Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Podsumowanie

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca²⁺ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Streszczenie

Badanie właściwości elektrofizjologicznych kanałów jonowych serca za pomocą techniki patch-clamp oraz badanie nieprawidłowości w radzeniu sobie z nieprawidłowościami w działaniu komórek sercowych Ca²⁺ wymaga izolowanych kardiomiocytów. Ponadto możliwość badania miocytów od pacjentów przy użyciu tych technik jest nieocenionym wymogiem dla wyjaśnienia molekularnych podstaw chorób serca, takich jak migotanie przedsionków (AF). ¹ W tym miejscu opisano metodę izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych, która nadaje się zarówno do badań typu patch-clamp, jak i jednoczesnych pomiarów wewnątrzkomórkowych stężeń Ca²⁺. Po pierwsze, przydatki prawego przedsionka uzyskane od pacjentów poddawanych operacji na otwartym sercu są cięte na małe kawałki tkanek ("metoda fragmentów") i myte w roztworze wolnym od Ca²⁺. Następnie fragmenty tkanek są trawione w roztworach zawierających kolagenazę i proteazę o zawartości 20 μM Ca²⁺. Następnie wyizolowane miocyty są zbierane przez filtrację i odwirowanie zawiesiny tkankowej. Na koniec stężenie Ca²⁺ w roztworze do przechowywania komórek dostosowuje się stopniowo do 0,2 mM. Pokrótce omawiamy znaczenie buforowania Ca²⁺ i Ca²⁺ podczas procesu izolacji, a także zapewniamy reprezentatywne zapisy potencjałów czynnościowych i prądów błonowych, zarówno wraz z jednoczesnymi pomiarami przejściowymi^Ca2+, wykonanymi w tych izolowanych miocytach.

Wprowadzenie

Badanie właściwości elektrofizjologicznych kanałów jonowych serca za pomocą techniki patch-clamp oraz badanie nieprawidłowości w obsłudze komórkowych Ca²⁺ wymaga izolowanych kardiomiocytów. Są one zwykle uzyskiwane po ekspozycji in vitro próbek tkanki serca na działanie enzymów trawiennych (kolagenazy, hialuronidazy, peptydazy itp.). Od czasu pierwszego doniesienia o izolacji żywotnych miocytów serca w 1955 r.^opracowano dużą liczbę protokołów w celu pobrania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych od różnych gatunków, w tym myszy, szczura, królika, psa, świnki morskiej i człowieka. W niniejszym przeglądzie skupiono się na izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych. Jeśli chodzi o procedury izolacji miocytów od innych gatunków, odsyłamy do "Przewodnika dysocjacji tkanek Worthington" dostarczonego przez Worthington Biochemical Corp., USA (www.tissuedissociation.com).

Protokoły izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych są zazwyczaj oparte na metodzie opisanej przez Bustamante i wsp.³ W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku opis techniki, która jest zaadaptowana z wcześniej opublikowanej metody, w celu uzyskania miocytów przedsionkowych odpowiednich nie tylko do eksperymentów typu patch-clamp, ale także do jednoczesnych wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca²⁺. ^4-11

Rozdział

Protokół

Protokoły eksperymentalne muszą zostać zatwierdzone przez lokalną komisję etyki, a wszyscy pacjenci muszą wyrazić pisemną świadomą zgodę. Nasze badania zostały zatwierdzone przez komisję etyki Wydziału Medycznego w Mannheimie Uniwersytetu w Heidelbergu (#2011-216N-MA) i przeprowadzono je zgodnie ze wszystkimi instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu ludzi. Wszyscy pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę.

