Zmiany w kurczliwości mięśni kończyn i pasywnych właściwościach mechanicznych są ważnymi biomarkerami chorób mięśni. W tym manuskrypcie opisano testy fizjologiczne do pomiaru tych właściwości w mysich mięśniach prostownika długiego palca długiego i piszczelowych przednich.
Artykuł metodologiczny
Ocena funkcji mięśni mięśnia prostownika długiego mięśnia ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ruchy ciała są głównie zapewniane przez mechaniczną funkcję mięśni szkieletowych. Mięśnie szkieletowe składają się z licznych wiązek włókien mięśniowych, które są osłonięte śródmięśniowymi tkankami łącznymi. Każde włókno mięśniowe zawiera wiele miofibryli, które biegną podłużnie wzdłuż włókna mięśniowego. Miofibryle są aparatem kurczliwym mięśni i składają się z powtarzających się jednostek kurczliwych znanych jako sarkomery. Jednostka sarkomerowa zawiera włókna aktyny i miozyny, które są oddalone od siebie o krążki Z i białko tytyny. Mechaniczna funkcja mięśni szkieletowych jest definiowana przez kurczliwe i bierne właściwości mięśni. Właściwości kurczliwe służą do scharakteryzowania wielkości siły generowanej podczas skurczu mięśni, czasu wytwarzania siły i czasu rozluźnienia mięśni. Każdy czynnik wpływający na skurcz mięśni (taki jak interakcja między filamentami aktyny i miozyny, homeostaza wapnia, stosunek ATP / ADP itp.) wpływa na właściwości skurczowe. Właściwości pasywne odnoszą się do właściwości elastycznych i lepkich (sztywność i lepkość) mięśnia przy braku skurczu. O właściwościach tych decydują zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe składniki strukturalne (takie jak tytyna) oraz tkanki łączne (głównie kolagen) 1-2. Właściwości kurczliwe i pasywne to dwa nierozłączne aspekty funkcjonowania mięśni. Na przykład zgięcie łokcia odbywa się poprzez skurcz mięśni w przedniej części ramienia i bierne rozciąganie mięśni w tylnej części ramienia. Aby naprawdę zrozumieć funkcję mięśni, należy zbadać zarówno właściwości skurczowe, jak i pasywne.
Kurczliwe i/lub pasywne właściwości mechaniczne mięśni są często zagrożone w chorobach mięśni. Dobrym przykładem jest dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), ciężka choroba zaniku mięśni spowodowana niedoborem dystrofiny 3. Dystrofina jest białkiem cytoszkieletu, które stabilizuje błonę komórek mięśniowych (sarcolemma) podczas skurczu mięśni 4. W przypadku braku dystrofiny sarcolemma jest uszkadzana przez siłę ścinającą wytwarzaną podczas przenoszenia siły. To rozerwanie błony inicjuje reakcję łańcuchową, która prowadzi do śmierci komórek mięśniowych i utraty maszynerii skurczowej. W konsekwencji siła mięśniowa zostaje zmniejszona, a martwe włókna mięśniowe są zastępowane tkankami zwłóknieniowymi 5. Ta późniejsza zmiana zwiększa sztywność mięśni 6. Dokładny pomiar tych zmian stanowi ważną wskazówkę do oceny postępu choroby i określenia skuteczności terapeutycznej nowych interwencji genowych/komórkowych/farmakologicznych. W tym miejscu przedstawiamy dwie metody oceny zarówno kurczliwych, jak i biernych właściwości mechanicznych mięśnia prostownika długiego palca (EDL) oraz właściwości kurczliwych mięśnia piszczelowego przedniego (TA).
Protokół
1. Ocena kurczliwości i pasywnych właściwości mięśnia EDL ex vivo
Kurczliwe i pasywne właściwości mięśnia EDL są mierzone ex vivo za pomocą systemu testów in vitro in vitro Aurora Scientific. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z materiałami i wyposażeniem.
1.1 Przygotowanie sprzętu
- Zmontuj kąpiel tkankowo-narządową, mocując rurkę tlenową do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym. Przymocuj zmontowaną wannę do aparatu do montażu mięśni. Podłącz przewód gazowy do rurki tlenowej. Przymocuj przewody cyrkulacyjne wody do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym i umieść zawór iglicowy w odpływie wanny.
