Artykuł metodologiczny

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/50176

⸱

1 marca 2013

 ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Translational Tissue Engineering Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczanie genów niewirusowych za pomocą nanocząsteczek polimerowych okazało się atrakcyjnym podejściem do terapii genowej w leczeniu chorób genetycznych1 oraz jako technologia dla medycyny regeneracyjnej2. W przeciwieństwie do wirusów, które mają poważne problemy z bezpieczeństwem, nanocząstki polimerowe mogą być zaprojektowane tak, aby były nietoksyczne, nieimmunogenne, niemutagenne, łatwiejsze do syntezy, wszechstronne chemicznie, zdolne do przenoszenia większych ładunków kwasów nukleinowych oraz biodegradowalne i/lub wrażliwe na środowisko. Polimery kationowe samoorganizują się z ujemnie naładowanym DNA poprzez oddziaływanie elektrostatyczne, tworząc kompleksy rzędu 100 nm, które są powszechnie nazywane nanocząstkami polimerowymi. Przykłady biomateriałów wykorzystywanych do tworzenia nanocząstek dostarczających geny polikationowe w skali nano obejmują polilizynę, polifosfoestry, poli(amidoaminy) i polietylenininę (PEI), która jest niedegradowalnym, gotowym do użycia polimerem kationowym powszechnie stosowanym do dostarczania kwasów nukleinowych1,3 . Poli(beta-aminoestry) (PBAE) są nowszą klasą polimerów kationowych4, które ulegają hydrolitycznie degradacji5,6 i wykazano, że są skuteczne w dostarczaniu genów do trudnych do transfekcji typów komórek, takich jak ludzkie komórki śródbłonka siatkówki (HREC)7, mysie komórki nabłonka sutka8, ludzkie komórki raka mózgu9 i komórki śródbłonka makronaczyniowe (ludzka żyła pępowinowa, HUVEC)10.

Opisano nowy protokół do charakteryzowania nanocząstek polimerowych za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). W tym podejściu uzyskuje się zarówno rozkład wielkości cząstek, jak i rozkład liczby plazmidów na cząstkę11. Ponadto przedstawiono wysokoprzepustowy test transfekcji 96-dołkowej na płytce do szybkiego badania przesiewowego skuteczności transfekcji nanocząstek polimerowych. W tym protokole poli(beta-aminoestry) (PBAE) są używane jako polimery modelowe, a ludzkie komórki śródbłonka siatkówki (HREC) są używane jako modelowe komórki ludzkie. Protokół ten można łatwo dostosować do oceny dowolnej nanocząstki polimerowej i dowolnego typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania w formacie płytki wielodołkowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie liczby plazmidów skompleksowanych na nanocząstkę jest ważne dla projektowania skutecznych strategii dostarczania genów opartych na nanocząstkach, szczególnie dla jednoczesnego dostarczania wielu plazmidów do tego samego celu komórkowego, co często jest wymagane w badaniach nad przeprogramowaniem komórek macierzystych12. Opisano kilka podejść do obliczania liczby plazmidów związanych z pojedynczą nanocząstką, a każde podejście ma wady w technikach stosowanych do szacowania13-16. Znakowanie kropkami kwantowymi (QD) w połączeniu z TEM wykorzystano do oszacowania plazmidów na cząstkę w nanocząstkach na bazie chitozanu. Oszacowanie za pomocą tej techniki QD jest skomplikowane ze względu na konieczność znakowania DNA, co może zmienić jego właściwości samoorganizacji; możliwość, że kapsułkowane nieznakowane DNA nie jest bezpośrednio wykrywane; potencjalnie nakładające się plazmidy i QD na obrazach 2D TEM cząstek; i inne upraszczające założenia13. Alternatywne podejście, które ma zastosowanie, gdy w cząstkach występują uporządkowane mikrodomeny, zostało wykorzystane do badania kompleksów lipopoliamina-DNA za pomocą kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM), rozpraszania promieniowania rentgenowskiego i dynamicznego rozpraszania światła (DLS)14,15 . Niestety, materiały takie jak badane tutaj nanocząstki polimerowe nie mają zastosowania w tej metodzie. W innym badaniu Collins i in. wykorzystali technikę analizy obrazu cząstek przepływowych do zbadania kompleksów peptyd/DNA zawierających (Lys)16; Jednak ich metoda może oceniać tylko większe cząstki o rozmiarach mikronów16. W związku z tym niedawno opracowaliśmy nowatorski i elastyczny test do ilościowego określania liczby plazmidów na nanocząstkę11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sadzenie komórek

