Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym do określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego

DOI:

10.3791/50193

⸱

7 marca 2013

 , 
1Division of Hematology-oncology, Department of Medicine, Medical University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie wszczepienia komórek dawcy stanowi wyzwanie w modelach przeszczepu szpiku kostnego u myszy, które nie mają dobrze zdefiniowanych markerów fenotypowych. Opisaliśmy metodologię ilościowego oznaczania wszczepienia męskich komórek dawcy u samic myszy biorców przeszczepu. Metoda ta może być stosowana u wszystkich szczepów myszy do badania funkcji HSC.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele przeszczepu szpiku kostnego u myszy stanowią ważne narzędzie do pomiaru funkcji hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC) i określania genów/cząsteczek regulujących HSC. W tych modelowych systemach przeszczepów funkcja HSC jest determinowana przez zdolność tych komórek do wszczepiania i odtwarzania śmiertelnie napromieniowanych myszy biorców. Zazwyczaj wkład/wszczepienie komórki dawcy mierzy się za pomocą przeciwciał przeciwko białkom powierzchniowym komórek specyficznych dla dawcy za pomocą cytometrii przepływowej. Jednak metoda ta w dużym stopniu zależy od specyficzności i zdolności markera powierzchni komórki do różnicowania komórek pochodzących od dawcy od komórek pochodzących od biorcy, co może nie być dostępne dla wszystkich szczepów myszy. Biorąc pod uwagę różne tła genetycznie modyfikowanych szczepów myszy dostępnych na rynku, ta metoda oparta na cytometrii powierzchniowej/przepływowej komórek ma znaczne ograniczenia, szczególnie w szczepach myszy, które nie mają dobrze zdefiniowanych markerów powierzchniowych do oddzielania komórek dawcy od kongenicznych komórek biorcy. W tym miejscu opisaliśmy technikę opartą na PCR w celu określenia wszczepienia/wkładu komórek dawcy u myszy po przeszczepie. Przeszczepiliśmy HSC szpiku kostnego samca dawcy śmiertelnie napromieniowanym kongenicznym samicom myszy. Próbki krwi obwodowej pobierano w różnych punktach czasowych po przeszczepie. Próbki szpiku kostnego pobrano pod koniec eksperymentów. Wyizolowano genomowe DNA, a gen specyficzny dla chromosomu Y, Zfy1, amplifikowano za pomocą ilościowego Real Time PCR. Wszczepienie męskich komórek pochodzących od dawcy u samic myszy biorcy obliczono w odniesieniu do krzywej standardowej ze znanym odsetkiem męskiego i żeńskiego DNA DNA. Bcl2 został użyty jako gen referencyjny do normalizacji całkowitej ilości DNA. Nasze dane sugerują, że podejście to wiarygodnie określa wszczepienie komórek dawcy i zapewnia użyteczną, ale prostą metodę pomiaru rekonstytucji komórek krwiotwórczych w mysich modelach przeszczepu szpiku kostnego. Nasza metoda może być rutynowo wykonywana w większości laboratoriów, ponieważ nie jest wymagany kosztowny sprzęt, taki jak cytometria przepływowa.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model przeszczepu mysiego szpiku kostnego (BM) został po raz pierwszy opracowany w latach 60. 1. Model ten był szeroko stosowany w badaniach biologii krwiotwórczych komórek macierzystych dawcy (HSC) u myszy biorcy gospodarza. Model przeszczepu szpiku kostnego u myszy dostarczył nam cennej wiedzy na temat funkcji HSC i ich regulacji oraz jest niezastąpiony w badaniach nad HSC. Allogeniczny model przeszczepu szpiku kostnego, taki jak C57Bl / 6JH2b-Balb / CH2d lub model przeszczepu kongenicznego, taki jak C56Bl / 6JCD45.2-B6. SJLCD45.1 są stosowane w wielu laboratoriach do badania funkcji genu na aktywność HSC2, wpływ leczenia farmakologicznego na funkcję HSC3 lub choroby związane z przeszczepem, takie jak choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)4.

