Artykuł metodologiczny

Izolowanie i barwienie immunologiczne limfocytów i komórek dendrytycznych z mysich plastrów Peyera

DOI:

10.3791/50167

⸱

17 marca 2013

 ,  , 
1Division of Infectious Diseases, New York State Department of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośnie zainteresowanie zrozumieniem funkcji immunologicznych określonych subpopulacji komórek w łatach Peyera (PP), głównych miejscach indukcyjnych tkanek limfatycznych związanych z jelitami. W tym miejscu przedstawiamy równoległe protokoły przygotowania preparatów pojedynczych komórek PP do analizy cytometrii przepływowej i kriosekcji PP do barwienia immunologicznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łaty Peyera (PPs) są integralnymi składnikami tkanek limfatycznych związanych z jelitami (GALT) i odgrywają kluczową rolę w inwigilacji immunologicznej jelit i homeostazie. Antygeny w postaci cząstek stałych i drobnoustroje w świetle jelita są w sposób ciągły próbkowane przez komórki PP M w nabłonku związanym z pęcherzykami (FAE) i transportowane do leżącej poniżej sieci komórek dendrytycznych (DC), makrofagów i limfocytów. W tym artykule opisujemy protokoły, w których mysie PP są (i) dysocjowane na zawiesiny pojedynczych komórek i poddawane cytometrii przepływowej oraz (ii) przygotowywane do kriosekcji i barwienia immunologicznego. W przypadku cytometrii przepływowej PP są mechanicznie dysocjowane, a następnie filtrowane przez błony o średnicy 70 μm w celu wytworzenia zawiesin pojedynczych komórek wolnych od komórek nabłonka i dużych zanieczyszczeń. Zaczynając od 20-25 PP (od czterech myszy), ta szybka i powtarzalna metoda daje populację >2,5 x 106 komórek o żywotności >90%. W przypadku kriosekcji, świeżo wyizolowane PP są zanurzane w pożywce o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zamrażane zatrzaskowo w ciekłym azocie, a następnie cięte za pomocą kriomikrotomu. Wycinki tkanek (5-12 μm) są suszone na powietrzu, utrwalane acetonem lub metanolem, a następnie poddawane immunoznakowaniu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plamy Peyera (PPs) są makroskopowymi agregatami zorganizowanych pęcherzyków limfoidalnych obecnych w jelicie cienkim ludzi i myszy (Rysunek 1) i stanowią główne miejsca, w których inicjowane są odpowiedzi immunologiczne błony śluzowej przeciwko antygenom dietetycznym, bakteriom komensalnym, patogenom mikrobiologicznym i doustnym szczepionkom 1-4. W przeciwieństwie do innych obwodowych tkanek limfatycznych, takich jak krezkowe węzły chłonne, PP nie mają doprowadzających komórek limfatycznych. W związku z tym adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne w PP są napędzane w odpowiedzi na antygeny pochodzące ze światła jelita. Pobieranie próbek antygenów luminalnych odbywa się za pomocą nabłonka związanego z pęcherzykami (FAE), który składa się zarówno z enterocytów, jak i komórek pobierających próbki antygenu, znanych jako komórki M. Pod FAE, w regionie kopuły podnabłonkowej (SED), znajduje się sieć komórek dendrytycznych (DC) zmieszanych z makrofagami, komórkami B i limfocytami T CD4 + 5-9. W sercu każdego pęcherzyka limfatycznego PP znajdują się pęcherzykowe komórki dendrytyczne (FDC) i centralne centrum rozrodcze bogate w komórki B, otoczone strefami międzypęcherzykowymi bogatymi w limfocyty T. Pobieranie próbek antygenu za pomocą PP powoduje rozwój plazmablastów komórek B IgA+ oraz komórek efektorowych i pamięciowych CD4+, które zasiewają otaczającą blaszkę właściwą i zapewniają odporność w szerokim zakresie na najeźdźców błony śluzowej.