  1. Nie pozwól, aby komórki rosły do nadmiernej konfluencji. Używaj komórek wczesnego pasażu podczas transfekcji komórek pierwotnych.
  2. Dwadzieścia cztery godziny przed transfekcją trypsynizuj komórki, policz komórki za pomocą hemocytometru i rozcieńcz zawiesinę komórek pożywką, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek (komórki/objętość). Komórki nasienne umieścić na przezroczystych, 96-dołkowych płytkach z płaskim dnem poddanych działaniu kultur tkankowych za pomocą zbiornika i pipet wielokanałowych. Wybrana gęstość powinna dawać 70-80% konfluencji w dniu transfekcji. Na przykład, jak pokazano w tabeli 1, komórki rozcieńczono do 25 do 50 komórek/μl dla danych transfekcji pokazanych tutaj.

2. Transfekcja komórek

  1. Rozcieńczanie zapasów polimerów i DNA. Rozmrażać roztwory podstawowe polimerów i DNA w temperaturze pokojowej (RT). Rozcieńczyć podstawowy roztwór polimeru i podstawowy roztwór DNA, oddzielnie na przezroczystych 96-dołkowych płytkach, używając pipety dwunastokanałowej, odpowiednim rozpuszczalnikiem do stężeń wymaganych do uzyskania pożądanego stosunku masy polimeru do masy DNA (wag/wag.). W tym przypadku wybranym rozpuszczalnikiem jest 25 mM bufor octanu sodu (pH = 5,2).
    1. Rozcieńczenie DNA. Zazwyczaj DNA przechowywane w stężeniu 1 mg/ml rozcieńcza się w buforze octanu sodu do stężenia od 0,03 do 0,06 mg/ml na przezroczystej 96-dołkowej płytce bez hodowli tkankowej (jedna studzienka dla pojedynczego preparatu). Tabela 2 przedstawia typowy protokół rozcieńczania DNA dla pojedynczego preparatu stosowanego do transfekcji czterech dołków replikowanych w 96-dołkowej płytce wysianej komórkami z Kroku 1.
    2. Rozcieńczenie polimeru. Roztwór polimeru/DMSO o stężeniu 100 mg/ml rozcieńcza się w buforze octanu sodu zgodnie ze stężeniem wymaganym do uzyskania pożądanego stosunku wag. polimeru do DNA. Zakres stosunków wagowych / wagowych zwykle stosowanych do dostarczania genów z poli(beta-estrami) (PBAE) wynosi od 20 do 100. Polimery PBAE najpierw rozcieńcza się do 10 mg/ml, a następnie stosuje się protokół rozcieńczania, jak pokazano w tabeli 3. Rozcieńczenia polimeru można przeprowadzić na przezroczystej, 96-dołkowej płytce bez hodowli tkankowej, która odpowiada orientacji próbki płytki rozcieńczającej DNA.
  2. Powstawanie nanocząstek. Dodać roztwór PBAE do równej objętości roztworu plazmidowego DNA za pomocą dwunastokanałowej pipety i energicznie wymieszać. Pozostaw mieszaninę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić samodzielny montaż.
  3. Transfekcja nanocząstek. Po samoorganizacji 20 μl nanocząstek jest dodawanych kroplami do pożywki hodowlanej za pomocą dwunastokanałowej pipety. Studzienki replikowane pozostawia się bez obróbki lub transfekuje się je dostępnymi w handlu odczynnikami jako kontrolą. Transfekowane komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez dwie do czterech godzin, a następnie studzienki zastępuje się świeżymi pożywkami (100 μl/dołek). Wybór czasu inkubacji będzie zależał od linii komórkowej, warunków hodowli i systemu transfekcji. Różnica w skuteczności transfekcji i toksyczności komórkowej wynikająca z różnych okresów inkubacji zostanie określona ilościowo za pomocą protokołu analizy opisanego w kroku 3.

3. Analiza skuteczności transfekcji i toksyczności komórek

Efektywność transfekcji jest analizowana wizualnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określana ilościowo za pomocą cytometru przepływowego czterdzieści osiem godzin po transfekcji. Toksyczność komórek jest analizowana wizualnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i oznaczana ilościowo za pomocą testu CellTiter 96 AQueous One dwadzieścia cztery godziny po transfekcji.