- Włączyć łaźnię wodną obiegową i ustawić temperaturę na 30 °C 7. Pozwól, aby 5 PSI (funtów na cal kwadratowy) 95% O2-5% CO2 przepłynęło przez rurkę tlenową. Napełnij wannę buforem Ringera. Równoważyć bufor przez co najmniej 10 minut ze stałym przepływem gazu, regulując zawór tlenowowy.
- Włącz instrumenty (stymulator, system dźwigni dwutrybowych i interfejs sygnału). Załaduj oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni (DMC) zgodnie z instrukcją producenta.
1.2 Rozwarstwienie mięśni EDL
Wszystkie badania na zwierzętach muszą być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.
- Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 2,5 μl/g masy ciała koktajlu znieczulającego (patrz rozdział dotyczący materiałów). Przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego sprawdzano głębokość sedacji poprzez wykonanie uszczypnięcia palca u nogi. Suplement w wysokości 10% początkowej dawki znieczulenia jest podawany, gdy jest to konieczne, aby utrzymać zwierzę w znieczuleniu. Ogol tylną kończynę. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C przed zabiegiem sekcji, umieszczając mysz na poduszce grzewczej. Temperatura ciała jest monitorowana poprzez ciągły pomiar temperatury w odbycie za pomocą sondy termicznej.
- Umieść mysz na wznak na desce preparacyjnej (Rysunek 1). Zdejmij skórę nóg, aby odsłonić mięśnie kończyn tylnych. Zabezpiecz nogę na bloku sylgardowym za pomocą dwóch kołków krawieckich, jednego w stopie, a drugiego w mięśniu gracilis. Umieść lampę grzewczą nad korpusem myszy, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Stale łącz wszystkie odsłonięte mięśnie za pomocą bufora Ringera. Spuść nadmiar buforu przez przewód próżniowy.
- Odsłoń dystalne ścięgno TA i więzadło prostownika pod mikroskopem stereoskopowym, preparując skórę w kierunku stopy. Delikatnie zdejmij powięź pokrywającą mięsień TA. Przetnij więzadło prostownika, aby zwolnić dystalne ścięgno TA.
- Przetnij dystalne ścięgno TA i użyj go do odklejenia mięśnia TA. Ostrożnie usuń mięsień TA w jego bliższym przyczepie. Umieść cienki kawałek bawełny nasączonej buforem Ringera obok mięśnia EDL, aby wchłonąć krwawienie spowodowane pęknięciem układu naczyniowego mięśnia TA. Użyj przewodu próżniowego, aby usunąć nadmiar buforu i krwi.
- Zawiąż podwójne kwadratowe węzły, a następnie węzeł pętelkowy za pomocą nici chlebowej na połączeniu ścięgien mięśniowych (MTJ) dystalnego mięśnia EDL (ryc. 2). Wykonaj nacięcie w dystalnej części mięśnia dwugłowego uda, aby odsłonić proksymalny mięsień EDL. Powtórz ten sam zestaw węzłów (ryc. 2) w MTJ bliższego ścięgna EDL. Przymocuj hak ramienia dźwigni do bliższego lub dystalnego węzła za pomocą podwójnego węzła kwadratowego, używając tej samej linii szwów. Odetnij pozostałą linię szwów.
- Przeciąć proksymalne ścięgno EDL powyżej bliższego węzła szwu. Podnieś mięsień EDL za pomocą haczyka i przetnij naczynia krwionośne pod mięśniem. Przeciąć dystalne ścięgno EDL poniżej dystalnego węzła szwu, aby usunąć mięsień EDL z kończyny tylnej. Przykryj odsłoniętą tylną kończynę kawałkiem bawełny nasączonej buforem Ringera.
- Przymocuj hak do ramienia dźwigni. Ustaw mięsień pionowo między dwiema elektrodami. Przymocuj dystalną linię szwu do stałego słupka. Podnieś kąpiel tkankową, aby zanurzyć mięsień w buforze Ringera. Dostosuj napięcie spoczynkowe do 1,0 g za pomocą podwójnego stopnia zgrubnego/drobnego translacji i pozwól mięśniom zrównoważyć się przez co najmniej 10 minut.
1.3 Pomiar kurczliwości i pasywnych właściwości mięśnia EDL
Użyj Tabeli 2, aby ustawić parametry w oprogramowaniu DMC dla każdego z poniższych pomiarów. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do dynamicznej analizy mięśni (DMA).
