Implantacja komórek nowotworowych do narządu pochodzenia może służyć jako użyteczny model przedkliniczny do oceny nowych terapii. Komórki raka pęcherza moczowego MB49 mogą być hodowane w pęcherzu moczowym po wkropleniu dopęcherzowym. Protokół ten demonstruje cewnikowanie pęcherza myszy w celu implantacji guza i dostarczenia adenowirusa.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rak pęcherza moczowego jest drugim najczęściej występującym nowotworem układu moczowo-płciowego i potrzebne są nowatorskie podejścia terapeutyczne, które mogą zmniejszyć nawroty i progresję. Mikrośrodowisko guza może znacząco wpływać na rozwój guza i odpowiedź na terapię. Dlatego często pożądane jest hodowanie komórek nowotworowych w narządzie, z którego pochodzą. Protokół ten opisuje ortotopowy model raka pęcherza moczowego, w którym komórki mysiego raka pęcherza moczowego MB49 są wkraplane do pęcherza moczowego poprzez cewnikowanie. Udana implantacja komórek nowotworowych w tym modelu wymaga przerwania ochronnej warstwy glikozaminoglikanu, co można osiągnąć za pomocą środków fizycznych lub chemicznych. W naszym protokole pęcherz moczowy jest leczony trypsyną przed wkropleniem komórek. Cewnikowanie pęcherza moczowego może być również stosowane do dostarczania leków po ustaleniu guzów. Protokół ten opisuje dostarczenie konstruktu adenowirusowego, który wyraża gen reporterowy lucyferazy. Chociaż nasz protokół został zoptymalizowany pod kątem badań krótkoterminowych i koncentruje się na dostarczaniu genów, metodologia cewnikowania pęcherza moczowego u myszy ma szerokie zastosowanie.
Wprowadzenie
Rak pęcherza moczowego jest drugim najczęściej występującym nowotworem układu moczowo-płciowego, z prawie 75 000 nowych przypadków i 15 000 zgonów spodziewanych w 2012 roku1. Wysokie wskaźniki nawrotów wymagają obserwacji przez całe życie, co sprawia, że rak pęcherza moczowego jest jednym z najdroższych nowotworów w leczeniu. Rak pęcherza moczowego, który zaatakował warstwę mięśniową, może dawać przerzuty do wątroby, płuc lub kości przez układ limfatyczny. Multimodalna terapia zaawansowanych nowotworów daje tylko 20-40% przeżycia po 5 latach. Dlatego pilnie potrzebne są skuteczne strategie leczenia mające na celu ograniczenie nawrotów i progresji powierzcho....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny. Protokół został zatwierdzony w kategorii D USDA dla bólu.
1. Implantacja komórek
- Dwa dni przed wykonaniem zabiegu należy umieścić 1 x 106 komórek MB49 w kolbach T-25. Stosuj DMEM o wysokim poziomie glukozy uzupełniony 10% FBS (i antybiotykami, jeśli jest to pożądane). Jedna kolba wystarcza na każdą grupę do pięciu myszy, które zostaną znieczulone i wszczepione równolegle.
- W dniu zabiegu należy przygotować trypsynę do infuzj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Hematuria jest obserwowana u niemal wszystkich myszy w ciągu 8 dni po implantacji 200 000 komórek MB49. Jak pokazano na Rysunku 1, masa pęcherza zwiększa się ponad dwukrotnie – z 34,7±3,3 mg (zakres 31-37 mg, n=4) u myszy bez guzów do 87,5±19,2 mg (zakres 77-120 mg, n=10) u myszy z implantowanymi komórkami MB49. W odniesieniu do dostarczania genów stwierdzono, że obrazowanie myszy 24 h po instylacji wirusa daje silniejszy sygnał niż po 48 h (Rysunek 2). Dostarczanie adenowirusowe wykazuj.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podstawową metodologią opisaną w tym protokole jest cewnikowanie pęcherzy moczowych myszy, które ma szerokie zastosowanie do wkraplania komórek lub dowolnego środka przeznaczonego do miejscowego dostarczania do nabłonka pęcherza moczowego. Konkretny protokół opisany powyżej został zoptymalizowany pod kątem badań krótkoterminowych (~10 dni). Wszczepienie dokładnej liczby komórek ma kluczowe znaczenie, ponieważ wyższa liczba komórek spowoduje szybszy wzrost guza i prawdopodobnie utratę zwierząt z powodu dużego obciążenia g.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH R21 CA143505 do Christiny Voelkel-Johnson.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nazwa odczynnika | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
| 6-8 tygodniowe samice myszy | Jackson Laboratories | Nazwa szczepu: C57BL/6J Numer katalogowy: 000664 | |
| Trypsin* | MediaTech | MT25-053-CI | Uzyskany za pośrednictwem Fisher |
| DMEM* | MediaTech MT10-017-CV | Uzyskany za pośrednictwem Fisher | |
| FBS | Hyklon | SH30071.03 | Inaktywowany termicznie |
| T25* | Corning Costar | Nr Corning: 3056 Fisher: 07-200-63 | > Otrzymywany przez komórki Fisher |
| MB49 | N/A | N/A | Uzyskany od dr Boehle (patrz odniesienie11) |
| Puralube Vet Maść* | Pharmaderm | Henry Schein Company Nr p:036090-6050059 Fisher: NC9676869 | Uzyskany za pośrednictwem Fisher |
| Krem do depilacji: Veet | lokalna apteka | ||
| Smar: K-Y Jelly | apteka lokalna | ||
| Cewniki* | Exel International | Exel International Nie:26751; Fisher: 14-841-21 | > Uzyskany przez Fisher |
| Isoflurane | Terrell | NDC 66794-011-25 | Uzyskany przez aptekę szpitalną |
| 1 ml strzykawki gruźlicy z końcówką ślizgową | Becton Dickinson | BD309659 Fisher:14-823-434 | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnologies | L-123-1 | |
| Ad-CMV-Luc | VectorBiolabs | 1000; Poproś o amplifikację na dużą skalę i oczyszczanie CsCl do stosowania in vivo | Czynnik zakaźny wymagający hermetyzacji BSL2 |
| Steady-Glo System testowy lucyferazy | Promega | E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) lub E2550 (10 x 100 ml) | |
*dostępny u wielu dostawców | |||
EQUIPMENT | |||
| system anestezjologiczny | E-Z Systems, Euthanex Corporation | System anestezjologiczny: 5-portowe urządzenie do oddychania myszą EZ7000 p: EZ109 | Uzyskane przez Fisher |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm | |
| FLUOstar Optima | BMG Labtech | http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2 |
Bibliografia
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2012. CA Cancer. J. Clin. 62 (1), 10-29 (2012).
- Seager, C. M., Puzio-Kuter, A. M., et al. Intravesical delivery of rapamycin suppresses tumorigenesis in a mouse model of progressive bladder cancer. Canc....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
