Ocena funkcji mięśni mięśnia prostownika długiego mięśnia ex vivo i mięśnia piszczelowego przedniego in situ u myszy

Podsumowanie

Zmiany w kurczliwości mięśni kończyn i pasywnych właściwościach mechanicznych są ważnymi biomarkerami chorób mięśni. W tym manuskrypcie opisano testy fizjologiczne do pomiaru tych właściwości w mysich mięśniach prostownika długiego palca długiego i piszczelowych przednich.

Streszczenie

Ruchy ciała są głównie zapewniane przez mechaniczną funkcję mięśni szkieletowych. Mięśnie szkieletowe składają się z licznych wiązek włókien mięśniowych, które są osłonięte śródmięśniowymi tkankami łącznymi. Każde włókno mięśniowe zawiera wiele miofibryli, które biegną podłużnie wzdłuż włókna mięśniowego. Miofibryle są aparatem kurczliwym mięśni i składają się z powtarzających się jednostek kurczliwych znanych jako sarkomery. Jednostka sarkomerowa zawiera włókna aktyny i miozyny, które są oddalone od siebie o krążki Z i białko tytyny. Mechaniczna funkcja mięśni szkieletowych jest definiowana przez kurczliwe i bierne właściwości mięśni. Właściwości kurczliwe służą do scharakteryzowania wielkości siły generowanej podczas skurczu mięśni, czasu wytwarzania siły i czasu rozluźnienia mięśni. Każdy czynnik wpływający na skurcz mięśni (taki jak interakcja między filamentami aktyny i miozyny, homeostaza wapnia, stosunek ATP / ADP itp.) wpływa na właściwości skurczowe. Właściwości pasywne odnoszą się do właściwości elastycznych i lepkich (sztywność i lepkość) mięśnia przy braku skurczu. O właściwościach tych decydują zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowe składniki strukturalne (takie jak tytyna) oraz tkanki łączne (głównie kolagen) ^1-2. Właściwości kurczliwe i pasywne to dwa nierozłączne aspekty funkcjonowania mięśni. Na przykład zgięcie łokcia odbywa się poprzez skurcz mięśni w przedniej części ramienia i bierne rozciąganie mięśni w tylnej części ramienia. Aby naprawdę zrozumieć funkcję mięśni, należy zbadać zarówno właściwości skurczowe, jak i pasywne.

Kurczliwe i/lub pasywne właściwości mechaniczne mięśni są często zagrożone w chorobach mięśni. Dobrym przykładem jest dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), ciężka choroba zaniku mięśni spowodowana niedoborem dystrofiny ³. Dystrofina jest białkiem cytoszkieletu, które stabilizuje błonę komórek mięśniowych (sarcolemma) podczas skurczu mięśni ⁴. W przypadku braku dystrofiny sarcolemma jest uszkadzana przez siłę ścinającą wytwarzaną podczas przenoszenia siły. To rozerwanie błony inicjuje reakcję łańcuchową, która prowadzi do śmierci komórek mięśniowych i utraty maszynerii skurczowej. W konsekwencji siła mięśniowa zostaje zmniejszona, a martwe włókna mięśniowe są zastępowane tkankami zwłóknieniowymi ⁵. Ta późniejsza zmiana zwiększa sztywność mięśni ⁶. Dokładny pomiar tych zmian stanowi ważną wskazówkę do oceny postępu choroby i określenia skuteczności terapeutycznej nowych interwencji genowych/komórkowych/farmakologicznych. W tym miejscu przedstawiamy dwie metody oceny zarówno kurczliwych, jak i biernych właściwości mechanicznych mięśnia prostownika długiego palca (EDL) oraz właściwości kurczliwych mięśnia piszczelowego przedniego (TA).

Protokół

1. Ocena kurczliwości i pasywnych właściwości mięśnia EDL ex vivo

Kurczliwe i pasywne właściwości mięśnia EDL są mierzone ex vivo za pomocą systemu testów in vitro in vitro Aurora Scientific. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z materiałami i wyposażeniem.