1.3.1 Pomiar kurczliwości mięśnia EDL
- Stymuluj mięsień EDL trzy razy przy 150 Hz w odstępie 60 sekund, aby ustabilizować mięsień 8.
- Stymuluj mięsień EDL przy różnych napięciach spoczynkowych, aby określić optymalną długość (Lo). Optymalna długość to długość, przy której mięsień rozwija maksymalne napięcie skurczowe. Pozwól mięśniom się rozluźnić przez 2 minuty.
- Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo. Zmierz siłę mięśni przy stymulacji pojedynczego skurczu. Określ bezwzględną siłę drgania (Pt), czas do osiągnięcia szczytowego napięcia (TPT) i czas połowy relaksacji (1/2 RT) Pt. Pozwól mięśniowi rozluźnić się przez 2 minuty.
- Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo. Zmierz siłę mięśni tężcowych generowaną przy różnych częstotliwościach stymulacji (50, 80, 100, 120, 150 i 200 Hz). Określ bezwzględną maksymalną siłę mięśnia tężcowego (Po), w której siła mięśni osiąga maksymalną. Zmierz TPT i 1/2 RT Po 9.
- Pozwól mięśniowi rozluźnić się przez 5 minut. Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo. Zastosuj 10 cykli skurczów ekscentrycznych z 2-minutowym odpoczynkiem między cyklami. Oblicz względną utratę siły Po po każdym cyklu skurczu mimośrodowego.
- Odłącz mięsień EDL od aparatu i przetnij ścięgna w miejscu szwu. Określić mokrą masę mięśni i obliczyć pole przekroju poprzecznego mięśni (CSA) 6,10.
1.3.2 Pomiar pasywnych właściwości mięśnia EDL
- Wypreparować mięsień EDL po lewej stronie i przymocować go do aparatu, jak opisano w sekcji 1.2, kroki od 2 do 7.
- Poddaj mięsień EDL sześciostopniowemu protokołowi rozciągania, w którym mięsień jest napięty do 160% Lo z przyrostem 10% Lo. Przeanalizuj profil naprężenie-odkształcenie 6.
- Oceń lepkość mięśnia EDL, mierząc szybkość relaksacji stresu (SRR) w następujących przedziałach czasowych po rozciągnięciu i utrzymaniu mięśnia na poziomie 10% Lo: od szczytu do 0,1 s po szczycie (pp), od 0,1 do 0,2 s pp, od 0,2 do 0,5 s pp, od 0,5 do 1 s pp i od 1 do 1,5 s pp.
- Pod koniec badania należy poddać mysz eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy i/lub ścięcie, gdy mysz jest jeszcze pod narkozą. Odłącz mięsień EDL od aparatu i przetnij ścięgna w miejscu szwu. Określić mokrą masę mięśni i obliczyć pole przekroju poprzecznego mięśni (CSA) 6,10.
2. Ocena właściwości kurczliwych mięśnia TA in situ
Właściwości kurczliwe mięśnia TA są mierzone za pomocą systemu testów mięśniowych in situ Aurora Scientific. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z materiałami i wyposażeniem.
2.1 Przygotowanie sprzętu
- Podgrzać temperaturę zwierzęcia do temperatury 37 °C za pomocą obiegowej łaźni wodnej.
- Włącz instrumenty (stymulator, system dźwigni dwutrybowych i interfejs sygnału). Załaduj oprogramowanie DMC zgodnie z instrukcjami producenta.
2.2 Przygotowanie mięśnia TA do pomiaru siły in situ
- Znieczulić mysz, ogolić tylną kończynę i odsłonić mięsień TA, jak opisano w krokach od 1 do 3 w punkcie 1.2.
- Zawiąż podwójny kwadratowy węzeł wokół więzadła rzepki za pomocą jedwabnego szwu chlebowego. Zawiąż podwójny węzeł kwadratowy, a następnie węzeł pętlowy w MTJ dystalnego mięśnia TA (ryc. 2), zawiąż kolejny podwójny węzeł kwadratowy, pozostawiając pętlę ~10 mm od dystalnego węzła ścięgna TA, używając tej samej linii szwu. Umieść drugi podwójny kwadratowy węzeł z boku pętli.
