Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Podsumowanie

Chromosomy mogą być izolowane z żywych komórek, takich jak limfocyty czy fibroblasty skóry, oraz z organizmów, w tym ludzi i myszy. Te preparaty chromosomowe mogą być dalej wykorzystywane do rutynowych prążków G i procedur cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY).

Streszczenie

Analiza chromosomów (cytogenetyczna) jest szeroko stosowana do wykrywania niestabilności chromosomów. Po zastosowaniu pasm G i technik molekularnych, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), test ten ma potężną zdolność do analizowania pojedynczych komórek pod kątem aberracji, które obejmują zyski lub straty części genomu oraz rearanżacje obejmujące jeden lub więcej chromosomów. U ludzi nieprawidłowości chromosomowe występują u około 1 na 160 żywych urodzeń^1,2, 60-80% wszystkich poronień^3,4, 10% martwych urodzeń^2,5, 13% osób z wrodzonymi wadami serca⁶, 3-6% przypadków niepłodności² oraz u wielu pacjentów z opóźnieniem rozwoju i wadami wrodzonymi⁷. Analiza cytogenetyczna nowotworu złośliwego jest rutynowo stosowana przez badaczy i klinicystów, ponieważ wykazano, że obserwacje klonalnych nieprawidłowości chromosomowych mają znaczenie zarówno diagnostyczne, jak i prognostyczne^8,9. Izolacja chromosomów jest nieoceniona w terapii genowej i badaniach nad komórkami macierzystymi organizmów, w tym naczelnych i gryzoni^10-13.

Chromosomy mogą być izolowane z komórek żywych tkanek, w tym limfocytów krwi, fibroblastów skóry, amniocytów, łożyska, szpiku kostnego i próbek nowotworów. Chromosomy są analizowane na etapie metafazy mitozy, kiedy są najbardziej zagęszczone, a zatem wyraźniej widoczne. Pierwszy etap techniki izolacji chromosomów polega na rozerwaniu włókien wrzeciona poprzez inkubację z Colcemidem, aby zapobiec przejściu komórek do kolejnego etapu anafazy. Komórki są następnie traktowane roztworem hipotonicznym i konserwowane w stanie spuchniętym za pomocą utrwalacza Carnoya. Komórki są następnie umieszczane na szkiełkach i mogą być następnie wykorzystywane do różnych procedur. G-banding polega na leczeniu trypsyną, a następnie barwieniu Giemsa w celu stworzenia charakterystycznych jasnych i ciemnych pasm. Ta sama procedura izolacji chromosomów może być stosowana do przygotowania komórek do procedur takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY)^14,15.

Wprowadzenie

Analiza chromosomów jest konwencjonalną techniką stosowaną na całym świecie do diagnozowania niestabilności chromosomów i rearanżacji prowadzących do zaburzeń genetycznych i nowotworów złośliwych^1,2,8,9. Ponadto, wyższa rozdzielczość dla diagnozy i badań konstytucyjnych i nabytych przez raka nieprawidłowości genetycznych może być osiągnięta dzięki połączeniu klasycznych procedur cytogenetycznych i metodologii cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY)^14,15. Ostatnio techniki te zostały wykorzystane do oceny niestabilności chromosomów związanej z badaniami nad komórkami macierzystymi. Nieprawidłowości kariotypowe, takie jak aneuploidia długotrwale hodowanych komórek embrionalnych (ES) i dorosłych komórek macierzystych różnych organizmów, zostały zgłoszone przez wiele laboratoriów. Najnowsze dowody potwierdzają, że niektóre linie komórkowe są z natury bardziej skłonne do niestabilności chromosomów, niezależnie od warunków hodowli. Z tego powodu przy tworzeniu i/lub utrzymywaniu linii komórek macierzystych ludzkich, mysich lub rezusów zaleca się analizę chromosomów jako część procesu kontroli jakości. Wiele doniesień opisuje rosnące zainteresowanie stosowaniem cytogenetyki rutynowej i molekularnej do monitorowania stabilności chromosomalnej komórek macierzystych i komórek nowotworowych lub różnych organizmów w hodowli^10-13. Protokoły te są coraz częściej wykorzystywane przez laboratoria niegenetyczne do szybkiej oceny chromosomów hodowanych komórek¹³. Przedstawiamy nasze podstawowe procedury preparacji chromosomów z różnych typów komórek, które mogą być stosowane zarówno do celów klinicznych, jak i badawczych oraz komórek pochodzących z różnych organizmów.