1.1 Przygotowanie sprzętu

1. Zmontuj kąpiel tkankowo-narządową, mocując rurkę tlenową do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym. Przymocuj zmontowaną wannę do aparatu do montażu mięśni. Podłącz przewód gazowy do rurki tlenowej. Przymocuj przewody cyrkulacyjne wody do kąpieli tkankowej z płaszczem wodnym i umieść zawór iglicowy w odpływie wanny.
2. Włączyć łaźnię wodną obiegową i ustawić temperaturę na 30 °C ⁷. Pozwól, aby 5 PSI (funtów na cal kwadratowy) 95% O_2-5% CO₂ przepłynęło przez rurkę tlenową. Napełnij wannę buforem Ringera. Równoważyć bufor przez co najmniej 10 minut ze stałym przepływem gazu, regulując zawór tlenowowy.
3. Włącz instrumenty (stymulator, system dźwigni dwutrybowych i interfejs sygnału). Załaduj oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni (DMC) zgodnie z instrukcją producenta.

1.2 Rozwarstwienie mięśni EDL

Wszystkie badania na zwierzętach muszą być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.

1. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 2,5 μl/g masy ciała koktajlu znieczulającego (patrz rozdział dotyczący materiałów). Przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego sprawdzano głębokość sedacji poprzez wykonanie uszczypnięcia palca u nogi. Suplement w wysokości 10% początkowej dawki znieczulenia jest podawany, gdy jest to konieczne, aby utrzymać zwierzę w znieczuleniu. Ogol tylną kończynę. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C przed zabiegiem sekcji, umieszczając mysz na poduszce grzewczej. Temperatura ciała jest monitorowana poprzez ciągły pomiar temperatury w odbycie za pomocą sondy termicznej.
2. Umieść mysz na wznak na desce preparacyjnej (Rysunek 1). Zdejmij skórę nóg, aby odsłonić mięśnie kończyn tylnych. Zabezpiecz nogę na bloku sylgardowym za pomocą dwóch kołków krawieckich, jednego w stopie, a drugiego w mięśniu gracilis. Umieść lampę grzewczą nad korpusem myszy, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Stale łącz wszystkie odsłonięte mięśnie za pomocą bufora Ringera. Spuść nadmiar buforu przez przewód próżniowy.
3. Odsłoń dystalne ścięgno TA i więzadło prostownika pod mikroskopem stereoskopowym, preparując skórę w kierunku stopy. Delikatnie zdejmij powięź pokrywającą mięsień TA. Przetnij więzadło prostownika, aby zwolnić dystalne ścięgno TA.
4. Przetnij dystalne ścięgno TA i użyj go do odklejenia mięśnia TA. Ostrożnie usuń mięsień TA w jego bliższym przyczepie. Umieść cienki kawałek bawełny nasączonej buforem Ringera obok mięśnia EDL, aby wchłonąć krwawienie spowodowane pęknięciem układu naczyniowego mięśnia TA. Użyj przewodu próżniowego, aby usunąć nadmiar buforu i krwi.
5. Zawiąż podwójne kwadratowe węzły, a następnie węzeł pętelkowy za pomocą nici chlebowej na połączeniu ścięgien mięśniowych (MTJ) dystalnego mięśnia EDL (ryc. 2). Wykonaj nacięcie w dystalnej części mięśnia dwugłowego uda, aby odsłonić proksymalny mięsień EDL. Powtórz ten sam zestaw węzłów (ryc. 2) w MTJ bliższego ścięgna EDL. Przymocuj hak ramienia dźwigni do bliższego lub dystalnego węzła za pomocą podwójnego węzła kwadratowego, używając tej samej linii szwów. Odetnij pozostałą linię szwów.
6. Przeciąć proksymalne ścięgno EDL powyżej bliższego węzła szwu. Podnieś mięsień EDL za pomocą haczyka i przetnij naczynia krwionośne pod mięśniem. Przeciąć dystalne ścięgno EDL poniżej dystalnego węzła szwu, aby usunąć mięsień EDL z kończyny tylnej. Przykryj odsłoniętą tylną kończynę kawałkiem bawełny nasączonej buforem Ringera.
7. Przymocuj hak do ramienia dźwigni. Ustaw mięsień pionowo między dwiema elektrodami. Przymocuj dystalną linię szwu do stałego słupka. Podnieś kąpiel tkankową, aby zanurzyć mięsień w buforze Ringera. Dostosuj napięcie spoczynkowe do 1,0 g za pomocą podwójnego stopnia zgrubnego/drobnego translacji i pozwól mięśniom zrównoważyć się przez co najmniej 10 minut.