Analizowanie skomplikowanych zdarzeń immunologicznych związanych z pobieraniem, przetwarzaniem i prezentacją antygenu w PPs jest trudnym zadaniem, biorąc pod uwagę, że komórki PP stanowią tylko niewielki ułamek wszystkich komórek limfatycznych w błonie śluzowej jelit. Aby pomóc w charakterystyce in vitro komórek w tym środowisku, udostępniamy protokół przygotowania całkowitych mysich komórek PP do cytometrii przepływowej i analizy funkcjonalnej, a także protokół przygotowania kriosekcji PP do mikroskopii immunofluorescencyjnej i immunohistologii. Nasz protokół izolacji, charakterystyki i barwienia immunologicznego mysich komórek PP sam w sobie nie jest nowy, o czym świadczy fakt, że istnieje wiele odniesień sprzed ponad 25 lat, które cytują te techniki 5,6,9-11. Nasz protokół zapewnia raczej uproszczoną (i wizualną) metodę dla badaczy zbierających PP po raz pierwszy. Techniki, które opisujemy, są łatwe do opanowania i z łatwością dają dużą liczbę komórek o żywotności >90%. Protokół kriosekcji pozwala uzyskać wysoce powtarzalne odcinki seryjne, które idealnie nadają się do barwienia immunofluorescencyjnego i obrazowania konfokalnego. Co więcej, nasz protokół uzupełnia dwa inne niedawne artykuły JoVE. Pierwsza, autorstwa Fukudy i współpracowników, opisuje zastosowanie testów podwiązanej pętli jelita krętego do oceny wychwytu bakterii chorobotwórczych przez komórki PP M 12. Drugi, autorstwa Geema i współpracowników, opisuje izolację i charakterystykę DC i makrofagów z błony śluzowej jelita myszy, ale wyraźnie wyklucza PP z ich analizy 13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta były trzymane w konwencjonalnych, specyficznych warunkach wolnych od patogenów i były traktowane w pełnej zgodności z wytycznymi Międzynarodowego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Wadsworth.

1. Zgłębnik oralny

  1. (Opcjonalnie) Wybrany szczep myszy zgłębnika z antygenem lub drobnoustrojami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu igły do karmienia o końcu 22 G x 1,5 cala (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Ilość podawana nie powinna przekraczać 400 μl na mysz.

2. Izolacja komórek PP do cytometrii przepływowej

  1. Eutanazja myszy przez uduszenie CO2 , zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania (IACUC).
  2. Przed zabiegiem oczyść brzuch 70% etanolem lub betadyną. Wykonaj standardową laparotomię, która obejmuje pojedyncze (1 cm) nacięcie za pomocą nożyczek chirurgicznych wzdłuż linii środkowej, zaczynając około 1,5 cm od podstawy klatki piersiowej. Odsłoń jamę otrzewnową i zidentyfikuj jelito ślepe. Przeciąć końcowe jelito cienkie na połączeniu jelita krętego i kątowego i delikatnie usunąć jelito w całości. Należy uważać, aby nie przeciągnąć tkanki jelitowej podczas jej usuwania z jamy otrzewnej.
  3. Połóż jelito cienkie na łóżku z wilgotnych ręczników papierowych lub chusteczek Kimwipe. Delikatnie zwilż jelito cienkie solą fizjologiczną, aby zapobiec odwodnieniu tkanek. Wizualnie zidentyfikuj poszczególne PP znajdujące się po stronie przeciwkrezkowej jelita (ryc. 1). Zazwyczaj pojedyncza mysz ma od 5 do 10 widocznych PP, które są równomiernie rozmieszczone od dwunastnicy (proksymalnie) do jelita krętego (dystalnie). Średnio cztery myszy dają 23 PP.
  4. Za pomocą zakrzywionych nożyczek chirurgicznych delikatnie wytnij poszczególne PP i umieść je w zimnym roztworze soli Hanka (HBSS). Uwaga, nożyczki należy ułożyć zakrzywioną stroną do góry tuż nad PP, a następnie delikatnie przyłożyć do tkanki. Wyciąć tylko PP (nie otaczającą tkankę) i przenieść do zimnego HBSS.
    Uwaga: Wszystkie etapy inkubacji i wirowania, począwszy od tego punktu, w sekcji 2, powinny być przeprowadzane w temperaturze 4 °C w celu zachowania żywotności komórek.
  5. Przenieść PP do 5 ml pożywki dysocjacyjnej śledziony i inkubować przez 15-20 minut w temperaturze 37 °C, energicznie wstrząsając przy 250 obr./min. Dłuższy czas inkubacji negatywnie wpłynie na żywotność komórek.
  6. Aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową, umieść PP na sterylnym (autoklawowanym) sitku do komórek z nylonowej siatki o wielkości 70 μm i na siłę zmiel tkankę w siatce za pomocą podstawy tłoka ze strzykawki o pojemności 1 cm3. Alternatywnie, umieść PP między dwoma szkiełkami mikroskopowymi z matowego sterylnego szkła (autoklawowane w kopertach) i delikatnie zmielić tkanki ruchem do przodu iz powrotem. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieść zawiesinę komórek do probówki Falcon o pojemności 5 ml.
  7. Dodać EDTA do końcowego stężenia 1 mM do zawiesiny komórek. Inkubować na bujaku przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Zdekantować zawiesinę komórek przez drugie sitko o wielkości 70 μm w celu usunięcia wszelkich pozostałych agregatów komórkowych lub resztek tkankowych. Zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 lub 50 ml.
  9. Poddać komórki delikatnemu wirowaniu (5 min przy 500 x g). Zdekantuj supernatant i ponownie zawieś komórki w buforze przepływowym, który jest solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 1% płodowej surowicy cielęcej (FCS).
  10. Aby określić liczbę komórek i żywotność, rozcieńczyć komórki w stosunku 1:10 do błękitu trypanowego i wizualnie sprawdzić komórki za pomocą mikroskopu świetlnego i hemocytometru. Alternatywnie, licznik komórek Countess (Invitrogen) lub podobny przyrząd może być użyty do automatycznego zliczania liczby komórek i żywotności.
    Zaczynając od 20-25 PP, protokół ten powinien dać łącznie >2,5 x 106 komórek. Odpowiada to ~ 0,8-1,2 x 106 komórek na mysz.