Protokół

1. Pobieranie chromosomów z przylegających komórek

1. Protokół standardowy
   1. Hoduj komórki zgodnie z określonymi warunkami hodowli komórek. Gdy komórki osiągną fazę logarytmiczną (80% konfluencji), dodać 10 μl/ml Colcemidu do kolby do hodowli komórkowej. Zalecane są co najmniej 2 x 10⁶ komórek.
   2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO_{2 przez} 45 minut. Za pomocą sterylnej pipety przenieś pożywkę z komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Uchylenie.
   3. Delikatnie przemyć komórki, dodając 2 ml buforu HBSS do kolby. Zakręć buforem, a następnie usuń go za pomocą pipety. Odrzucić.
   4. Dodać 1 ml trypsyny, upewniając się, że pokrywa ona całą powierzchnię kolby. Pozostaw komórki w trypsynie tylko na około 2 minuty. Gdy większość komórek się odłączy, odpipetuj pożywkę w stożkowej probówce z powrotem na komórki.
   5. Przenieść zawiesinę komórek w podwielokrotnościach o objętości 10 ml do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 10 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad.
   6. Dodać 10 ml 0,075 M KCl, który został wstępnie podgrzany do 37 °C, do pozostałego osadu w stożkowej probówce. Rurka wirowa ze średnią prędkością, aby wymieszać KCl i komórki.
   7. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C. Usunąć supernatant (do momentu, aż pozostanie około 0,5 ml) i ponownie zawiesić osad.
   8. Ostrożnie dodaj 5 ml świeżego utrwalacza Carnoy's Fixative (stosunek 3:1 metanolu do lodowatego kwasu octowego) do komórek podczas wirowania. Następnie dodaj 5 ml więcej utrwalacza bez wirowania, co daje w sumie 10 ml.
   9. Wirować przy 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki. Dodać 5 ml utrwalacza do każdej probówki.
   10. Wirować przy 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki. Dodać 5 ml utrwalacza do każdej probówki. Ogniwa mogą być teraz przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego roku.
2. Modyfikacja Protokołu: Pobieranie chromosomów z linii komórkowych limfoblastoidów
   1. Hoduj komórki zgodnie z określonymi warunkami hodowli komórek. (Użyć kolby odpowiedniej do ilości hodowanych komórek). Gdy komórki osiągną fazę logarytmiczną (około 2 dni po podziale komórek), dodać 10 μl/ml Colcemidu do kolby do hodowli komórkowej.
3. Modyfikacja protokołu: Pobieranie chromosomów z krwi pełnej
   Fitohemaglutynina (PHA), lektyna pochodząca z czerwonej fasoli, jest silnym mitogenem dla ludzkich limfocytów T¹⁶. 72 godziny po dodaniu PHA do hodowli około 45% komórek znajduje się w fazie S. Reprezentuje to szczytową aktywność mitotyczną i jest optymalnym punktem, w którym można zbierać plony do badań chromosomowych. Inne mitogeny, takie jak szkarłatka (1-10 μg/ml) mogą być używane podczas analizy limfocytów B^17,18.
   1. Zebrać co najmniej 1 ml krwi pełnej do zielonej górnej probówki z heparyną sodu. Zużyć w ciągu 3 dni po pobraniu. Przechowuj krew w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie gotowa do użycia.
   2. Podwielokrotność 0,25 ml krwi pełnej w 10 ml kompletnej pożywki RPMI zawierającej L-glutaminę (20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% fungizonu i 1% PHA). Hodowla w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
4. Modyfikacja protokołu: Pobieranie chromosomów ze szpiku kostnego
   Analiza cytogenetyczna szpiku kostnego jest pomocna w wielu złośliwych zaburzeniach hematologicznych, ponieważ obserwacja chromosomalnie nieprawidłowego klonu może być diagnostyczna dla określonego typu białaczki. Badania chromosomów są również wykorzystywane do oceny postępu choroby, takiej jak początek przełomu blastycznego i odpowiedź na leczenie. Ponieważ komórki szpiku kostnego aktywnie się dzielą, stymulacja mitogenem nie jest konieczna^9,19. W przypadku ostrych białaczek zakłada się również posiewy po 24 i 48 godzinach.
   1. Zebrać co najmniej 1 ml szpiku kostnego w zielonej górnej probówce z heparyną sodu. Podwielokrotność 0,25 ml szpiku kostnego w 10 ml kompletnej pożywki RPMI zawierającej L-glutaminę (20% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicylina/streptomycyna, 1% fungizon). Hodowla w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

2. Przygotowanie szkiełek i barwienie ciał stałych

Szybka ocena jednego reprezentatywnego preparatu dostarczy informacji na temat jakości zbiorów przed przejściem do dalszych procedur, takich jak G-banding, FISH, CGH lub SKY. Niektóre laboratoria wolą barwienie komórek na stałe w celu szybkiego pobrania i oceny chromosomów. Alternatywnie do tej analizy można użyć mikroskopu z kontrastem fazowym. Preparaty najlepiej przygotowywać się, gdy wilgotność wynosi około 50%, a temperatura otoczenia (20-25 °C).

1. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 25 °C. Usunąć supernatant do momentu, aż pozostanie tylko 0,3-0,5 ml.
2. Po delikatnym ponownym wymieszaniu osadu, należy odpipetować trzy krople zawiesiny ogniwa z odległości około 2 cali na szkiełko przechylone pod kątem około 45° i pozwolić, aby zawiesina przetoczyła się po szkiełku. Dodaj jedną dużą kroplę świeżego utrwalacza Carnoy's do szkiełka.
3. Osusz tył szkiełka na ręczniku papierowym, a następnie odłóż szkiełko do wyschnięcia na co najmniej 10 minut. Zjeżdżalnia powinna być całkowicie sucha.
4. Przygotuj świeży roztwór barwiący Giemsa (proporcje 3:1 buforu Gurr i plamy Giemsa). Umieść szkiełka na stojaku do barwienia. Przykryj całe szkiełko roztworem barwiącym Giemsa. Pozostaw szkiełka w roztworze barwiącym na 5 minut. Opłucz szkiełka wodą destylowaną, odcedź i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
5. Dodaj 4 krople Permount i szkiełko nakrywkowe do szkiełka. Upewnij się, że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza. Nadmiar Permount można usunąć ręcznikiem papierowym.
6. Analizuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego pod 10-krotnym i 100-krotnym powiększeniem. Jeśli komórki metafazy są obfite i dobrze rozproszone, pozostałe szkiełka można wykorzystać do innych procedur eksperymentalnych.

3. G-Banding z użyciem trypsyny i Giemsy (GTG)

Trypsyna jest enzymem proteolitycznym, który denaturuje histony euchromatyczne w regionach DNA, co skutkuje wyższą aktywnością transkrypcyjną. Po barwieniu Giemsa obszary te pojawią się jako jasne pasma. Wysoce skondensowana chromatyna o małej lub zerowej aktywności transkrypcyjnej (heterochromatyna) będzie miała dużą część swoich histonów chronionych przed trypsyną i dlatego będzie się barwić ciemno po barwieniu Giemsa. Konieczne jest, aby początkowo wstęgę G obejmowała jeden slajd, aby monitorować warunki i w razie potrzeby dostosować czas trypsyny do kolejnych slajdów.

1. Dodaj następujące roztwory do 4 słoików Coplin.
   Słoik #1 = 30 ml 1x HBSS i 4 ml 10x trypsyna (0,5%)
   Słoik #2= 50 ml 1x HBSS
   Słoik #3 = 45 ml 1x HBSS i 5 ml płodowej surowicy bydlęcej
   Słoik #4 = 50 ml 1x HBSS
2. Zanurz każde szkiełko w słoiku #1 na 5 sekund, szybko spłucz w słoiku #2, pozostaw każde szkiełko w słoiku #3 na co najmniej 30 sekund, szybkie spłucz w słoiku #4, a następnie pozostaw szkiełka do wyschnięcia.
3. Przygotuj świeży roztwór barwiący Giemsa (proporcje 3:1 buforu Gurr i plamy Giemsa). Umieść szkiełka na stojaku do barwienia. Przykryj całe szkiełko roztworem barwiącym Giemsa. Pozostaw szkiełka w roztworze barwiącym na 5 minut.
4. Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej w tej samej kolejności, w jakiej zostały poplamione. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na około 10 minut. Zjeżdżalnia powinna być całkowicie sucha.
5. Dodaj 4 krople Permount i szkiełko nakrywkowe do szkiełka. Upewnij się, że pod szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza. Nadmiar Permount można usunąć ręcznikiem papierowym.
6. Analizuj komórki za pomocą mikroskopu świetlnego pod 10-krotnym i 100-krotnym powiększeniem. Dostosuj czas trypsyny pozostałych slajdów na podstawie wyników pierwszego slajdu.

Wyniki

Wysokiej jakości preparaty rozprzestrzenionych metafaz są niezbędne do analizy chromosomów. Prawidłowo przeprowadzony test pozwala uzyskać chromosomy, które są dobrze rozdzielone i posiadają odpowiednią morfologię. Prawidłowo opasione chromosomy (G-banding) wykazują charakterystyczne jasne i ciemne wzory prążkowania.

Dyskusja

Wykorzystaliśmy obecną procedurę do izolacji chromosomów z komórek różnych organizmów, w tym różnych typów komórek uzyskanych od ludzi, makaków rezusów, szczurów i myszy^11,20-22. Dostępny jest standardowy protokół, ale niektóre kluczowe kroki i zmienne mogą wymagać dostosowania do tych różnych typów komórek. Zarówno w przygotowaniu chromosomów, jak i w prążku G kluczowe jest kilka konkretnych etapów, aby zapewnić najlepszą możliwą jakość wyników. Jedną ze zmiennych, które mogą mieć wpływ na wynik testu, jest c...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
Bufor HBSS	Gibco	24020-117
0,5% Trypsyna EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
"GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Wirówka 5810	Eppendorf
Metanol	Caledon Laboratory Chemicals	6700130
Lodowaty kwas octowy	Krackeler Scientific Inc.	Numer katalogowy: 11-9508-05

Tabletki buforowe