  1. Mikroskopia fluorescencyjna. Przeanalizuj wizualnie studzienki pod kątem ekspresji transfekowanego genu reporterowego (na przykład EGFP lub DsRed) przy użyciu odpowiedniego kanału fluorescencyjnego. Zdobądź obrazy dla każdego dołka, wybierając pola widzenia, które odpowiednio reprezentują skuteczność transfekcji dla poszczególnych preparatów (rysunek 1). Zanotuj wszelkie zaobserwowane wizualnie objawy toksyczności komórek.
  2. Cytometria przepływowa.
    1. Użyj pipet wielokanałowych, aby przygotować 96-dołkową płytkę do cytometrii przepływowej. Przemyć PBS, trypsynizować 30 μl/basenik trypsyny/EDTA, zneutralizować 170 μl buforu FACS (PBS + 2% FBS), pipetować w górę i w dół w każdym dołku, w tym wokół krawędzi, i przenieść całą objętość 200 μl z każdej studzienki do odpowiednich dołków w 96-dołkowej płytce okrągłodennej lub V-dolnej.
    2. Odwirować płytkę o sile 130 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Usuń 170 μl pożywki z każdej studzienki i odpipetuj w celu ponownego zawieszenia komórek, unikając pęcherzyków. Aby użyć barwnika żywotności, takiego jak jodek propidyny (PI), dodaj 10 μl buforu FACS + PI (rozcieńczenie buforu FACS 50:1 PI; Stężenie PI 1 mg/ml) do każdej studzienki. Natychmiast umieść na lodzie i przykryj przed światłem.
    4. Uruchom cytometr przepływowy C6 Accuri, nasadkę HyperCyt 96-dołkową i oprogramowanie HyperView. Użyj kart HyperView Design (Projekt) i Protocol (Protokół), aby wybrać odpowiedni typ płytki, układ płytki i inne ustawienia, takie jak czas potrząsania/popijania/płukania/wstrząsania. Dla powyższego protokołu zastosowano następujące parametry: wstępne zalewanie płytki przez jedną minutę i wstrząsanie przed płytką przez 30 sekund przy 2,400 obr./min. Czas łykania ustalono na 15 sekund przy 15 obr./min, sondę płukano co 2 sekundy przez 2 sekundy, a co 12 dołków wytrząsano przez 12 sekund przy 2,400 obr./min. Wytrząsanie między dołkami jest ważne, aby utrzymać komórki rozproszone w pożywce, a także dla poprawy zdolności do przetwarzania danych poprzez uwzględnienie przerw czasowych między grupami studzienek (w tym przypadku 12 sekund).
    5. Użyj karty Identyfikacja studni HyperView, aby przetworzyć dane i rozdzielić je do odpowiedniego dołka (Rysunek 2). W celu zidentyfikowania poszczególnych studni pomocne może być użycie filtra szumów oprogramowania, a także dołączenie podstawowego filtra równomiernego w ustawieniach zaawansowanych.
    6. Określ ilościowo procent dodatnio transfekowanych żywych komórek poprzez odpowiednie bramkowanie w celu oddzielenia różnych populacji (ryc. 3). Najpierw wyświetl dane dotyczące przepływu w FSC vs. Wykres punktowy SSC w celu oddzielenia komórek od zanieczyszczeń (rysunek 3A). Jeśli użyto jodku propidyny (PI), należy przebramować pojedynczą populację komórek i wyświetlić te dane na wykresie FSC w porównaniu z FL3 w celu oddzielenia żywych komórek od martwych komórek i bramki żywych komórek. Aby określić ilościowo liczbę transfekowanych komórek, należy wyświetlić populację żywych komórek na odpowiednich kanałach, na przykład GFP można zobaczyć w FL1. Korzystając z populacji nieleczonej, bramkują nieleczone komórki w celu zidentyfikowania sygnału tła (ryc. 3B). Dodatnio transfekowane komórki można następnie wyizolować za pomocą tej bramki i przeglądając transfekowane populacje za pomocą wykresów rozproszonych i konturowych (ryc. 3C i 3D). Może istnieć kontinuum dodatnio transfekowanych komórek, ponieważ różne komórki będą transfekowane do różnych stopni fluorescencji.
  3. Miano komórkowe 96 AQueous One test
    1. Transfekować inną płytkę dokładnie w ten sam sposób do pomiarów toksyczności komórek.
    2. Zmieszać 1 ml roztworu testowego CellTiter 96 AQueous One z 10 ml świeżej pożywki. Usuń pożywkę z komórek i za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 110 μl wstępnie zmieszanego roztworu + pożywki na dołek.
    3. Mierzyć absorbancję przy długości fali 490 nm co godzinę w odstępach od 1 do 4 godzin, aż do momentu, gdy absorbancja z dołka bez poddawania działaniu środka znajdzie się w liniowym zakresie testu. Dołącz cztery studzienki kontrolne tylko z roztworem + pożywką do odczytu absorbancji tła.
    4. Uśrednić wartości absorbancji z czterech dołamków replik dla każdego warunku i odjąć średnią absorbancję tła od każdej średniej. Znormalizuj skorygowaną średnią dla każdego leczonego schorzenia do skorygowanej średniej dla nieleczonego stanu, aby określić procent żywotności komórek.