Oznaczanie komórek przeciwciałami do cytometrii przepływowej

  1. Dozować komórki (10-5 na dołek) do studzienek 96-dołkowej okrągłej płytki dennej.
  2. Poddać płytkę delikatnemu odwirowaniu (5 minut przy 1 000 x g) i zdekantować supernatant poprzez delikatne odwrócenie płytki.
  3. Zawiesić komórki w buforze blokowym Fc i inkubować na lodzie przez 15 minut. Chociaż istnieje wiele komercyjnie dostępnych blokowych Fc (np. szczurzy anty-mysz CD16 / CD32, BD Biosciences), po prostu używamy zużytej pożywki z hybrydoma komórek B szczura (ATCC 2.4.G2), która wydziela monoklonalną IgG1 przeciwko mysim receptorom Fcγ na tym etapie.
  4. Poddać płytkę delikatnemu odwirowaniu (5 minut przy 1 000 x g) jak powyżej, a następnie zdekantować supernatant poprzez delikatne odwrócenie płytki.
  5. Dodać przeciwciała sprzężone z fluoroforem bezpośrednio do zawiesin komórkowych w pożądanym rozcieńczeniu i inkubować na lodzie przez 30 minut z ciągłym kołysaniem.
  6. Poddać płytkę delikatnemu odwirowaniu (5 minut przy 1 000 x g) i zdekantować supernatant poprzez delikatne odwrócenie płytki.
  7. Przemyć komórki 100 μl buforu przepływowego.
  8. Odwirować płytkę o masie 1 000 x g przez 5 minut i zdekantować supernatant poprzez delikatne odwrócenie płytki.
  9. Ponownie zawiesić komórki 400 μl buforu utrwalającego, który składa się z 300 μl buforu przepływowego i 100 μl 1% paraformaldehydu w buforze PHEM (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl2 przy pH 6).
  10. Poddaj komórki cytometrii przepływowej za pomocą FACSCalibur lub jego odpowiednika. Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania Cell Quest Pro w wersji 5.2.