0. Pozyskiwanie tkanki przedsionkowej człowieka

Podczas rutynowych procedur kaniulacji u pacjentów poddawanych operacjom kardiochirurgicznym w celu wykonania pomostowania aortokoronarnego z wykorzystaniem krążenia pozaustrojowego, zazwyczaj usuwa się wierzchołek uszka prawego przedsionka, który może zostać wykorzystany do izolacji kardiomiocytów przedsionkowych. Po wycięciu próbkę tkanki przenosi się natychmiast do probówki Falcon o pojemności 50 ml z jałowym, wolnym od Ca²⁺ roztworem transportowym zawierającym monoksym 2,3-butanodionu (Tabela I; BDM, inhibitor skurczu, zapobiegający kurczeniu się miocytów). Przy czasie transportu wynoszącym od 30 do 45 min nie stwierdzono wyraźnej korzyści z chłodzenia lub napowietrzania w odniesieniu do liczby i jakości izolowanych kardiomiocytów przedsionkowych. Co do zasady transport do laboratorium powinien być jak najszybszy. Jeśli jednak nie można uniknąć dłuższego czasu transportu, korzystne może być przemieszczanie próbek w temperaturze 4 °C w roztworze napowietrzonym.

1. Przygotowania wstępne

1. Włącz termocyklator, który kontroluje temperaturę zlewki z płaszczem grzewczym (Tabela II). Upewnij się, że temperatura wewnątrz zlewki wynosi 37 °C. Przykryj zlewkę szklaną pokrywką, aby utrzymać stałą temperaturę wewnątrz naczynia przez cały proces izolacji.
2. Odważ kolagenazę I oraz proteazę XXIV do trzech szklanych zlewków i przechowuj je w temperaturze pokojowej. Enzymy zostaną rozcieńczone bezpośrednio przed użyciem.
3. Przechowuj 20 ml roztworu wolnego od Ca²⁺ w szalce Petri w temperaturze 4 °C.
4. Przechowuj 250 ml roztworu wolnego od Ca²⁺ w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C.

2. Oczyszczanie tkanki

1. Przenieść próbkę tkanki wraz z roztworem transportowym do szalki Petriego (~10 cm średnicy) i usunąć nożyczkami zbędną tkankę tłuszczową.
2. Zważyć próbkę tkanki. Do izolacji komórek wykorzystuje się od 200 do 600 mg. Pozostałą tkankę można zamrozić w ciekłym azocie do późniejszych analiz biochemicznych.
3. Przenieść próbkę tkanki do szalki Petriego zawierającej 20 ml roztworu wolnego od Ca²⁺ w temperaturze 4 °C (patrz krok 1.3) i posiekać tkankę na małe kawałki o rozmiarze około 1 mm³.
4. Kolejne kroki należy przeprowadzić w temperaturze 37 °C przy ciągłym napowietrzaniu 100% O₂. Na rurkę z tlenem można nałożyć końcówkę pipety, aby uniknąć silnego bąbelkowania i zapewnić ciągły przepływ powietrza.
5. Przenieść kawałki tkanki wraz z roztworem wolnym od Ca²⁺ do zlewki z płaszczem grzewczym i ostrożnie mieszać przez około 3 min za pomocą magnetycznego mieszadła.
6. Zatrzymać mieszanie i odczekać kilka sekund, aż kawałki tkanki opadną na dno. Ostrożnie odfiltrować nadsącz przez nylonowe sito (200 μm, Tabela II). Za pomocą pęsety przenieść zatrzymane na sicie kawałki tkanki z powrotem do zlewki.
7. Ponownie napełnić zlewkę roztworem wolnym od Ca²⁺ i powtórzyć etapy płukania 2.4 oraz 2.5 dwukrotnie.

3. Pierwsze trawienie enzymatyczne

1. Ponownie zawiesić fragmenty tkanki w 20 ml roztworu enzymatycznego E1 (Tabela I) zawierającego kolagenazę i proteazę, a następnie ostrożnie mieszać przez 10 min.
2. Dodać 40 μl 10 mM roztworu CaCl₂, aby uzyskać stężenie końcowe 20 μM Ca²⁺.
3. Po 35 min ostrożnie przefiltrować nadsącz przez nylonowe sito (200 μm, Tabela II) w taki sposób, aby większość fragmentów tkanki pozostała w zlewce. Zwrócić zatrzymane na sicie fragmenty tkanki do zlewki.