Markery powierzchni komórek, takie jak haplotyp MHC lub CD45.1, są powszechnie używane do odróżniania komórek pochodzących od dawcy od komórek pochodzących od biorcy. C57Bl/6JH2b, CD45.2, Balb/CH2d oraz B6. SJLCD45.1 są najczęściej stosowanymi szczepami myszy w przeszczepach szpiku kostnego, ponieważ wkład komórek dawcy można łatwo ocenić za pomocą cytometrii przepływowej mierzącej CD45.1 vs. CD45.2 lub H2b vs. H2d. Jednak wiele innych szczepów, takich jak FVB/NJ5 i C3H, jest również często wykorzystywanych do generowania genetycznie modyfikowanych myszy transgenicznych lub nokautujących. Myszy te mogą być krzyżowane wstecznie z linią wsobną i utrzymywane w mieszanym tle genetycznym / MHC. W takich przypadkach określenie wszczepienia komórek dawcy i funkcji HSC może być trudne, ponieważ markery powierzchniowe specyficzne dla dawcy mogą być niedostępne.

Użycie sondy DNA specyficznej dla chromosomu Y do wykrywania komórek męskich dawcy za pomocą southern blot w przeszczepie szpiku kostnego o niedopasowanej płci zostało po raz pierwszy opracowane przez grupę 6 dr Miwy. Następnie stwierdzono, że PCR w czasie rzeczywistym dla regionu Y determinującego płeć jest dokładną i wysoce specyficzną metodą ilościowego oznaczania męskich komórek płodowych w układzie krwionośnym matki7. Koncepcja ta została zaadaptowana przez grupę dr Schwarzenbergera do opracowania techniki PCR w czasie rzeczywistym w mysim modelu przeszczepu szpiku kostnego w celu określenia wszczepienia komórek dawcy 8. Zmodyfikowaliśmy tę metodę do pomiaru wszczepienia komórek dawcy w modelu przeszczepu szpiku kostnego myszy FVB / NJ. Metoda ta jest obecnie szeroko stosowana w naszej grupie do badania roli kinazy Pim1 w biologii HSC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja komórek szpiku kostnego

  1. Eutanazja samców myszy FVB/NJ i samic myszy FVB/NJ przy użyciu metody CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Żeńskie komórki szpiku kostnego FVB / NJ zostaną wykorzystane jako komórki konkurencyjne.
  2. Użyj małych nożyczek i kleszczy, wypreparuj kości udowe i piszczelowe myszy i umieść je w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 60 mm zawierającym 6 ml lodowatego RPMI1640 z 5% inaktywowanym termicznie FBS. Użyj tkanki kimwipe, aby usunąć mięśnie i inne tkanki. Odetnij oba końce każdego trzonu kostnego w naczyniu.
  3. Połącz koniec kości igłą 23G na strzykawce o pojemności 3 cm3, wypłucz szpik kostny za pomocą RPMI1640 z 5% inaktywowanym termicznie FBS do naczynia. Dezagregacja tkanek szpiku kostnego przez wielokrotne aspiracje przy użyciu tej samej igły. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  4. Wirować komórki przez 5 minut przy 400 x g, usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek o temperaturze pokojowej (155 mM wodorowęglanu potasu, 10 mM chlorku amonu, 0,1 mM EDTA, PH=7,4) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie dodać 5-10 ml RPMI 1640 z 5% inaktywowanym termicznie FBS.
  5. Przepuść komórki przez sitko do komórek. Zebrać przepływ do nowej rurki. Wirować przez 5 minut przy 400 x g. Usunąć supernatant; Osad komórkowy nie powinien zawierać żadnego czerwonego koloru. Brak czerwonego koloru wskazuje na całkowite usunięcie czerwonych krwinek. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml RPMI1640 z 5% inaktywowanym termicznie FBS. Delikatnie wymieszaj, aby upewnić się, że zawiesina komórek jest całkowicie jednolita. Weź podwielokrotność i policz komórki w hemacytometrze. Oblicz, ile objętości komórek potrzeba do przeszczepu szpiku kostnego i podwielokrotność wystarczającej liczby komórek i wymieszaj męskie komórki dawcy z konkurencyjnymi komórkami żeńskimi w stosunku 5:2. Wirować przez 5 minut w 400 x g, przemyć PBS, ponownie zawiesić w PBS z końcowym stężeniem komórek dawcy w 5×106/ml i komórek konkurencyjnych w 2×106/ml.