- Usuń szpilki z tylnej kończyny i ustaw zwierzę na brzuchu. Odsłoń mięsień dwugłowy uda. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić nerw kulszowy. Zawiąż podwójny kwadratowy węzeł wokół bliższego końca nerwu kulszowego. Przytnij jedną stronę linii szwów i przetnij nerw powyżej węzła. Delikatnie pociągnij nerw kulszowy w kierunku kolana za pomocą linii szwów i oczyść otaczającą tkankę łączną, aby uwolnić ~ 5 mm jej długości. Nie rozciągaj nerwu podczas tej procedury i stale przeraź nerw za pomocą bufora dzwonka.
- Przygotuj przeciwległy mięsień TA zgodnie z opisem w krokach od 1 do 3. Przykryj jedną z odsłoniętych tylnych kończyn kawałkiem bawełny nasączonej buforem Ringera. Stale zlewaj obie tylne kończyny za pomocą wstępnie rozgrzanego (37 °C) bufora Ringera. Usuń nadmiar buforu przez przewód próżniowy.
- Ustaw zwierzę leżące na brzuchu na platformie dla zwierząt. Przymocuj uchwyt zacisku kolanowego do platformy dla zwierząt i przymocuj oba kolana do metalowego kołka za pomocą podwójnych kwadratowych węzłów za pomocą linii szwów więzadła rzepki. Przypnij obie stopy do bloku sylgardowego za pomocą szpilek krawieckich. Przymocuj platformę dla zwierząt do stolika sterowanego termicznie. Ustawić lampę grzewczą tak, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C.
- Przymocuj uchwyt elektrody do platformy dla zwierząt i połóż nerw kulszowy na elektrodzie za pomocą linii do szycia. Trzymaj elektrodę z dala od mięśni kończyn tylnych. Przeciąć dystalne ścięgno TA odsłoniętej kończyny tylnej w miejscu szwu MTJ. Przymocuj pętlę szwów dystalnego ścięgna TA do haka ramienia dźwigni. Przykryj odsłonięty mięsień kończyny tylnej ciepłą bawełną nasączoną buforem Ringera.
2.3 Pomiar właściwości kurczliwych mięśnia TA
- Tabela 2 służy do ustawiania parametrów w oprogramowaniu DMC. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, co opisano w sekcji 1.3.1, aby określić właściwości skurczowe mięśnia TA. Analizuj dane za pomocą oprogramowania DMA.
- Po pomiarze właściwości skurczowych odczep pętlę szwów dystalnego ścięgna TA od haka ramienia niwelatora. Usuń mięsień TA. Określ mokrą masę mięśni i oblicz CSA 10.
- Zmierz właściwości skurczowe mięśnia TA po lewej stronie zgodnie z krokami od 1 do 3 opisanymi powyżej. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi na koniec badania.
Wyniki
Poniższe wyniki stanowią reprezentację danych z naszych poprzednich raportów 6,9. Dane przedstawiono jako średnią±błąd standardowy średniej. Tabela 3 przedstawia właściwości morfometryczne mięśnia EDL u prawidłowych myszy BL10 oraz myszy z niedoborem dystrofiny (mdx) w wieku od 4 do 6 miesięcy. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne właściwości skurczowe i pasywne mięśnia EDL od myszy BL10 oraz mdx. Właściwości skurczowe mięśnia EDL są opisane za pomocą następujących parametrów, w tym swoistej siły drgań (bezwzględna siła podzielona przez CSA) (Rysunek 4A), swoistej maksymalnej siły tężcowej (Rysunek 4B), TPT oraz ½ RT bezwzględnej maksymalnej siły tężcowej (Rysunek 4C i D). TPT oraz ½ RT można obliczyć również z bezwzględnej siły drgań. Profil naprężenie-odkształcenie (Rysunek 4E) oraz SRR (Rysunek 4F) są wykorzystywane do opisu właściwości pasywnych mięśnia EDL.
Brak dystrofiny ma istotny wpływ na właściwości kurczliwe i pasywne mięśnia EDL 6,9. Specyficzne siły pojedynczego skurczu i tężca są znacząco zredukowane w mięśniu EDL myszy mdx. TPT jest znacząco szybszy, podczas gdy ½ RT jest znacząco wolniejszy w mięśniu EDL mdx. Profil naprężenie-odkształcenie sugeruje, że sztywność jest znacząco zwiększona w mięśniu EDL mdx. Mięsień EDL mdx wykazuje również znacząco wyższą siłę oporu (naprężenie pasywne) przed osiągnięciem maksymalnego naprężenia, podczas gdy naprężenia po osiągnięciu szczytu spadają znacznie szybciej. Ponadto SRR był znacząco wyższy w mięśniu EDL mdx w porównaniu do mięśnia EDL BL10.