1.3 Pomiar kurczliwości i pasywnych właściwości mięśnia EDL

Użyj Tabeli 2, aby ustawić parametry w oprogramowaniu DMC dla każdego z poniższych pomiarów. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do dynamicznej analizy mięśni (DMA).

1.3.1 Pomiar kurczliwości mięśnia EDL

1. Stymuluj mięsień EDL trzy razy przy 150 Hz w odstępie 60 sekund, aby ustabilizować mięsień ⁸.
2. Stymuluj mięsień EDL przy różnych napięciach spoczynkowych, aby określić optymalną długość (Lo). Optymalna długość to długość, przy której mięsień rozwija maksymalne napięcie skurczowe. Pozwól mięśniom się rozluźnić przez 2 minuty.
3. Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo. Zmierz siłę mięśni przy stymulacji pojedynczego skurczu. Określ bezwzględną siłę drgania (Pt), czas do osiągnięcia szczytowego napięcia (TPT) i czas połowy relaksacji (1/2 RT) Pt. Pozwól mięśniowi rozluźnić się przez 2 minuty.
4. Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo. Zmierz siłę mięśni tężcowych generowaną przy różnych częstotliwościach stymulacji (50, 80, 100, 120, 150 i 200 Hz). Określ bezwzględną maksymalną siłę mięśnia tężcowego (Po), w której siła mięśni osiąga maksymalną. Zmierz TPT i 1/2 RT Po ⁹.
5. Pozwól mięśniowi rozluźnić się przez 5 minut. Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo. Zastosuj 10 cykli skurczów ekscentrycznych z 2-minutowym odpoczynkiem między cyklami. Oblicz względną utratę siły Po po każdym cyklu skurczu mimośrodowego.
6. Odłącz mięsień EDL od aparatu i przetnij ścięgna w miejscu szwu. Określić mokrą masę mięśni i obliczyć pole przekroju poprzecznego mięśni (CSA) ^6,10.

1.3.2 Pomiar pasywnych właściwości mięśnia EDL

1. Wypreparować mięsień EDL po lewej stronie i przymocować go do aparatu, jak opisano w sekcji 1.2, kroki od 2 do 7.
2. Poddaj mięsień EDL sześciostopniowemu protokołowi rozciągania, w którym mięsień jest napięty do 160% Lo z przyrostem 10% Lo. Przeanalizuj profil naprężenie-odkształcenie ⁶.
3. Oceń lepkość mięśnia EDL, mierząc szybkość relaksacji stresu (SRR) w następujących przedziałach czasowych po rozciągnięciu i utrzymaniu mięśnia na poziomie 10% Lo: od szczytu do 0,1 s po szczycie (pp), od 0,1 do 0,2 s pp, od 0,2 do 0,5 s pp, od 0,5 do 1 s pp i od 1 do 1,5 s pp.
4. Pod koniec badania należy poddać mysz eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy i/lub ścięcie, gdy mysz jest jeszcze pod narkozą. Odłącz mięsień EDL od aparatu i przetnij ścięgna w miejscu szwu. Określić mokrą masę mięśni i obliczyć pole przekroju poprzecznego mięśni (CSA) ^6,10.

2. Ocena właściwości kurczliwych mięśnia TA in situ

Właściwości kurczliwe mięśnia TA są mierzone za pomocą systemu testów mięśniowych in situ Aurora Scientific. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z materiałami i wyposażeniem.

2.1 Przygotowanie sprzętu

1. Podgrzać temperaturę zwierzęcia do temperatury 37 °C za pomocą obiegowej łaźni wodnej.
2. Włącz instrumenty (stymulator, system dźwigni dwutrybowych i interfejs sygnału). Załaduj oprogramowanie DMC zgodnie z instrukcjami producenta.