4. Druga digestia enzymatyczna

1. Ponownie resuspender fragmenty tkanki w 20 ml roztworu enzymatycznego E2 zawierającego wyłącznie kolagenazę I (Tabela I). Natychmiast dodać 40 μl 10 mM roztworu CaCl₂, aby uzyskać stężenie końcowe 20 μM Ca²⁺.
2. Podczas drugiego trawienia sporadycznie rozdrabniać grudki tkanki za pomocą nożyczek.
3. Po 5 min pobrać próbkę za pomocą pipety Pasteura, aby sprawdzić stopień dysocjacji komórek. Powtarzać tę czynność co 2-3 min, aż pojawią się prążkowane kardiomiocyty w kształcie pręta.
4. Przerwać mieszanie i pozwolić fragmentom tkanki opaść na dno przez około 20-30 s.
5. Ostrożnie przefiltrować nadsącz przez nylonowe sito (200 μm, Tabela II) do probówki Falcon 50 ml (Probówka A). Pozostałe na sicie fragmenty tkanki przenieść z powrotem do zlewki.
6. Ponownie resuspender fragmenty tkanki w zlewce w 20 ml roztworu do przechowywania (Tabela I)¹⁰ i dalej dysocjować komórki poprzez delikatną tryturację mechaniczną przy użyciu pipety serologicznej 20 ml z dozownikiem. Należy starać się unikać powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ są one szkodliwe dla przeżywalności i jakości komórek.
7. Ostrożnie przefiltrować nadsącz przez nylonowe sito (200 μm, Tabela II) do probówki Falcon 50 ml (Probówka B).

5. Końcowe przygotowanie i dostosowanie końcowego stężenia Ca²⁺

1. Odwiruj obie probówki Falcon A i B (patrz kroki 4.5 i 4.7) przy 95 x g przez 10 min.
2. Ostrożnie usuń nadsącz z obu probówek poprzez aspirację. Upewnij się, że osad nie został naruszony. Odrzuć nadsącz.
3. Resuspenduj oba osady, dodając do każdej probówki 1,5 ml roztworu do przechowywania (Table I) (temperatura pokojowa).
4. Do każdej probówki Falcon dodaj dwukrotnie 7,5 μl roztworu 10 mM CaCl₂ i dokładnie wymieszaj. Po każdym kroku inkubuj przez 10 min.
5. Dodaj 15 μl roztworu 10 mM CaCl₂, aby uzyskać końcowe stężenie Ca²⁺ wynoszące 0,2 mM.

6. Obciążanie miocytów fluorescencyjnym wskaźnikiem Ca²⁺ Fluo-3 AM (Rysunek 1)

1. Przenieś 1,5 ml zawiesiny komórkowej (probówka A i/lub probówka B) do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml (probówka typu Eppendorf).
2. Kolejne kroki należy wykonywać z uwzględnieniem światłoczułości fluorescencyjnego wskaźnika Ca²⁺ Fluo-3.
3. Rozpuść 50 μg przepuszczalnej przez błony pochodnej estru acetoksymetylowego Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabela III) w 44 μl roztworu stokowego Pluronic F-127 (Tabela III) (20% w/v w bezwodnym DMSO), aby otrzymać 1 mM roztwór stokowy Fluo-3 AM, który można przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 1 tydzień.
4. Dodaj 15 μl roztworu stokowego Fluo-3 AM do probówki do mikrowirówki zawierającej 1,5 ml zawiesiny komórkowej (patrz krok 6.1) i ostrożnie wymieszaj.
5. Inkubuj zawiesinę komórkową przez 10 min w nieprzezroczystym pudełku.
6. Krótko wiruj przy prędkości około 6 000 rpm.
7. Odlaniu nadmiar nadsączu i zawiesić osad ponownie w 1,5 ml roztworu kąpielowego (Tabela IV).
8. Pozostaw zawiesinę komórkową na około 30 min w celu deestryfikacji przed rozpoczęciem eksperymentów.

