Method Article

Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka

DOI:

10.3791/50197

⸱

February 11th, 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy minimalnie inwazyjną technikę określaną jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka. Technika ta polega na wstrzyknięciu plazmidowego DNA do bocznych komór nowonarodzonych młodych i zastosowaniu prądu elektrycznego w celu dostarczenia i genetycznej manipulacji nerwowych komórek macierzystych

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerwowe komórki macierzyste (NSC) wyściełają boczne komory poporodowe i dają początek wielu typom komórek, w tym neuronom, astrocytom i komórkom wyściółki1. Zrozumienie szlaków molekularnych odpowiedzialnych za samoodnowę, zaangażowanie i różnicowanie NSC ma kluczowe znaczenie dla wykorzystania ich unikalnego potencjału do naprawy mózgu i lepszego zrozumienia zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego. Poprzednie metody manipulacji systemami ssaków wymagały czasochłonnego i kosztownego wysiłku inżynierii genetycznej na poziomie całego zwierzęcia2. W związku z tym zdecydowana większość badań dotyczyła funkcji cząsteczek NSC in vitro lub w bezkręgowcach.

Tutaj demonstrujemy prostą i szybką technikę manipulowania NPC noworodków, która jest określana jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka (SVZ). Podobne techniki zostały opracowane dziesięć lat temu w celu badania embrionalnych NSC i pomogły w badaniach nad rozwojem kory mózgowej3,4 . Ostatnio zastosowano to do badania przodomózgowia gryzoni po urodzeniu5-7. Technika ta skutkuje solidnym oznakowaniem NSC SVZ i ich potomstwa. W związku z tym poporodowa elektroporacja SVZ stanowi efektywną kosztowo i czasowo alternatywę dla inżynierii genetycznej NSC u ssaków.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura jest zgodna z wymaganiami IACUC Yale. Naukowcy powinni upewnić się, że wytyczne IACUC są zatwierdzone i przestrzegane zgodnie z ich wymogami instytucjonalnymi.

1. Sekcja 1. Przygotowanie DNA, roztworów i szklanych pipet

  1. Generuj DNA o wysokiej czystości (OD 260/280 > 1,80) i wysokim stężeniu (μg/μl > 2,5) wolnym od endotoksyn.
  2. Przygotować 0,9% roztwór soli fizjologicznej i sterylny filtr przez filtr 22 μm.
  3. Umieść 10 cm polerowane ogniowo rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna: 1.5 mm, średnica wewnętrzna: 1.10 mm) w szklanym ściągaczu do pipet model PP-830 Narishige PC-10 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka powoduje oznakowanie prawie wszystkich promieniowych komórek glejowych przylegających do grzbietowej, grzbietowej bocznej i bocznej strefy podkomorowej po "zamaszystym" ruchu elektrody pęsety (Rysunek 1E). Jednak elektroporacja może być dostosowana do wymagań danego eksperymentu, ale bez zamiatania elektrody i przy użyciu określonego umiejscowienia i orientacji, jak opisano na filmie. Na przykład, ponieważ glej promieniowy zlokalizowany grzbietowo różni się od.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu szczegółowo opisujemy technikę elektroporacji SVZ u noworodków, technikę szybkiego i solidnego znakowania i manipulowania komórkami macierzystymi SVZ i ich potomstwem. Istnieje kilka zalet, jakie ma elektroporacja w porównaniu z innymi technikami. Po pierwsze, biorąc pod uwagę ogniskowe znakowanie komórek, można dostrzec efekty autonomiczne i nieautonomiczne komórek. Po drugie, manipulacja genetyczna za pomocą systemów indukowalnych pozwala na porównanie efektów przed lub po integracji synaptycznej. Ponadto.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Departamentu Obrony (Nagroda za rozwój pomysłów, W81XWH-10-1-0041, A.B.), CT Stem cell grant (A.B.) oraz National Institute of Health NRSA 10668225 (D.M.F). Niniejszy materiał opiera się na pracach częściowo wspieranych przez stan Connecticut w ramach programu Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy stanu Connecticut, Departamentu Zdrowia Publicznego stanu Connecticut lub CT Innovations, Inc. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ciężkie, polerowane rurki borokrzemianowe Sutter InstrumentBF150-110-10
Dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych NarishigePC-10H
Szybki zielony Fischer Scientific0521192205
ECM 830 Generator impulsów fali prostokątnej Aparat Harvard45-0052
PęsetyAparatHarvarda45-0488
Światłowodowe źródło światłaFisher Scientific12-562-36
Wolframowa lampa halogenowaUSHIO America, Inc1002247
Picospritzer IIParker Instruments052-0312-900

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neonatal SVZ ElectroporationSubventricular ZoneNeural Stem CellsElectroporation TechniqueDNA InjectionImmunohistochemistryMicroscopy AnalysisElectrophysiology MethodsCell Fate AnalysisPup Anesthesia

Related Articles