2.2 Przygotowanie mięśnia TA do pomiaru siły in situ

1. Znieczulić mysz, ogolić tylną kończynę i odsłonić mięsień TA, jak opisano w krokach od 1 do 3 w punkcie 1.2.
2. Zawiąż podwójny kwadratowy węzeł wokół więzadła rzepki za pomocą jedwabnego szwu chlebowego. Zawiąż podwójny węzeł kwadratowy, a następnie węzeł pętlowy w MTJ dystalnego mięśnia TA (ryc. 2), zawiąż kolejny podwójny węzeł kwadratowy, pozostawiając pętlę ~10 mm od dystalnego węzła ścięgna TA, używając tej samej linii szwu. Umieść drugi podwójny kwadratowy węzeł z boku pętli.
3. Usuń szpilki z tylnej kończyny i ustaw zwierzę na brzuchu. Odsłoń mięsień dwugłowy uda. Wykonaj nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić nerw kulszowy. Zawiąż podwójny kwadratowy węzeł wokół bliższego końca nerwu kulszowego. Przytnij jedną stronę linii szwów i przetnij nerw powyżej węzła. Delikatnie pociągnij nerw kulszowy w kierunku kolana za pomocą linii szwów i oczyść otaczającą tkankę łączną, aby uwolnić ~ 5 mm jej długości. Nie rozciągaj nerwu podczas tej procedury i stale przeraź nerw za pomocą bufora dzwonka.
4. Przygotuj przeciwległy mięsień TA zgodnie z opisem w krokach od 1 do 3. Przykryj jedną z odsłoniętych tylnych kończyn kawałkiem bawełny nasączonej buforem Ringera. Stale zlewaj obie tylne kończyny za pomocą wstępnie rozgrzanego (37 °C) bufora Ringera. Usuń nadmiar buforu przez przewód próżniowy.
5. Ustaw zwierzę leżące na brzuchu na platformie dla zwierząt. Przymocuj uchwyt zacisku kolanowego do platformy dla zwierząt i przymocuj oba kolana do metalowego kołka za pomocą podwójnych kwadratowych węzłów za pomocą linii szwów więzadła rzepki. Przypnij obie stopy do bloku sylgardowego za pomocą szpilek krawieckich. Przymocuj platformę dla zwierząt do stolika sterowanego termicznie. Ustawić lampę grzewczą tak, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C.
6. Przymocuj uchwyt elektrody do platformy dla zwierząt i połóż nerw kulszowy na elektrodzie za pomocą linii do szycia. Trzymaj elektrodę z dala od mięśni kończyn tylnych. Przeciąć dystalne ścięgno TA odsłoniętej kończyny tylnej w miejscu szwu MTJ. Przymocuj pętlę szwów dystalnego ścięgna TA do haka ramienia dźwigni. Przykryj odsłonięty mięsień kończyny tylnej ciepłą bawełną nasączoną buforem Ringera.

2.3 Pomiar właściwości kurczliwych mięśnia TA

1. Tabela 2 służy do ustawiania parametrów w oprogramowaniu DMC. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem, co opisano w sekcji 1.3.1, aby określić właściwości skurczowe mięśnia TA. Analizuj dane za pomocą oprogramowania DMA.
2. Po pomiarze właściwości skurczowych odczep pętlę szwów dystalnego ścięgna TA od haka ramienia niwelatora. Usuń mięsień TA. Określ mokrą masę mięśni i oblicz CSA ¹⁰.
3. Zmierz właściwości skurczowe mięśnia TA po lewej stronie zgodnie z krokami od 1 do 3 opisanymi powyżej. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi na koniec badania.

Wyniki

Poniższe wyniki są reprezentacją naszych poprzednich raportów ^6,9. Dane są prezentowane jako błąd średnia±standardowy średniej. Tabela 3 przedstawia właściwości morfometryczne mięśnia EDL u normalnych myszy z BL10 i niedoborem dystrofiny (mdx) w wieku od 4 do 6 miesięcy. Rycina 4 przedstawia reprezentatywne właściwości kurczliwe i pasywne mięśnia EDL myszy BL10 i mdx. Właściwości skurczowe mięśnia EDL są opisane następującymi terminami, w tym właściwą (bezwzględna siła podzielona przez CSA) siłę skurczu (ryc. 4A), właściwą maksymalną siłę tężcową (ryc. 4B), TPT i 1/2 RT bezwzględnej maksymalnej siły tężcowej (ryc. 4C i D). TPT i 1/2 RT można również obliczyć na podstawie bezwzględnej siły drgania. Profil naprężenie-odkształcenie (ryc. 4E) i SRR (ryc. 4F) służą do opisania właściwości biernych mięśnia EDL.

Brak dystrofiny ma znaczący wpływ na kurczliwe i pasywne właściwości mięśnia EDL ^6,9. Specyficzne siły skurczowe i tężcowe są znacznie zmniejszone w mięśniu MDX EDL. TPT jest znacznie szybszy, podczas gdy 1/2 RT jest znacznie wolniejszy w mięśniu mdx EDL. Profil naprężenie-odkształcenie sugeruje, że sztywność mięśnia MDX EDL jest znacznie zwiększona. Mięsień mdx EDL wytwarza również znacznie większą siłę oporu (naprężenie pasywne) przed osiągnięciem naprężenia szczytowego, podczas gdy naprężenia po szczycie spadają znacznie szybciej. Co więcej, SRR był znacznie wyższy w mięśniu MDX EDL w porównaniu z mięśniem BL10 EDL.

Analiza statystyczna

Istotność statystyczna między dwiema grupami jest analizowana za pomocą testu t-Studenta. W celu uzyskania istotności statystycznej między wieloma grupami zaleca się jedno- lub dwuczynnikową analizę ANOVA, a następnie analizę post hoc Bonferroniego przy użyciu oprogramowania SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). Różnica jest uważana za istotną, gdy p < 0,05.

Tabela 1. Materiały i wyposażenie.

Eksperyment Napięcie spoczynkowe (gram) Częstotliwość impulsów (Hz) Szerokość impulsu (ms) Czas trwania stymulacji (ms) Długość odcinka Czas trwania rozciągania (ms) Szybkość rozciągania Komentarze 1. Ocena kurczliwości i bierności mięśnia EDL ex vivo 1.3.1 Pomiar właściwości kurczliwych mięśnia EDL 1. Rozgrzewka 1,0 150 szt. 0,2 pkt. 300 szt. Odpoczywaj mięsień przez 60 sekund między każdym bodźcem. Te wstępne skurcze tężcowe stabilizują mięsień do kolejnych pomiarów. 2. Optymalna długość mięśni (Lo) 0,5, 1,0, 1,5 oraz 2,0 1 0,2 pkt. 300 szt. Pozwól mięśniom rozluźnić się przez 30 sekund między każdym bodźcem. Zmierz optymalną długość mięśnia za pomocą suwmiarki cyfrowej. 3. Pojedyncza siła drgania (Pt) Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo 1 0,2 pkt. 300 szt. 4. Tężcowa siła mięśni Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo 50, 80, 100, 120, 150 oraz 200 0,2 pkt. 300 szt. Pozwól mięśniom rozluźnić się przez 1 minutę między każdym bodźcem. Określ częstotliwość, która generuje maksymalną bezwzględną siłę tężcową (Po). 5. Skurcz ekscentryczny Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo Użyj częstotliwości, która generuje maksymalną siłę tężcową (Po) 0,2 pkt. 700 szt. 10% Lo ostatnie 200 ms czasu trwania stymulacji 0,5 lo/s Powtórz skurcz mimośrodowy przez 10 cykli z 2-minutowym odpoczynkiem między cyklami. 6. CSA mięśnia EDL CSA = (masa mięśniowa (g) / [1,06 g/cm³ x (Lo x 0,44)]. 1,06 g/^cm3 to gęstość mięśni, a 0,44 to stosunek długości włókien mięśniowych EDL do Lo. 1.3.2 Pomiar właściwości pasywnych mięśnia EDL 1. Sześcioetapowy protokół rozciągania Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo 10% Lo 2 cm/s Powtórz protokół rozciągania z przyrostem 10% Lo, aż do osiągnięcia 160% Lo. Odstęp między cyklami rozciągania wynosi 1,5 sekundy. 2. Jednolity stosunek pracy Dostosuj napięcie spoczynkowe do Lo 10% Lo 2 cm/s SSR oblicza się, dzieląc różnicę naprężeń przez czas, jaki upłynął między dwoma punktami czasowymi w przedziale czasowym. 2.3 Pomiar właściwości kurczliwych mięśnia TA 1. Rozgrzewka Wersja 4.0 150 szt. 0,2 pkt. 300 szt. Odpoczywaj mięsień przez 60 sekund między każdym bodźcem. 2. Optymalna długość mięśni (Lo) 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 oraz 7.0 1 0,2 pkt. 300 szt. Pozwól mięśniom rozluźnić się przez 30 sekund między każdym bodźcem. Zmierz optymalną długość mięśnia za pomocą suwmiarki cyfrowej. 3. CSA mięśnia TA CSA = (masa mięśniowa (g) / [1,06 g/cm³ x (Lo x 0,6)]. 0,6 to stosunek długości włókien mięśniowych TA do Lo.