7. Jednoczesne pomiary techniką patch-clamp oraz epifluorescencyjne pomiary Ca²⁺

Ponieważ pomiary metodą patch-clamp nie są głównym tematem niniejszego przeglądu, odsyłamy zainteresowanego czytelnika do innych publikacji zawierających bardziej szczegółowy opis tej techniki.^11-14 Dla zachowania kompletności przedstawiamy zwięzłe podsumowanie protokołu pomiaru potencjałów czynnościowych lub prądów Ca²⁺ typu L, w obu przypadkach wraz z jednoczesnym zapisem przejściowych zmian stężenia Ca²⁺.

Podczas eksperymentów miocyty są poddawane superfuzji w temperaturze 37 °C roztworem kąpieli (Tabela IV) przy użyciu systemu szybkiej perfuzji (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). W eksperymentach z zaciskiem napięciowym (voltage-clamp) prądy K⁺ są blokowane poprzez dodanie do roztworu kąpieli 4-aminopirydyny (5 mmol/L) oraz BaCl₂ (0.1 mmol/L). Stosuje się borokrzemowe mikroelektrody szklane, których oporność końcówki po napełnieniu roztworem pipety (Tabela V) powinna wynosić 2-5 MΩ. Oprócz obciążania miocytów Fluo-3 AM (patrz krok 6), Fluo-3 jest również zawarty w roztworze pipety (Tabela V). Fluorescencję wzbudza się przy 488 nm, a emitowane światło (<520 nm) konwertuje się na [Ca²⁺]_i przy założeniu

gdzie k_d=stała dysocjacji Fluo-3 (864 nM), F=fluorescencja Fluo-3; F_max=fluorescencja przy nasyceniu Ca²⁺ uzyskana na koniec każdego eksperymentu.¹² Sygnały elektryczne oraz sygnały Ca²⁺ w epifluorescencji są rejestrowane jednocześnie. Potencjały czynnościowe są stymulowane z częstotliwością 0,5 Hz w trybie clampingu prądowego (current-clamp) przy użyciu 1 ms impulsów prądowych o sile 1,2x progu pobudzenia. Prądy Ca²⁺ typu L są mierzone w trybie clampingu napięciowego (voltage-clamp) przy potencjale spoczynkowym -80 mV i 100 ms impulsie rampowym do -40 mV w celu inaktywacji szybkich prądów Na⁺, a następnie 100 ms impulsie testowym do +10 mV z częstotliwością 0,5 Hz.

Wyniki

Rycina 2A przedstawia trzy reprezentatywne przykłady wyizolowanych miocytów prawego przedsionka człowieka. Aby określić liczbę uzyskanych komórek, nanosimy pipetą 10 μl zawiesiny komórkowej (krok 5.5) na szkiełko do mikroskopu CellFinder (http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html). Średnie liczby uzyskanych komórek na Rycynie 2B wyraźnie wskazują na tendencję do niższej wydajności komórkowej w próbkach pobranych od pacjentów z przewlekłym migotaniem przedsionków (cAF) (probówka A: 16,5±3,1 komórek/10 μl (n=29) w SR vs. 5,1±2,3 komórek/10 μl (n=10) w cAF, p<0,05; probówka B: 17,9±3,9 komórek/10 μl (n=29) w SR vs. 5,9±2,0 komórek/10 μl (n=9) w cAF, p=0,107).

Reprezentatywne przykłady pomiarów potencjałów czynnościowych oraz jednoczesnych rejestracji przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ w cytozolu przedstawiono na Rysunku 3. W około 90% badanych komórek uwolnienie Ca²⁺ wywołane potencjałem czynnościowym powoduje wyraźne i regularne skurcze komórek. Jak raportowano wcześniej, spoczynkowy potencjał błonowy, będący uznanym wskaźnikiem integralności komórek, wynosił średnio około -73,9±2,7 mV (n = 23/10 miocytów/pacjentów) w SR oraz -77,7±1,8 mV (n = 19/8 miocytów/pacjentów) w cAF (p>0,05).¹⁵ Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne jednoczesne rejestracje napięciozależnych prądów Ca²⁺ typu L oraz przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ w cytozolu. Zastosowanie nieselektywnego agonisty β-adrenoreceptorów, izoprenaliny (1 μM), zwiększa amplitudy zarówno I_Ca,L, jak i przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ w cytozolu, co sugeruje nienaruszoną kaskadę transdukcji sygnałów β-adrenergicznych.

Rycina 1. Schemat protokołu ładowania miocytów Fluo-3 AM (patrz kroki 6.1-6.5). m/v, masa/objętość.

Rycina 2. A, Izolowane miocyty prawego przedsionka ludzkiego po jednej godzinie w roztworze do przechowywania. B, Średnia±SEM wydajności komórek policzonych w 10 μl komórek w roztworze do przechowywania (patrz krok 5.5). n oznacza liczbę preparatów w każdej grupie. *p<0.05.

Rysunek 3. Reprezentatywne zapisy wywołanych potencjałem czynnościowym przejściowych wzrostów stężenia Ca²⁺ (CaT) w miocycie przedsionkowym pacjenta z rytmem zatokowym oraz pacjenta z przewlekłym migotaniem przedsionków. Góra: Wstrzyknięty prąd błonowy (I_M) użyty do stymulacji (0.5 Hz). Dół: Jednoczesny zapis potencjału błonowego (V_M) oraz wywołanego CaT (na dole). (Wykresy przerysowane za zgodą Voigt et al. 2012)¹⁵

Rysunek 4. Reprezentatywne zapisy działania izoprenaliny (1 μM) wpływ na kanały wapniowe typu L²⁺ uwolnienie $\text{Ca}^{2+}$ indukowane prądem²⁺-przejściowe (CaT) w miocycie przedsionkowym pacjenta z rytmem zatokowym oraz pacjenta z przewlekłym migotaniem przedsionków. Góra: Protokół zaciskania napięcia (voltage-clamp) (0,5 Hz). Dół: Jednoczesny pomiar całkowitego wypadkowego prądu błonowego (I_M), odzwierciedlające głównie prądy Ca2+ typu L²⁺ bieżący (środkowy) oraz wywołany CaT (dolny). (Przedrysowano za zgodą Voigta, i wsp. 2012)¹⁵

Tabela I. Roztwory.

Tabela II. Specjalistyczny sprzęt.

Tabela III. Substancje do obciążania miocytów Fluo-3 AM.

Tabela IV. Roztwór kąpielowy do techniki patch-clamp.

Tabela V. Roztwór do pipety dla techniki patch-clamp*.

Dyskusja

W tym artykule opisano metodę izolacji ludzkich miocytów przedsionków z przydatków prawego przedsionka uzyskanych od pacjentów poddawanych operacji na otwartym sercu. Aby wykorzystać te miocyty do pomiarów cytozolowego Ca²⁺ , dostosowaliśmy wcześniej opisaną metodę^4-11 , pomijając EGTA w roztworze magazynowym.

Już w 1970 roku zaobserwowano, że chociaż miocyty dysocjują w obecności^Ca2+ podczas trawienia, wszystkie z nich były w przykurczu i nie były zdolne do życia. ^16,17 Dlatego izolację komórek przeprowadza się w roztworze wolnym od^Ca2+. Jednak ponowne wprowadzenie fizjologicznych stężeń^Ca2+ spowodowało szybki napływ^Ca2+ i śmierć komórek. Zostało to opisane jako zjawisko paradoksu Ca²⁺, które zostało pierwotnie zaobserwowane w perfuzjach serc przez Zimmermana i Hulsmana. ¹⁸ Sugeruje się modyfikacje pożywki izolacyjnej, w tym obniżenie pH do 7,0,19, dodanie tauryny²⁰ lub niewielkich ilości Ca²⁺ (patrz kroki 3.2 i 4.1),²¹ a także przechowywanie wyizolowanych miocytów w EGTA zawierającym roztwór magazynowy²² w celu zapobieżenia paradoksowi Ca^{2 +}. ¹⁷ Wiadomo jednak, że buforowanie Ca²⁺ przez EGTA zmniejsza amplitudę amplitudy przejściowych^{Ca 2+} indukowanych prądem Ca 2+ typu L i powoduje dwufazowy rozpad stanów nieustalonych^Ca2+. ²³ W związku z tym pominęliśmy EGTA w całym procesie izolacji, aby uzyskać stany nieustalone Ca²⁺ o typowych właściwościach i rozpadach jednofazowych. Aby chronić komórki przed paradoksem Ca²⁺, stopniowo zwiększaliśmy końcowe stężenie Ca²⁺ w roztworze magazynującym do 0,2 mM.

Wybór kolagenazy jest prawdopodobnie najważniejszym krokiem dla udanej izolacji miocytów. Konwencjonalne kolagenazy są surowymi preparatami otrzymywanymi z Clostridium histolyticum i zawierają kolagenazę wraz z wieloma innymi proteinazami, polisacharydazami i lipazami. Ze względu na ich ogólny skład kolagenazy dzielą się na różne typy. ²⁴ Kolagenaza Worthington typu I i II jest z powodzeniem stosowana do izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych. ^{4-10,15,25-30} W naszym obecnie opisanym protokole zalecamy stosowanie kolagenazy typu I, chociaż udało nam się również uzyskać akceptowalne ilości żywotnych komórek przy użyciu kolagenazy typu II. Jednak nawet w obrębie jednego rodzaju kolagenazy istnieje znaczna różnica między partiami pod względem aktywności enzymu. Różnice te wymagają starannego doboru partii i testowania różnych partii w celu optymalizacji procedury izolacji. Dostępne online narzędzie do wyboru partii firmy Worthington Biochemical Corp. (http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php) może być wykorzystane do znalezienia dostępnych partii o składzie, który okazał się odpowiedni do izolacji ludzkich miocytów przedsionkowych. Obecnie używamy kolagenazy typu I o aktywności kolagenazy 250 U/mg, aktywności kazeinazy 345 U/mg, aktywności klostripainy 2,16 U/mg i aktywności tryptycznej 0,48 U/mg (partia # 49H11338).

