Artykuł metodologiczny

Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka

DOI:

10.3791/50197

⸱

11 lutego 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy minimalnie inwazyjną technikę określaną jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka. Technika ta polega na wstrzyknięciu plazmidowego DNA do bocznych komór nowonarodzonych młodych i zastosowaniu prądu elektrycznego w celu dostarczenia i genetycznej manipulacji nerwowych komórek macierzystych

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerwowe komórki macierzyste (NSC) wyściełają boczne komory poporodowe i dają początek wielu typom komórek, w tym neuronom, astrocytom i komórkom wyściółki1. Zrozumienie szlaków molekularnych odpowiedzialnych za samoodnowę, zaangażowanie i różnicowanie NSC ma kluczowe znaczenie dla wykorzystania ich unikalnego potencjału do naprawy mózgu i lepszego zrozumienia zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego. Poprzednie metody manipulacji systemami ssaków wymagały czasochłonnego i kosztownego wysiłku inżynierii genetycznej na poziomie całego zwierzęcia2. W związku z tym zdecydowana większość badań dotyczyła funkcji cząsteczek NSC in vitro lub w bezkręgowcach.

Tutaj demonstrujemy prostą i szybką technikę manipulowania NPC noworodków, która jest określana jako elektroporacja strefy podkomorowej noworodka (SVZ). Podobne techniki zostały opracowane dziesięć lat temu w celu badania embrionalnych NSC i pomogły w badaniach nad rozwojem kory mózgowej3,4 . Ostatnio zastosowano to do badania przodomózgowia gryzoni po urodzeniu5-7. Technika ta skutkuje solidnym oznakowaniem NSC SVZ i ich potomstwa. W związku z tym poporodowa elektroporacja SVZ stanowi efektywną kosztowo i czasowo alternatywę dla inżynierii genetycznej NSC u ssaków.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura jest zgodna z wymaganiami IACUC Yale. Naukowcy powinni upewnić się, że wytyczne IACUC są zatwierdzone i przestrzegane zgodnie z ich wymogami instytucjonalnymi.

1. Sekcja 1. Przygotowanie DNA, roztworów i szklanych pipet

  1. Generuj DNA o wysokiej czystości (OD 260/280 > 1,80) i wysokim stężeniu (μg/μl > 2,5) wolnym od endotoksyn.
  2. Przygotować 0,9% roztwór soli fizjologicznej i sterylny filtr przez filtr 22 μm.
  3. Umieść 10 cm polerowane ogniowo rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna: 1.5 mm, średnica wewnętrzna: 1.10 mm) w szklanym ściągaczu do pipet model PP-830 Narishige PC-10 z drutem kantalowym. Ustaw ściągacz na jednostopniowe ściąganie z obciążeniem w temperaturze 70,5 °C. Złamij końcówki okrągłymi kleszczami i sprawdź pod mikroskopem preparacyjnym pod kątem postrzępionych krawędzi. Skośne końcówki i umieść pod lampą UV na 15 minut. Wyciągnięte pipety powinny być oznaczone w odległości 2 mm od krawędzi końcówki.
  4. Przygotuj 0,1% wagowo-objętościowo szybko zielony roztwór, mieszając sterylny, przefiltrowany, 0,9% roztwór soli fizjologicznej z suchym, szybko zielonym roztworem.

2. Sekcja 2. Przygotowanie zwierząt, ładowanie szklanych pipet i wstrzykiwanie plazmidu

  1. W dniu poporodowym 0-1 młode należy wyjąć pojedynczo z klatek, umieścić na szklanej szalce Petriego schłodzonej do temperatury 4 °C, a następnie umieścić na mokrym lodzie.
  2. Po około 5 minutach określ stan znieczulenia, wykorzystując reakcję szczypania stopy. Jeśli nie wystąpi żaden ruch, należy poddać młode wstrzyknięciu dokomorowemu.
  3. Ważne jest, aby pamiętać, że połączenie szybkiego zielonego roztworu, DNA i soli fizjologicznej może spowodować szybkie parowanie, krystalizację i zablokowanie szklanych pipet. W związku z tym należy wytworzyć roztwór podstawowy i podwielokrotność 1-2 μl na parafilm bezpośrednio przed wstrzyknięciami.
  4. Odessać całą porcjowaną objętość za pomocą wyciągniętej szklanej pipety.
  5. Trzymaj głowę szczeniaka między kciukiem a palcem wskazującym mniej dominującej ręki.
  6. Włącz lampę i przytrzymaj głowę szczeniaka tuż poza wiązką światła. W razie potrzeby posmaruj głowę solą fizjologiczną, aby zmniejszyć ilość światła odbijanego przez szczeniaka. Komory powinny być teraz oświetlone.
  7. Ręką dominującą wbić igłę do najbliższej komory bocznej (ryc. 1A i 1B). Miejsce wstrzyknięcia powinno znajdować się w przybliżeniu w równej odległości od szwu lambdoidalnego i oka oraz 2 mm bocznie od szwu strzałkowego. Włóż ciągniętą pipetę do oznaczenia 2 mm dla P0 pup, która powinna zapewnić penetrację do komory bocznej. Przypadkowo może dojść do sytuacji, w której płyn mózgowo-rdzeniowy zostanie ponownie napełniony pipetą po uwolnieniu ciśnienia śródczaszkowego. Aby zmniejszyć ciśnienie śródczaszkowe, które pomaga w wstrzyknięciu plazmidu, poluzuj uścisk na głowie szczeniaka. Krok 2.8. Wstrzyknąć około 0,5 μl plazmidu do komory bocznej za pomocą iniektora pod ciśnieniem powietrza (Picospritzer, Parker).