Tabela 2. Parametry oceny właściwości mechanicznych mięśni EDL i TA.

naprężać Wiek (miesiąc) Masa ciała (g) Masa EDL (mg) EDL Lo (mm) EDL CSA (mm²) Zobacz materiał BL10 6 32,03 ± 0,57 13,90 ± 0,77 14.09 ± 0.04 2,12 ± 0,12 Mdx 6 35,44 ± 0,42* 16,73 ± 0,42* 13,93 ± 0,05* 2,57 ± 0,07*

Tabela 3. Właściwości morfometryczne mięśnia EDL. *, wartość u myszy mdx znacznie różni się od wartości myszy BL10 w tym samym wieku.

Rysunek 1. Schemat ideowy wykonanej na zamówienie tablicy do preparowania myszy. Deska sekcyjna wykonana jest z pleksi o grubości 1/2 cala i została wyprodukowana w warsztacie instytucjonalnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

/>
Rysunek 2. Seria cyfrowych obrazów przedstawiających etapy wiązania podwójnego węzła kwadratowego, po którym następuje węzeł pętlowy w MTJ. Gwiazdka, mięsień EDL; Strzałka, dystalne ścięgno mięśnia EDL.

/>
Rysunek 3. Schemat ideowy wykonanej na zamówienie platformy do badania funkcji mięśni TA in situ. Platforma dla zwierząt z pleksiglasu i uchwyt na kolano ze stali nierdzewnej zostały zaprojektowane do montażu na aparacie myszy 809B in situ. *, Pręt ze stali nierdzewnej (Cat# MPR-2.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); #, Uniwersalny uchwyt elektrody (Cat# MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR); §, pręt mocujący elektrodę (Cat# MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); **, Blok Sylgarda. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

/>
Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki dla kurczliwości i biernych właściwości mięśnia EDL. Właściwości skurczowe mięśnia EDL charakteryzują się właściwą siłą drgającą (A), właściwą siłą tężcową (B), czasem do osiągnięcia szczytu napięcia (C) i czasem połowicznego relaksu (D). Właściwości pasywne mięśnia EDL są oceniane za pomocą profilu naprężeniowo-odkształceniowego (E) i SSR. *, myszy mdx znacznie różnią się od myszy BL10 w tym samym wieku.

Dyskusja

W tym protokole zilustrowaliśmy testy fizjologiczne do pomiaru właściwości kurczliwych i biernych mięśnia EDL oraz właściwości kurczliwych mięśnia TA. Głównym problemem w badaniach nad fizjologią mięśni jest dotlenienie mięśnia docelowego. W przypadku dużych mięśni (takich jak mięsień TA) preferowane jest podejście in situ , ponieważ dyfuzja tlenu z buforu Ringera może nie dotrzeć do środka mięśnia w teście in vitro . Podejście in situ nie zaburza normalnego ukrwienia i unika się sztucznych efektów związanych z niedotlenieniem. Mięsień EDL jest jednym z najczęściej używanych mięśni w badaniach fizjologicznych. Odpowiednie dotlenienie całego mięśnia można osiągnąć w systemie in vitro ze względu na mały rozmiar mięśnia. Co więcej, system in vitro zapewnia zamknięte środowisko do manipulowania stężeniami jonów ( ^Ca2+, Na⁺ i K⁺) i substancji chemicznych (ATP i glukozy), które są niezbędne do optymalnego wytwarzania siły mięśniowej. Daje to doskonałą okazję do zbadania wpływu tych zmiennych na wytwarzanie siły.