Analiza statystyczna
Istotność statystyczną między dwiema grupami analizuje się za pomocą testu t Studenta t-test. W celu oceny istotności statystycznej dla wielu grup zastosowano jednoczynnikową lub dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z następującym testem Bonferroniego. post hoc Zaleca się przeprowadzenie analizy przy użyciu oprogramowania SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Różnicę uznaje się za istotną, gdy p < 0.05.
Tabela 1. Materiały i sprzęt.
| Eksperyment | Napięcie spoczynkowe (g) | Częstotliwość impulsów (Hz) | Szerokość impulsu (ms) | Czas trwania stymulacji (ms) | Długość rozciągnięcia | Czas trwania rozciągania (ms) | Szybkość rozciągania | Komentarze |
| 1. Ocena właściwości kurczliwych i biernych mięśnia EDL ex vivo | ||||||||
| 1.3.1 Pomiar właściwości kurczliwych mięśnia EDL | ||||||||
| 1. Rozgrzewka | 1.0 | 150 | 0.2 | 300 | Odpoczynek mięśnia powinien trwać 60 s pomiędzy poszczególnymi stymulacjami. Te wstępne skurcze tężcowe stabilizują mięsień przed kolejnymi pomiarami. | |||
| 2. Optymalna długość mięśnia (Lo) | 0,5, 1,0, 1,5 i 2,0 | 1 | 0.2 | 300 | Pozostaw mięsień do rozluźnienia na 30 s pomiędzy poszczególnymi stymulacjami. Pomiar optymalnej długości mięśnia przeprowadź za pomocą suwmiarki cyfrowej. | |||
| 3. Siła pojedynczego skurczu (Pt) | Ustaw napięcie spoczynkowe na poziom Lo | 1 | 0.2 | 300 | ||||
| 4. Siła tężcowa mięśnia | Ustaw napięcie spoczynkowe na Lo | 50, 80, 100, 120, 150 i 200 | 0.2 | 300 | Pozostaw mięsień w stanie rozluźnienia przez 1 min między poszczególnymi stymulacjami. Wyznacz częstotliwość generującą maksymalną bezwzględną siłę tężcową (Po). | |||
| 5. Skurcz ekscentryczny | Ustaw napięcie spoczynkowe na wartość Lo | Należy zastosować częstotliwość, która generuje maksymalną siłę tetaniczną (Po) | 0.2 | 700 | 10% Lo | ostatnie 200 ms czasu trwania stymulacji | 0,5 Lo/s | Powtórz skurcz ekscentryczny przez 10 cykli z 2-minutową przerwą między cyklami. |
| 6. CSA mięśnia EDL | CSA = (masa mięśnia (g) / [1,06 g/cm³])3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g/cm³3 gęstość mięśnia, a 0,44 to stosunek długości włókien mięśnia EDL do Lo. | |||||||
| 1.3.2 Pomiar właściwości pasywnych mięśnia EDL | ||||||||
| 1. Sześciostopniowy protokół rozciągania | Ustaw napięcie spoczynkowe na wartość Lo | 10% Lo | 2 cm/s | Powtórz protokół rozciągania, zwiększając wartość Lo o 10%, aż do osiągnięcia poziomu 160% Lo. Zachowaj 1,5 s przerwy między cyklami rozciągania. | ||||
| 2. SRR | Ustaw napięcie spoczynkowe na Lo | 10% Lo | 2 cm/s | Wartość SSR oblicza się poprzez podzielenie różnicy naprężeń przez czas, który upłynął między dwoma punktami czasowymi w określonym przedziale czasowym. | ||||
| 2.3 Pomiar właściwości kurczliwych mięśnia TA | ||||||||
| 1. Rozgrzewka | 4.0 | 150 | 0.2 | 300 | Pozostaw mięsień w spoczynku przez 60 s pomiędzy poszczególnymi bodźcami. | |||
| 2. Optymalna długość mięśnia (Lo) | 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 i 7,0 | 1 | 0.2 | 300 | Pozostaw mięsień w stanie rozluźnienia przez 30 s pomiędzy poszczególnymi stymulacjami. Zmierz optymalną długość mięśnia za pomocą suwmiarki cyfrowej. | |||
| 3. CSA mięśnia TA | CSA = (masa mięśnia (g) / [1,06 g/cm³3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 to stosunek długości włókna mięśnia TA do Lo. | |||||||
Tabela 2. Parametry służące do oceny właściwości mechanicznych mięśni EDL i TA.