2. Konkurencyjny przeszczep szpiku kostnego

  1. Napromieniować samice myszy biorców (w wieku 8-12 tygodni) promiennikiem promieniowania gamma 137Cs w pojedynczej dawce 11Gy 4-6 godzin przed przeszczepem szpiku kostnego.
  2. Umieść napromieniowane samice myszy w unieruchomieniu myszy. Wstrzyknąć mieszane komórki dawcy i konkurenta przez żyłę ogonową w 0,1 ml całkowitej objętości, tak aby każda mysz otrzymała 5×105 komórek dawcy i 2×105 konkurencyjnych komórek szpiku kostnego.

3. Pobieranie próbek

Pary tygodnie po przeszczepie szpiku kostnego, pobierają próbki krwi obwodowej (~50 μl) od samicy myszy biorczyni poprzez krwawienie zaoczodołowe w warunkach znieczulenia. Próbki pobiera się do probówek pokrytych EDTA. Próbki BM można również pobrać pod koniec eksperymentu, zwykle co najmniej 4 miesiące po przeszczepie, przy użyciu tych samych procedur, co opisano wcześniej (Krok 1); zwykle 20-40% komórek BM 1 kości piszczelowej wystarcza do wytworzenia wystarczającej ilości DNA. Pobiera się również próbki krwi lub BM od normalnych samic i samców myszy w tym samym wieku w celu przygotowania krzywej wzorcowej.

4. Izolacja genomowego DNA

  1. Dodać 4× objętość buforu do lizy RBC o temperaturze pokojowej (~ 200 μl) do każdej próbki krwi. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 1 ml PBS, a następnie odwirować, aby usunąć większość zlizowanych RBC.
  2. Wyizoluj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA z krwi (zestaw do ekstrakcji krwi QIAmp DNA). Wstępnie podgrzać bufor elucyjny (AE) w temperaturze 37 °C, aby zwiększyć wydajność eluowanego DNA. Męskie i żeńskie DNA dla krzywej standardowej są izolowane podobnie.
  3. (Opcjonalnie) Genomowe DNA można dalej oczyszczać lub zagęszczać metodą wytrącania EtOH w obecności 3 M octanu sodu (pH = 5,5). Granulki DNA są następnie ponownie zawieszane w 40-50 μl wody destylowanej w celu natychmiastowej analizy lub przechowywane w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
  4. Zmierz stężenie DNA za pomocą fotometru widmowego Nanodrop ND-1000. Do dalszej analizy wykorzystuje się próbki o OD 260/280 między 1,8-2,0.
  5. Rozcieńczyć DNA wolną od DNAazH2Odo 4 ng/μl w całkowitej objętości 50 μl.

5. Przygotowanie krzywej standardowej

Rozcieńczyć DNA męskie i żeńskie DNA do stężenia 4 ng/μl, a następnie przygotować mieszaninę DNA zgodnie z Tabelą1

% męskiego DNA w tle żeńskim Objętość (μl) męskiego DNA 4ng / μl Objętość (μl) żeńskiego DNA 4ng/μl Całkowita objętość (μl) 0,2 pkt. 1 Z numerem 499 500 szt. 0,5 1 Rozdział 199 200 szt. Rozdział 2.5 5 Rozdział 195 200 szt. Rozdział 12,5 25 175 Rozdział 200 szt. 50 Rozdział 100 szt. 100 szt. 200 szt. 87,5 pkt. 175 Rozdział 25 200 szt. 100 szt. 200 szt. 0 200 szt.

Tabela 1. Przygotowanie próbki do krzywej wzorcowej. Normalne samce i samice myszy FVB/NJ w wieku 8-12 tygodni zostały uśmiercone. Pobrano krew i komórki BM. DNA z komórek męskich i żeńskich wyizolowano i ponownie zawieszono w stężeniu 4ng/μl. Męskie i żeńskie DNA zmieszano w różnych proporcjach, aby wygenerować mieszaniny standardowych próbek DNA.

6. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Ustawić płytkę reakcyjną PCR, mieszając odczynnik supermix SYBR Green ze starterami i genomowym DNA. Objętość reakcyjna (20 μl) zawiera 400 nM każdego startera i 5 μl genomowego DNA komórek krwi (4 ng/μl x5 μl = 20 ng) w każdej reakcji. Próbki DNA i wzorce ustalono w trzech egzemplarzach. Sekwencje starterów przedstawiono w tabeli 2.
Nazwa genu naprzód rewers Bcl2 powiedział: 5′-AAGCTGTCACACAGAGGGGCTA 5′- CAGGCTGGAAGGAGAAGATG Zfy1 powiedział: 5-TGGAGAGCCACAAGCTAACCA 5'- CCCAGCATGAGAAAGATTCTTC

Tabela 2. Sekwencja startera RT-PCR dla mysich Bcl2 i Zfy1.

  1. Przeprowadzić reakcję PCR za pomocą maszyny Biorad iQ5 PCR w następujących warunkach: 95 °C 3 min, 42 cykle amplifikacji 95 °C przez 10 sekund, 58 °C przez 25 sekund i 72 °C przez 15 sekund, a następnie krok krzywej topnienia.
  2. Uzyskaj wartości progu cyklu (Ct) za pomocą systemu optycznego Bio-Rad iQ5 2.1 Standard Edition. Obliczać wartość δCt (CtZfy1-Ct Bcl2), a poziom wyrażenia Zfy1 oblicza się jako wartość 2-δ Ct.
  3. Ustalić krzywe wzorcowe dla każdej serii reakcji, stosując odczyt 2-δCt ze znanych mieszanin wzorcowych męskich/żeńskich. Krzywe wzorcowe są generowane przez wykreślenie średniej wartości 2-δCt z trzech prób do znanego % męskiego DNA w mieszaninie z dopasowaniem regresji liniowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunki 1 i 2 przedstawiają przykłady krzywych wzorcowych wykreślonych z wartościami średnimi 2-δCt w funkcji procentowej zawartości męskiego DNA. Rysunek 1A pokazuje specyficzne temperatury topnienia dla amplikonów Bcl2 i Zfy1, wynoszące odpowiednio 78,5 °C i 88,5 °C. Bcl2 jest wykorzystywany jako gen referencyjny do normalizacji całkowitej ilości DNA naniesionej do każdej reakcji PCR. Krzywe amplifikacji Bcl2 (widok logarytmiczny) dla każdej próbki wzorcowej pokrywają się ze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem naszego obecnego badania jest dostarczenie publiczności techniki opartej na PCR do ilościowego określenia wszczepienia komórek dawcy w konkurencyjnym modelu przeszczepu mysiego szpiku kostnego. Opisano kilka badań z wykorzystaniem RT-PCR do wykrywania komórek dawcy w modelach transplantacyjnych 9-10. Grupa dr Schwarzenbergera najpierw opracowała mysi model przeszczepu szpiku kostnego przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym do amplifikacji chromosomu Y 8. Metodę tę wykorzystano do badania funkcji...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Charlesowi Greenbergowi za korzystanie z jego urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym. Ta praca jest wspierana przez MUSC Hollings Cancer Center Startup Fund, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Career Development Award, NIH 1K08HL 103780-01A1 i NIH 3P30CA138313-01S3. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health lub innych podmiotów finansujących.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640HycloneSH30255.01
FBSInvitrogen16140-017Inaktywowany termicznie
chlorek amonuMP Biomedicaals194806
Wodorowęglan potasuFisherP184-500
QIAamp DNA Blood minikitQiagen51106
Sitko do komórekBD bioscience
iQ SYBR Green supermixBiorad170-8882
iQ5 maszyna do PCR w czasie rzeczywistymFotometr Biorad
SpectraNanodrop ND-1000ND-1000

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
  2. Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
  3. Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316(2010).
  4. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
  5. Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
  6. Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
  7. Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
  8. Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
  9. Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894(2008).
  10. Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
  11. Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
  12. Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
  13. Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model mysianaliza krwi obwodowejizolacja genomowego DNAgen chromosomu Ynormalizacja genem referencyjnymprzygotowanie krzywej standardowejalternatywa dla cytometrii przep ywowej

Powiązane artykuły