Dokładny pomiar właściwości kurczliwych i biernych mięśni kończyn ma kluczowe znaczenie dla badania funkcji mięśni szkieletowych. Charakterystyczne zmiany tych właściwości są często uważane za cechy charakterystyczne różnych chorób mięśni. Zmiany tych parametrów są również ważnymi wskaźnikami określającymi, czy terapia eksperymentalna jest skuteczna, czy nie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kąpiel tkankowo-narządowa	Radnoti LLC, CA, USA		Kąpiel tkankowa z płaszczem wodnym (Cat #158351-LL), rurka dyspergatora tlenu (Cat #160192), zawór Luer (Cat#120722)
Kąpiel cyrkulacyjna	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA
Mieszanka gazów	Airgas National, Charlotte, NC, USA		95% O2 i 5% CO2
In vitro aparatura	do oznaczania funkcji mięśni Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada Oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni (DMC) i oprogramowanie do dynamicznej analizy danych kontroli mięśni (DMA) Koktajl znieczulenia myszy zmieszany z 0,9% NaCl Zapoznaj się z wytycznymi instytucjonalnymi
			Ketamina (25 mg/ml), ksylazyna (2,5 mg/ml) i acepromazyna (0,5 mg/ml). Przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego może być konieczne uzupełnienie dawki początkowej w wysokości 10% w celu utrzymania zwierzęcia w znieczuleniu.
Sylgard	World Precision Instrument	Cat#SYLG184
Wykonana na zamówienie deska do preparowania z pleksiglasu	zaprojektowana		Patrz Rysunek 1< / mocny>
Lampa grzewcza	Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA		15-watowa lampa utrzymująca ciepło myszy podczas sekcji
Chemikalia buforowe Ringera	są kupowane od Fisher Scientific, Waltham, MA, USA		Skład w mM: 1,2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4,83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) i 10 glukozy (Cat# D16). Rozpuść chemikalia pojedynczo i wymieszaj w podanej powyżej kolejności. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny	Nikon, Melville, NY, USA
Narzędzia do preparowania	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA		Kleszcze gruboziarniste, grube nożyczki, cienkie kleszcze (proste i pod kątem 45 stopni)
Pleciony szew jedwabny #4-0	SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA	Kot # SP116
Wykonany na zamówienie hak ze stali nierdzewnej	Small Parts, Inc.		2'' długi S/S 304V (średnica 0,18'') dla przetwornika siły 305C lub 2,5'' długi S/S 304V (średnica 0,012'') dla przetwornika 300C (Cat# ASTM A313)
In situ system	oznaczania funkcji mięśni Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada		System (809B, in situ aparat myszy) składa się ze stymulatora (Model# 701B), dwutrybowego systemu dźwigni (Model# 305C), interfejsu sygnałowego (Model# 604A) i termokontrolowanego aparatu na płycie stopy (Model# 809A)
In vitro oprogramowanie	do oznaczania funkcji mięśni Aurora Scientific, Aurora, ON, Kanada		Oprogramowanie do dynamicznej kontroli mięśni (DMC) i oprogramowanie do dynamicznej analizy danych kontroli mięśni (DMA)
Wykonana na zamówienie platforma dla zwierząt do testów TA	zaprojektowana		Patrz Rysunek 2< / mocny>
Wykonany na zamówienie hak ze stali nierdzewnej	Small Parts, Inc.	Cat# ASTM A313	0,5'' długości S / S 304V (średnica 0,18'')
Wykonane na zamówienie elektrody platynowe 25G	Chalgren Enterprises, Gilroy, CA		dwa druty platynowe o grubości 0,016 cala do dwóch przewodów
Tabela 1. Materiały i sprzęt.