| Szczep | Wiek (miesiąc) | Masa ciała (g) | Masa EDL (mg) | Długość EDL (mm) | CSA EDL (mm2) |
| BL10 | 6 | 32.03 ± 0.57 | 13.90 ± 0.77 | 14.09 ± 0.04 | 2.12 ± 0.12 |
| mdx | 6 | 35.44 ± 0.42* | 16.73 ± 0.42* | 13.93 ± 0.05* | 2.57 ± 0.07* |
Tabela 3. Właściwości morfometryczne mięśnia EDL. *, wartość u myszy mdx różni się znacząco od wartości u myszy BL10 w tym samym wieku.
Rycina 1. Schemat wykonanej na zamówienie deski do sekcji myszy. Deska do sekcji została wykonana z pleksiglasu o grubości ½ cala w warsztacie instytucjonalnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.
/>
Rycina 2. Seria obrazów cyfrowych przedstawiająca etapy wiązania podwójnego węzła kwadratowego, a następnie węzła pętlowego w obrębie MTJ. Gwiazdka: mięsień EDL; Strzałka: ścięgno dystalne mięśnia EDL.
/>
Rycina 3. Schemat specjalnie wykonanej platformy do badania funkcji mięśnia TA in situ. Pleksiglasowa platforma dla zwierzęcia oraz stalowy uchwyt kolana zostały zaprojektowane do montażu w aparaturze do badań in situ myszy 809B. *, pręt ze stali nierdzewnej (Cat# MPR-2.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); #, uniwersalny uchwyt elektrod (Cat# MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR); §, pręt do mocowania elektrod (Cat# MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); **, blok Sylgard. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę.
/>
Rycina 4. Reprezentatywne wyniki dla właściwości kurczliwych i pasywnych mięśnia EDL. Właściwości kurczliwe mięśnia EDL charakteryzują swoista siła pojedynczego skurczu (A), swoista siła tężcowa (B), czas do osiągnięcia szczytowego napięcia (C) oraz połowa czasu relaksacji (D). Właściwości pasywne mięśnia EDL oceniane są na podstawie profilu naprężenie-odkształcenie (E) oraz wskaźnika SSR. *, myszy mdx różnią się znacząco od myszy BL10 w tym samym wieku.
Dyskusja
W tym protokole zilustrowaliśmy testy fizjologiczne do pomiaru właściwości kurczliwych i biernych mięśnia EDL oraz właściwości kurczliwych mięśnia TA. Głównym problemem w badaniach nad fizjologią mięśni jest dotlenienie mięśnia docelowego. W przypadku dużych mięśni (takich jak mięsień TA) preferowane jest podejście in situ , ponieważ dyfuzja tlenu z buforu Ringera może nie dotrzeć do środka mięśnia w teście in vitro . Podejście in situ nie zaburza normalnego ukrwienia i unika się sztucznych efektów związanych z niedotlenieniem. Mięsień EDL jest jednym z najczęściej używanych mięśni w badaniach fizjologicznych. Odpowiednie dotlenienie całego mięśnia można osiągnąć w systemie in vitro ze względu na mały rozmiar mięśnia. Co więcej, system in vitro zapewnia zamknięte środowisko do manipulowania stężeniami jonów ( Ca2+, Na+ i K+) i substancji chemicznych (ATP i glukozy), które są niezbędne do optymalnego wytwarzania siły mięśniowej. Daje to doskonałą okazję do zbadania wpływu tych zmiennych na wytwarzanie siły.
Dokładny pomiar właściwości kurczliwych i biernych mięśni kończyn ma kluczowe znaczenie dla badania funkcji mięśni szkieletowych. Charakterystyczne zmiany tych właściwości są często uważane za cechy charakterystyczne różnych chorób mięśni. Zmiany tych parametrów są również ważnymi wskaźnikami określającymi, czy terapia eksperymentalna jest skuteczna, czy nie.