3. Sekcja 3. Elektroporacja i odzysk

  1. Ustaw napięcie generatora elektroporacji na 5 impulsów kwadratowych, 50 ms/impuls przy 100 woltach, w odstępach 950 ms. Przestrzenna specyfika elektroporacji plazmidowej podyktowana jest kierunkowością przenoszenia ładunku. Należy zwrócić szczególną uwagę na rozmieszczenie, biorąc pod uwagę niejednorodność populacji komórek macierzystych wzdłuż SVZ8. Stwierdzono różnice w tempie proliferacji i losie komórek w lokalizacjach brzuszno-grzbietowych i rostralno-ogonowych9,10 .
  2. Po wstrzyknięciu plazmidu zanurz elektrody pęsety w PBS. Ten krok ma na celu maksymalizację transferu ładunku i zapobieżenie oparzeniom spowodowanym rezystywnością.
  3. Umieść elektrodę dodatnią na grzbietowej bocznej ścianie szczeniaka w pobliżu ucha, ipsilateralnie do miejsca wstrzyknięcia plazmidu (ryc. 1C i 1D). Umieść elektrodę ujemną na półkuli przeciwległej, brzusznej, bocznej w stosunku do pyska szczeniaka.
  4. Zainicjuj transfer prądu, naciskając pedał przełącznika nożnego impulsu i przesuń elektrody od grzbietu do boku, używając odstępów kąta ~25 °.
  5. Umieść szczenięta poddane elektryzacji na poduszce grzewczej na 5 minut. Delikatnie obracaj szczenięta co 30 sekund z łagodną stymulacją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektroporacja strefy podkomorowej noworodka powoduje oznakowanie prawie wszystkich promieniowych komórek glejowych przylegających do grzbietowej, grzbietowej bocznej i bocznej strefy podkomorowej po "zamaszystym" ruchu elektrody pęsety (Rysunek 1E). Jednak elektroporacja może być dostosowana do wymagań danego eksperymentu, ale bez zamiatania elektrody i przy użyciu określonego umiejscowienia i orientacji, jak opisano na filmie. Na przykład, ponieważ glej promieniowy zlokalizowany grzbietowo różni się od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu szczegółowo opisujemy technikę elektroporacji SVZ u noworodków, technikę szybkiego i solidnego znakowania i manipulowania komórkami macierzystymi SVZ i ich potomstwem. Istnieje kilka zalet, jakie ma elektroporacja w porównaniu z innymi technikami. Po pierwsze, biorąc pod uwagę ogniskowe znakowanie komórek, można dostrzec efekty autonomiczne i nieautonomiczne komórek. Po drugie, manipulacja genetyczna za pomocą systemów indukowalnych pozwala na porównanie efektów przed lub po integracji synaptycznej. Ponadto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Departamentu Obrony (Nagroda za rozwój pomysłów, W81XWH-10-1-0041, A.B.), CT Stem cell grant (A.B.) oraz National Institute of Health NRSA 10668225 (D.M.F). Niniejszy materiał opiera się na pracach częściowo wspieranych przez stan Connecticut w ramach programu Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy stanu Connecticut, Departamentu Zdrowia Publicznego stanu Connecticut lub CT Innovations, Inc. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ciężkie, polerowane rurki borokrzemianowe Sutter InstrumentBF150-110-10
Dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych NarishigePC-10H
Szybki zielony Fischer Scientific0521192205
ECM 830 Generator impulsów fali prostokątnej Aparat Harvard45-0052
PęsetyAparatHarvarda45-0488
Światłowodowe źródło światłaFisher Scientific12-562-36
Wolframowa lampa halogenowaUSHIO America, Inc1002247
Picospritzer IIParker Instruments052-0312-900

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64(2011).
  3. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883(2008).
  6. Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517(2008).
  7. Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  8. Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
  9. Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13(2011).
  10. de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
  11. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
  12. Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
  13. Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neonatal SVZ ElectroporationSubventricular ZoneNeural Stem CellsElectroporation TechniqueDNA InjectionImmunohistochemistryMicroscopy AnalysisElectrophysiology MethodsCell Fate AnalysisPup Anesthesia

Powiązane artykuły