3. Przygotowanie kriosekcji PP

  1. Przed pobraniem tkanki dodaj związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) do plastikowych form bazowych 7x7x5 mm. Przygotuj również kałużę ciekłego azotu (>750 ml) w wiadrze Dewara lub wiaderku na lód.
  2. Poddaj mysz eutanazji i wykonaj laparotamię, jak opisano powyżej. Usuń jelito i połóż na mokrych ręcznikach papierowych.
  3. Aby wyizolować PP do cyrosekcji, należy przeciąć 0,5 cm poprzeczne segmenty jelita cienkiego zawierające pojedynczy PP i przenieść tkankę na szalkę Petriego zawierającą PBS. Delikatnie spłucz światło tych segmentów PBS, aby usunąć niechciane resztki kału.
  4. Umieść segmenty tkanki jelitowej pionowo wewnątrz form bazowych zawierających OCT. Zanurz pleśnie w ciekłym azocie i pozwól tkance całkowicie zamarznąć (1-2 min). Kolor OCT zmieni się z przezroczystego na biały, gdy tkanka zostanie całkowicie zamrożona. W celu bardziej stopniowego chłodzenia (np. w celu zmniejszenia pękania KTZ), należy zanurzyć formę w kąpieli izopentanu chłodzonej oparami ciekłego azotu. nuta: Podczas pracy z ciekłym azotem należy nosić odpowiednie okulary ochronne.
  5. Usuń zamrożone formy bazowe z ciekłego azotu za pomocą kleszczy i pozwól pleśni ogrzać się w temperaturze pokojowej wystarczająco długo (~ 10-15 sekund), aby krawędzie bloku OCT zmiękły. Aby następnie wyjąć zamrożony blok OCT z formy, odwróć formę i delikatnie naciśnij z tyłu, aby wysunąć blok na czysty kawałek folii aluminiowej o wymiarach 4 x 4 cm. Natychmiast zawiń chusteczkę w folię i umieść w oznakowanej torbie na próbki przechowywanej w ciekłym azocie lub na suchym lodzie. Alternatywnie można przenieść tkankę do zamrażarki (<-20 °C). Użyj chusteczki w ciągu tygodnia, w przeciwnym razie bloki staną się kruche z wiekiem.

Kriosekcja

  1. Kriosekcja tkanki za pomocą kriomikrotomu Leica CM3050S lub jego odpowiednika. Temperatura komory na kriostacie powinna być ustawiona na -21 °C.
  2. Staraj się o sekcje o grubości 12-14 μm.
  3. Zbierz skrawki na szklanych szkiełkach mikroskopowych Fisher SuperFrost Plus (lub jego odpowiedniku) i sprawdź wizualnie za pomocą standardowego mikroskopu o małej mocy. Jeśli na szkiełku pobieranych jest wiele sekcji, upewnij się, że są one zgrupowane razem w celu dalszego barwienia.
  4. Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej w pudełku na szkiełka i najlepiej zużyć je w ciągu kilku dni.