Oświadczenia
Opłaty za otwarty dostęp zostały opłacone przez Aurora Scientific.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (AR-49419, DD), Muscular Dystrophy Association (DD) i NIH training grant T90DK70105 (CH).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kąpiel tkankowo-organowa | Radnoti LLC, CA, USA | Kąpiel tkankowa z płaszczem wodnym (nr kat. 158351-LL), rurka do dyspersji tlenu (nr kat. 160192), zawór Luer (nr kat. 120722) | |
| Cyrkulacyjna łaźnia wodna | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Mieszanina gazowa | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O22 oraz 5% CO22 | |
| In vitro aparat do badania funkcji mięśni |  Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada | System składa się ze stymulatora (model nr 701A), dwutrybowego systemu dźwigni (model nr 300C lub 305C), interfejsu sygnałowego (model nr 604B) oraz aparatury testowej (model nr 800A) do pionowego montażu kąpieli tkankowej. | |
| In vitro oprogramowanie do analizy funkcji mięśni | Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada | Oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni (DMC) oraz oprogramowanie do analizy danych dynamicznej kontroli mięśni (DMA) | |
| Koktajl anestetyczny dla myszy rozpuszczony w 0,9% NaCl | Należy odnieść się do wytycznych instytucjonalnych | Ketamina (25 mg/ml), ksylazyna (2,5 mg/ml) i acepromazyna (0,5 mg/ml). W trakcie procedury chirurgicznej może być konieczne podanie dawki uzupełniającej w wysokości 10% dawki początkowej, aby utrzymać zwierzę w znieczuleniu. | |
| Sylgard | World Precision Instrument | Kat#SYLG184 | |
| Specjalistyczna deska sekcyjna z pleksiglasu | Opracowany wewnętrznie | Należy odnieść się do Rysunek 1 | |
| Lampa grzewcza | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | lampka 15 W w celu utrzymania ciepłoty myszy podczas sekcji | |
| Bufor Ringera | Odczynniki chemiczne zakupiono w firmie Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Skład w mM: 1,2 NaH2PO4 (Kat#S369), 1 MgSO44 (Kat# M63), 4,83 KCl (Kat# P217), 137 NaCl (Kat# 217), 24 NaHCO3 (Kat# S233), 2 CaCl22 (nr kat. C79) oraz 10 glukozy (nr kat. D16). Rozpuścić odrębnie odczynniki chemiczne i wymieszać w kolejności wymienionej powyżej. Przechowywać w 4 °C. | |
| Stereomikroskop sekcyjny | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Narzędzia do sekcji | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | pinceta chirurgiczna gruba, nożyczki grube, pinceta chirurgiczna precyzyjna (prosta i 45 ° kąt) | |
| Pleciona nici jedwabna 4-0 | szwy SofSilk USSC, Norwalk, CT, USA | Nr kat. SP116 | |
| Specjalnie wykonany hak ze stali nierdzewnej | Small Parts, Inc. | S/S 304V o długości 2'' (średnica 0,18'') dla przetwornika siły 305C lub S/S 304V o długości 2,5'' (średnica 0,012'') dla przetwornika 300C (Kat# ASTM A313) | |
| In situ system do oceny funkcji mięśni | Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada | System (809B, in situ (aparat dla myszy) składa się ze stymulatora (model 701B), dwutrybowego systemu dźwigni (model 305C), interfejsu sygnałowego (model 604A) oraz termostatycznego urządzenia z płytką pod stopami (model 809A) | |
| In vitro oprogramowanie do analizy funkcji mięśni | Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada | oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni (DMC) oraz oprogramowanie do analizy danych dynamicznej kontroli mięśni (DMA) | |
| Dedykowana platforma dla zwierząt do testu TA | Opracowany wewnętrznie | Należy odnieść się do Rycina 2 | |
| Haczyk ze stali nierdzewnej wykonany na zamówienie | Small Parts, Inc. | Nr kat. ASTM A313 | S/S 304V o długości 0,5'' (średnica 0,18'') |
| Platynowe elektrody 25G wykonane na zamówienie | Chalgren Enterprises, Gilroy, CA | Przylutuj dwa platynowe druty o grubości 0,016 cala do dwóch przewodów elektrycznych 24G | |
Tabela 1. Materiały i sprzęt. |
Bibliografia
- Huijing, P. A. Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb. J. Biomech. 32, 329-345 (1999).
- Moss, R. L., Halpern, W. Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle. Biophys. J. 17, 213-228 (1977).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).
- Pastoret, C., Sebille, A. mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age. J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).
- Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice. J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).
- Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).
- Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).
- Hakim, C. H., Duan, D. Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle. Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).
- Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy. Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie