzone przy tym pH.
11. Po odjęciu tła określić średnią absorbancję próbek poddanych działaniu detergentu w ramach kontroli dodatniej (krok 3.3). Następnie znormalizuj wszystkie dane eksperymentalne do tej średniej wartości absorbancji, która powinna reprezentować 100% hemolizę. Na koniec pomnóż wartość każdego dołka przez 100%, aby obliczyć % hemolizy, która wystąpiła w każdym pojedynczym studzience w stosunku do kontroli detergentu.

Wyniki

Zazwyczaj substancje wykazujące idealne pH-zależne zachowanie hemolityczne mają największy potencjał w dostarczaniu leków, kwasów nukleinowych lub innych cząsteczek bioaktywnych do cytozolu. Przykładem jest Substancja nr 1 przedstawiona na Rysunku 2, która wykazuje minimalną hemolizę przy pH 7,4, ale gwałtowny wzrost aktywności hemolitycznej w zakresach pH endosomalnego (< 6,5). Niektóre substancje mogą wykazywać znaczny poziom zachowań hemolitycznych w fizjologicznych zakresach pH (Substancja nr 2 pr...

Dyskusja

Polimery reagujące na pH lub inne środki przeznaczone do funkcji endosomolitycznej można szybko i skutecznie przebadać przesiewowo na podstawie lizy czerwonych krwinek przy wartościach pH napotkanych w endosomie (ryc. 1; pH 6,8 - wczesny endosom, pH 6,2 - późny endosom, pH 5,6 - lizosom). Hemoliza zależna od pH ^14-17 została wykorzystana do badania przesiewowego zdolności nośników do pośredniczenia w endosomalnym uwalnianiu terapii biomakromolekularnych (np. peptydów, siRNA, ODN, biał...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BD Vacutainer - Rurki próżniowe K2EDTA	Fisher Scientific	22-253-145	Do pobierania krwi
Igły do pobierania krwi BD Vacutainer, 20,5-gauge	Fisher Scientific	02-665-31	Do pobierania krwi
BD Vacutainer Uchwyt rurki / adapter igły	Fisher Scientific	22-289-953	Do pobierania krwi
Waciki z alkoholem izopropylowym marki BD	Fisher Scientific	13-680-63	Do pobierania krwi
BD Vacutainer Bezlateksowa opaska uciskowa	Fisher Scientific	02-657-6	Do pobierania krwi
Kwas solny (stężenie)	Fisher Scientific	A144-500	Do regulacji pH D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Kontrola pozytywna
Dulbecco's PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 Sterylny jednorazowy filtr butelkowy z membraną SFCA	Fisher Scientific	09-740-44A
BD Płytki 96-dołkowe, płaskodenne, polistyren poddany kulturom tkankowym	Fisher Scientific	08-772-2C	Do odczytu z tabliczki na końcu testu.
BD 96-dołkowe, okrągłodenne, polistyren poddany kulturom tkankowym	Fisher Scientific	08-772-17	Do inkubacji czerwonych krwinek za pomocą środków eksperymentalnych.