4. Wymiarowanie nanocząstek za pomocą obliczeń NTA i plazmidu na cząstkę

  1. Zalać układ fluidyczny Nanosight NS500, uruchamiając pompę rozcieńczalnika do przodu z około 1/5 maksymalnej prędkości, a pompę próbki do tyłu z około 1/10 maksymalnej prędkości. Kontynuuj, aż układ fluidyki zostanie przepłukany rozcieńczalnikiem.
  2. Przygotuj nanocząstki do analizy. W przypadku PBAE oddzielnie rozcieńczyć podstawowy plazmidowy DNA (1 mg/ml) i podstawowy PBAE (100 mg/ml) w buforze octanu sodu (25 mM, pH 5) w probówkach Eppendorfa.
  3. Rozcieńczyć stężenie plazmidowego DNA do 0,06 mg/ml. Stężenie polimeru może się różnić w zależności od wymaganego stosunku masy do masy polimeru do DNA (na przykład dla cząstek o masie 60 wag./wt polimer rozcieńcza się do 3.6 mg/ml).
  4. Dodaj roztwór polimeru do równej objętości roztworu plazmidowego DNA i energicznie wymieszaj. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić samodzielny montaż.
  5. Rozcieńczyć roztwór nanocząstek 100-krotnie do PBS, aby stężenie nanocząstek mieściło się w odpowiednim zakresie dla NTA i aby uzyskać końcową objętość co najmniej 500 μl.
  6. Załaduj próbkę do Nanosight, umieszczając rurkę ładującą w sample probówce Eppendorfa (Rysunek 4A). Uważaj, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza.
  7. W trybie przechwytywania zwiększaj poziom kamery, aż będzie można zobaczyć cząsteczki. Dostosuj ostrość tak, aby cząstki wyglądały na gładkie (Rysunek 4A i 4B).
  8. W trybie standardowym dostosuj poziom kamery do punktu, w którym wszystkie cząsteczki są widoczne na ekranie. Następnie zmniejsz poziom kamery do najniższego poziomu, tak aby wszystkie cząstki mogły być nadal obserwowane. Jeśli potrzebny jest pośredni poziom kamery, przejdź do trybu zaawansowanego i zmodyfikuj migawkę aparatu oraz wzmocnienie do odpowiednich poziomów.
  9. Sprawdź wzrokowo, czy na ekranie znajduje się od 20 do 100 cząstek. Idealna liczba do śledzenia nanocząstek to około 50 cząstek. Jeśli jest za dużo lub za mało, przepłukać NS500, dostosować rozcieńczenie do PBS i ponownie załadować próbkę.
  10. Dostosuj czas przechwytywania zgodnie z tabelą trybów standardowych. Zazwyczaj 30–60 sekund to odpowiednia długość przechwytywania (Rysunek 4B).
  11. Aby załadować następną próbkę, przepłucz system, a następnie ponownie załaduj nową próbkę.
  12. Po przechwyceniu filmów przejdź do etapu przetwarzania, otwierając plik wideo.
  13. Istnieje szereg parametrów, które można dostroić, aby jak najlepiej przetworzyć obraz wideo (Rysunek 4C). Celem jest wybranie parametrów, które najlepiej wychwytują każdą cząstkę na ekranie, zgodnie z czerwonym krzyżykiem na ekranie nad każdą cząstką (rysunek 5).
  14. Zwiększ zysk ekranu, aby lepiej widzieć cząsteczki. W trybie standardowym lub zaawansowanym wybierz automatyczną regulację parametrów, klikając odpowiednie pola. W przypadku, gdy ustawienia automatyczne nie wybierają odpowiednio cząstek, odznacz pole i ręcznie ustaw parametry (Rysunek 4C).
  15. Gdy wszystkie cząstki zostaną wybrane na ekranie, kliknij przycisk procesu w oprogramowaniu, aby przetworzyć plik wideo (Rysunek 4C). Zapewnia to rozkład wielkości cząstek, średnie wielkości oraz stężenie cząstek.
  16. Aby upewnić się, że stężenie cząstek jest dokładne, zmień rozcieńczenie PBS, na przykład zwiększając rozcieńczenie 2x, i powtórz powyższą procedurę. Zaleca się pomiar wielokrotnych rozcieńczeń tej samej próbki w celu zapewnienia dokładności pomiaru stężenia próbki. Dobry zakres do pomiaru to 107-10 9 cząstek/ml.
  17. Sprawdź, czy wszystkie plazmidy są włączone do nanocząstek, przeprowadzając elektroforezę żelową nanocząstek i oceniając, czy obecne jest wolne DNA. Jeśli nie wszystkie plazmidy są otorbione, należy użyć standardowych technik do pomiaru absorbancji DNA w celu ilościowego określenia całkowitej liczby plazmidów otoczonych kapsułkami.