Komórki uzyskane przy użyciu procedury opisanej w tym manuskrypcie mogą być wykorzystane w ciągu 8 godzin do badań typu patch-clamp, pomiarów przejściowych Ca²⁺ i kombinacji obu. ¹⁵ Ponadto komórki te umożliwiają pomiary skurczu komórek w odpowiedzi na stymulację polem elektrycznym lub stymulację elektryczną za pomocą pipety typu patch-clamp (obserwacje niepublikowane).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
			Roztwór transportowy
Albumina	Sigma-Aldrich	A3059	Roztwór do przechowywania: 1%
BDM	Sigma-Aldrich	31550	Roztwór transportowy: 30
Kwas DL-β-hydroksymaślanowy	Sigma-Aldrich	H6501	Roztwór do przechowywania: 10
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270	Roztwór transportowy: 20 roztwór wolny od jonów Ca2+: 20 Roztwory enzymów E1 i E2: 20 Roztwór do przechowywania: 10
Kwas L-glutaminowy	Sigma-Aldrich	G1251	Roztwór do przechowywania: 70
KCl	Merck	1049360250	Roztwór transportowy: 10 roztwór wolny od jonów Ca2+: 10 Roztwory enzymów E1 i E2: 10 Roztwór do przechowywania: 20
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Roztwór transportowy: 1.2 roztwór wolny od jonów Ca2+: 1.2 Roztwory enzymów E1 i E2: 1.2 Roztwór do przechowywania: 10
MgSO4	Sigma-Aldrich	M9397	Roztwór transportowy: 5 roztwór wolny od jonów Ca2+: 5 Roztwory enzymów E1 i E2: 5
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	Roztwór transportowy: 5 roztwór wolny od jonów Ca2+: 5 Roztwór enzymu E1 i E2: 5
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Roztwór transportowy: 100 roztwór wolny od jonów Ca2+: 100 Roztwory enzymów E1 i E2: 100
Tauryna	Sigma-Aldrich	86330	Roztwór transportowy: 50 roztwór wolny od jonów Ca2+: 50 Roztwory enzymów E1 i E2: 50 Roztwór do przechowywania: 10
Kolagenaza I	Worthington	4196	Roztwory enzymów E1 i E2: 286 U/ml
Proteaza XXIV	Sigma-Aldrich	P8038	Roztwory enzymów E1 i E25 U/ml*
pH			Roztwór transportowy: 7.00 roztwór pozbawiony jonów Ca2+: 7.00 Roztwory enzymów E1 i E2: 7.00 Roztwór do przechowywania: 7.40
skorygowany za pomocą			Roztwór transportowy1 M NaOH roztwór wolny od jonów Ca2+1 M NaOH Roztwory enzymów E1 i E21 M NaOH Roztwór do przechowywania1 M KOH
Stężenia podano w mM, chyba że zaznaczono inaczej. BDM, 2,3-butanodionomonoksym. *Proteaza XXIV znajduje się wyłącznie w roztworze enzymu E1.
Tabela I. Roztwory.
Siatka nylonowa (200 μm)	VWR-Germany	510-9527
Zlewka reakcyjna z płaszczem grzewczym	VWR	KT317000-0050
Tabela II. Specjalistyczny sprzęt.
Dimetylosulfoksyd	Sigma-Aldrich	D2650
Fluo-3 AM (specjalne opakowanie)	Invitrogen	F-1242
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
Tabela III. Substancje do ładowania miocytów barwnikiem Fluo-3 AM.
4-aminopirydyna	Sigma-Aldrich	A78403	Roztwór kąpieli: 5
BaCl2	Sigma-Aldrich	342920	Roztwór kąpielowy: 0.1
CaCl2 × 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080	Roztwór do kąpieli: 2
Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270	Roztwór kąpieli: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Roztwór kąpielowy: 10
KCl	Merck	1049360250	Roztwór do kąpieli: 4
MgCl2 × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	Roztwór kąpieli: 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Roztwór kąpielowy: 140
Probenecyd	Sigma-Aldrich	P8761	Roztwór kąpielowy: 2
pH			Roztwór do kąpieli: 7.35
skorygowano za pomocą			Roztwór kąpielowy1 M HCl
Tabela IV. Roztwór kąpielowy do metody patch-clamp. *4-aminopirydyna i BaCl zostały uwzględnione wyłącznie w eksperymentach z metodą clampy napięciowej.
sól potasowa kwasu DL-asparaginowego	Sigma-Aldrich	A2025	Odpipetuj roztwór: 92
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Pipetuj roztwór: 0.02
GTP-Tris	Sigma-Aldrich	G9002	Pipetuj roztwór: 0.1
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Odmierz roztwór pipetą: 10
KCl	Merck	1049360250	Pipetuj roztwór: 48
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Pipetuj roztwór: 1
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Pipetuj roztwór: 4
Fluo-3**	Invitrogen	F3715	Pipetować roztwór: 0.1
pH			7.20
skorygowano za pomocą			1 M KOH
Tabela V. Roztwór do pipety dla techniki patch-clamp*. *W dniach przeprowadzania eksperymentów roztwór pipetujący przechowuje się w lodzie do momentu użycia. **W dniach przeprowadzania eksperymentów Fluo-3 dodaje się z roztworu stokowego o stężeniu 1 mM.