Oznaczanie przeciwciał w kriosekcjach i analiza mikroskopii konfokalnej

  1. Zanurz szkiełka w acetonie (lub metanolu) w słoiku lub stojaku do barwienia tkanek na 2 minuty. Długotrwała inkubacja może spowodować oderwanie tkanek od szkiełka.
  2. Przenieś szkiełka do nowego słoika do barwienia i umyj je 3 razy PBS-T (1X PBS z 0,05% Tween-20) przez 3 minuty każde.
  3. Otocz sekcje hydrofobowym pisakiem ImmEdge. Zapewni to, że odczynniki i przeciwciała pozostaną ograniczone do tego obszaru podczas inkubacji.
  4. Szkiełka inkubować w buforze blokowym (2% surowicy koziej w PBS) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze, chroniąc przed światłem.
  5. Inkubować szkiełka z buforem blokowym Fc (patrz wyżej) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Zanurz szkiełka w PBS-T i wysusz obszar wokół sekcji za pomocą chusteczek Kimwipes lub innej chłonnej chusteczki. Uważaj, aby nie dotykać rzeczywistych skrawków tkanki.
  7. Na skrawki tkanek nałożyć roztwór przeciwciała pierwotnego i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze. Przeciwciało pierwszorzędowe jest zwykle rozcieńczane w buforze blokowym do końcowego stężenia 20 μg/ml. Pożądane jest stosowanie bezpośrednio znakowanych przeciwciał pierwotnych, ponieważ na tym etapie można połączyć aż trzy przeciwciała. Przeciwciała znakowane bezpośrednio eliminują również potrzebę dodatkowych etapów inkubacji przeciwciał.
  8. Umyj szkiełka 3 razy (po 5 minut każde) przez zanurzenie w PBS.
  9. W razie potrzeby inkubować szkiełka z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze 37 °C w komorze wilgotnościowej.
  10. Umyj szkiełka 3 razy (po 5 minut każde) przez zanurzenie w PBS.
  11. Inkubować szkiełka przez 4 minuty w 1% paraformaldehydzie w buforze PHEM, jak opisano powyżej.
  12. Płukać szkiełka PBS przez 1 min.
  13. Osusz obszar wokół sekcji za pomocą chusteczek Kimwipes lub innej chłonnej chusteczki. Uważaj, aby nie dotykać rzeczywistych skrawków tkanki. Za pomocą pipety lub zakraplacza delikatnie umieść kroplę podłoża montażowego Prolong Gold bezpośrednio na sekcji. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe na podłoże montażowe, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Użyj bibuły, aby wchłonąć nadmiar materiału montażowego.
  14. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe do szkiełek mikroskopowych dostępnym w handlu lakierem do paznokci i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
  15. Przeglądaj slajdy za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica TCS SP5 lub równoważnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza cytometryczna przepływowa monodyspersyjnych zawiesin wszystkich komórek PP ujawnia wyraźne rozróżnienie między dobrymi i złymi preparatami komórkowymi. W dobrych preparatach komórkowych o żywotności ponad 80%, zdecydowana większość komórek wykazuje wysokie rozproszenie do przodu (FSC), wskaźnik dużej objętości komórki, i niskie rozproszenie boczne (SSC), wskaźnik niskiej ziarnistości komórek (Figura 2A). W tym eksperymencie celowo przygotowaliśmy również "słabe przygotowanie komórek" poprzez inku...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiliśmy równoległe protokoły przygotowania preparatów jednokomórkowych PP do cytometrii przepływowej i analizy funkcjonalnej oraz kriosekcji do barwienia immunologicznego. Obie metody są wysoce powtarzalne i łatwo dostępne, pod warunkiem, że dostępny jest cytometr przepływowy i kriostat. Dla początkujących badaczy należy zwrócić uwagę, że w porównaniu ze śledzioną, całkowita wydajność komórek z PP jest stosunkowo niewielka. Niemniej jednak opisany przez nas protokół zazwyczaj daje od 0,8 do 1,2 x 1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Renjie Song (Wadsworth Center Flow Cytometry Core) za pomoc w analizie komórek oraz Helen Johnson (Wadsworth Center Animal Histopathology Core) za przygotowanie sekcji parafinowych. Dziękujemy dr Richardowi A. Cole'owi (Wadsworth Center Light Microscopy Core) za pomoc w mikroskopii konfokalnej i zbieraniu obrazów. Chcielibyśmy podziękować Andy'emu Bentleyowi (Wadsworth Center Photo and Illustration) za pomoc przy animacjach.

MDJ jest wspierany przez Fundację Badań nad Naukami Przyrodniczymi, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA jest wspierany przez stacjonarne stypendium podoktorskie Wadsworth Center-Health Research Inc. Prace te były częściowo wspierane przez granty NIH HD061916 i GM082978.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
OCT CompoundTissue-Tek4583
7x7x5 mm Formy bazoweFisherbrand22-363-552
Pióro ImmEdgeVector LabsH-4000
Prowadnice Superfrost PlusThermo Scientific4951
Ostrze Edge RiteThermo Scientific4280L
Anti-Mouse CD11c-PEeBioscience17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APCBD Pharmigen553092
Anti-Mouse CD3-FITCBD Pharmigen561798
Anti-Mouse
CD8-PEBD Pharmigen553032
Anti-Mouse CD19-PercPBioLegend115531
Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) bez czerwieni fenolowej Fisher Scientific14175-079
70 μ m Filtr siatkowy do komórekBD Falcon352350
Dysocjacja śledziony MediumStem Cell Technologies7915
Surowica kozia Invitrogen16210-072
Fc BlockATCC 2.4.G2HB-197Supes uzyskane z linii komórkowej 2.4.G2
Zakrzywione nożyceFST14061-09
Cryostat Leica3050S
FACS CaliburBD
Countess Licznik komórekInvitrogen
HematoxylinRichard Allan7211
EosinRichard Allan71304
FormalinStarplex Scientific3661

Tabela 1. Odczynniki i sprzęt użyte w tym badaniu.

Anti-Mouse CD4-PE BD Pharmigen 553652

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA's complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
  2. Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
  3. Rescigno, M., Sabatino, A. D. i Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
  4. Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
  5. Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer's patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
  6. Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
  7. Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer's Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
  8. Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer's patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
  9. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
  10. Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
  11. Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer's patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
  12. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer's Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225(2011).
  13. Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040(2012).
  14. Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer's patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

K czki Peyeraizolacja limfocyt wanaliza kom rek dendrytycznychcytometria przep ywowakriosiekizawiesina kom rkowaznakowanie przeciwcia amimikroskopia konfokalnaywotno kom rek

Powiązane artykuły