  18. Aby obliczyć średnią liczbę plazmidów na cząstkę, podziel całkowite stężenie plazmidu w kapsułkach przez stężenie cząstek zmierzone przez NTA. Aby oszacować rozkład plazmidu na próbkę cząstki, najpierw użyj histogramu wielkości cząstek NTA, aby obliczyć udział objętościowy każdego pojemnika cząstki o długości 1 nm. Pomnóż ten rozkład ułamka objętościowego przez całkowitą ilość plazmidu, aby uzyskać liczbę plazmidów w każdym pojemniku. Podziel te liczby przez liczbę cząstek w każdym pojemniku, aby uzyskać liczbę plazmidów na cząstkę dla każdej wielkości cząstek (rysunek 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający przykład udanej transfekcji HREC za pomocą plazmidu EGFP. Obraz w jasnym polu jest pomocny w zapewnieniu, że komórki zachowują swoją zwykłą morfologię. Ponadto do oceny toksyczności nanocząstekmożna wykorzystać testy żywotności komórek, takie jak MTS lub podobne testy. Cytometria przepływowa, zgodnie z opisem, może być wykorzystana do ilościowego określenia wydajności transfekcji. W przypadku korzystania z przystawki do pł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższe protokoły opisują metody oceny skuteczności transfekcji preparatów nanocząstek, a także sposób charakteryzowania wielkości cząstek i obciążenia DNA nanocząstek. Liczba plazmidów na cząstkę jest ważnym parametrem, który może pomóc w przewidywaniu skuteczności cząstki i może być również wykorzystany do określenia dawki. Analizę śledzenia nanocząstek można przeprowadzić w wielu różnych roztworach wodnych, takich jak roztwory różniące się stężeniem soli. Często ta charakterystyka jest wykonywana w PBS, aby naśladowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) i NIH R21CA152473 za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, 1x (PBS)Invitrogen10010
EGM-2MV BulletKitLonzaCC-3202
TrypsynaInvitrogen25300
Bufor octanu soduSigma-AldrichS7899Rozcieńczyć do 25mM w wodzie dejonizowanej
Dimetylosulfotlenek dimetyluSigma-Aldrich276855
pEGFP DNAElim BiopharmaceuticalsNA
DsRed DNAAddgene21718
PEI, rozgałęziony Sigma-Aldrich408727
CellTiter 96 AQueous OnePromegaG3580
Materials
Clear flat bottom 96-well płytka, sterylnaSarstedt82.1581.001
Przezroczysta okrągłodenna płytka 96-dołkowa, sterylnaSarstedt82.1582.001
12-kanałowa pipeta FinnpipetteThermo ScientificNA5-50 i 50-300 μ l
Mikroskop fluorescencyjnyZeissNANumer modelu: AX10
C6 Cytometr przepływowy AccuriBD BiosciencesNA
PrzystawkaHyperCyt IntellicytNA
NS500NanosightNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
  2. Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
  3. Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
  4. Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
  5. Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
  6. Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
  7. Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
  8. Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
  9. Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
  10. Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947(2009).
  11. Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
  12. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  13. Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
  14. Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
  15. Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
  16. Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
  17. Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Polymeric NanoparticlesGene DeliveryNanoparticle Tracking AnalysisHigh throughput Flow CytometryParticle Size DistributionTransfection EfficiencyHuman Retinal Endothelial CellsPoly beta amino ester sPlasmid Per ParticleBiodegradable Polymers

Powiązane artykuły