Analiza cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila przy użyciu cytometru akustycznego Attune i barwienia Vybrant DyeCycle Violet DNA

Podsumowanie

Opisano protokół analizy cyklu komórkowego żywych tkanek Drosophila za pomocą cytometru Attune Acoustic Focusing. Protokół ten jednocześnie dostarcza informacji o względnej wielkości komórki, liczbie komórek, zawartości DNA i typie komórki poprzez śledzenie linii lub specyficzną dla tkanek ekspresję białek fluorescencyjnych in vivo.

Streszczenie

Cytometria przepływowa jest powszechnie stosowana do uzyskiwania informacji o zawartości DNA w populacji komórek, do wnioskowania o względnych procentach w różnych fazach cyklu komórkowego. Technika ta została z powodzeniem rozszerzona na tkanki mitotyczne organizmu modelowego Drosophila melanogaster w badaniach genetycznych regulacji cyklu komórkowego in vivo. W połączeniu z ekspresją białek fluorescencyjnych specyficznych dla danego typu komórki i manipulacjami genetycznymi, można uzyskać szczegółowe informacje na temat wpływu na liczbę komórek, wielkość komórki i fazowanie cyklu komórkowego in vivo. Jednak ta metoda żywych komórek opierała się na użyciu przepuszczalnego dla komórek barwnika interkalacyjnego DNA Hoechst 33342, ograniczając użytkowników do cytometrów przepływowych wyposażonych w laser UV. Zmodyfikowaliśmy ten protokół, aby użyć nowszego barwnika DNA z żywych komórek, Vybrant DyeCycle Violet, kompatybilnego z bardziej powszechnym fioletowym laserem 405 nm. Przedstawiony tutaj protokół pozwala na efektywną analizę cyklu komórkowego w połączeniu z typem komórki, względną wielkością komórki i liczbą komórek w różnych tkankach Drosophila. Protokół ten rozszerza użyteczną technikę analizy cyklu komórkowego dla żywych tkanek Drosophila na mały analizator laboratoryjny, Attune Acoustic Focusing Cytometer, który może być uruchamiany i utrzymywany w skali jednolaboratoryjnej.

Wprowadzenie

Cytometria przepływowa może być używana do pomiarów żywotności komórek, względnej wielkości komórek, zawartości DNA i ekspresji białek fluorescencyjnych w żywych populacjach komórek. Ze względu na replikację jądrowego DNA podczas fazy S, informacje o zawartości DNA w populacji komórek można wykorzystać do wywnioskowania względnych wartości procentowych w różnych fazach cyklu komórkowego ^1-3. Metoda ta stała się kamieniem węgielnym analizy cyklu komórkowego w systemach modelowych od drożdży po ssaki.

Muszka owocowa Drosophila melanogaster stała się doskonałym modelem do genetycznych analiz in vivo regulacji cyklu komórkowego. Obszerne narzędzia genetyczne dostępne u muszek pozwalają na eleganckie, specyficzne tkankowo i czasowo regulowane manipulacje regulatorami cyklu komórkowego wraz ze śledzeniem linii krwi in vivo na podstawie fluorescencyjnych białek ^4-6. Cytometria przepływowa została wykorzystana do zbadania zawartości DNA w wielu typach komórek Drosophila, w tym w komórkach endoreplikujących i hodowanych komórkach mitotycznych ^7,8. De la Cruz i Edgar dokonali ważnego postępu w badaniach cyklu komórkowego in vivo, opracowując protokół analizy cytometrii przepływowej żywych diploidalnych dysków wyobrażonych Drosophila ^9,10, który to protokół był używany i adaptowany przez wiele laboratoriów. Technika ta, w połączeniu z genetycznym śledzeniem linii produkcyjnej in vivo za pomocą indukowalnej ekspresji białek fluorescencyjnych i znakowania specyficznego dla tkanki, pozwala uzyskać informacje o wpływie manipulacji genami na ogólny czas podwajania komórek, wielkość komórki oraz określić dokładny czas faz cyklu komórkowego in vivo ^9,11. Jednak do tej pory metoda ta opierała się na użyciu przepuszczalnego dla komórek barwnika interkalacyjnego DNA Hoechst 33342 do barwienia i ilościowego oznaczania DNA w żywych komórkach, co ograniczyło użytkowników do cytometrów przepływowych z laserem UV zdolnym do wzbudzenia barwnika Hoechsta. Są one zazwyczaj spotykane tylko w sorterach (np. BD FACS Vantage, BD FACSAria) lub drogich wielokolorowych systemach stołowych (np. BD LSR), zwykle wymagających wsparcia ze strony instytucjonalnych urządzeń do zarządzania przepływem.

Zmodyfikowaliśmy protokół oparty na Hoechst, aby używał nowego barwnika DNA żywych komórek od Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Barwnik ten jest kompatybilny z fioletowym laserem o długości fali 405 nm, bardziej powszechnym w mniejszych analizatorach stacjonarnych i dostępnym w małym, samodzielnym analizatorze laboratoryjnym, Attune Acoustic Focusing Cytometer. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół analizy cyklu komórkowego, który można połączyć z typem komórki, rozmiarem komórki, liczbą komórek i analizą linii w różnych tkankach Drosophila na różnych etapach rozwoju przy użyciu DyeCycle Violet i Attune. Protokół ten rozszerza liczbę cytometrów odpowiednich do takiej analizy z tkankami Drosophila i zawiera przykłady, w jaki sposób ten rodzaj analizy cyklu żywej komórki może być modyfikowany dla dodatkowych typów tkanek i etapów rozwoju.

Protokół

1. Hodowla much

1. Krzyżuj muchy o pożądanych genotypach w wąskich plastikowych fiolkach z 10 ml pożywki drożdżowo-glukozowej³ lub innej wybranej pożywki bogatej w białko. Obszerne narzędzia transgeniczne Drosophila dostępne do ekspresji specyficznej dla tkanek i śledzenia linii z ekspresją białek fluorescencyjnych in vivo opisano szczegółowo w innym miejscu^4,5. Codziennie przenosić rodziców do świeżych fiolek, aby uzyskać serię 24-godzinnych zbiorów potomstwa lub, w celu dokładniejszego stopniowania, zebrać zarodki na płytkach agarowych i przenieść nowo wyklute larwy do fiolek zgodnie z opisem¹⁰. Aby zapewnić jednolite warunki we wszystkich doświadczeniach i uniknąć przeludnienia, całkowita liczba potomstwa F1 w jednej fiolce nie powinna przekraczać 100. W zależności od projektu genetycznego eksperymentu, fiolki należy przechowywać w odpowiednim inkubatorze do pożądanego etapu rozwoju.
2. Zbieraj zwierzęta doświadczalne: będziesz potrzebować dojrzałych larw w 3. stadium larwalnym (L3) po około 110-120 godzinach rozwoju do sekcji larw lub białej poczwarki (WPP) do dokładnej oceny stadium poczwarki. Dramatyczne zmiany w cyklu komórkowym, w tym przejście do stanu nieproliferacyjnego, zachodzą w różnych punktach czasowych podczas metamorfozy^12,13. Dlatego prawidłowa ocena stopnia zaawansowania poczwarki (w ciągu 1 godziny od rozwoju) jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych danych dotyczących cyklu komórkowego podczas metamorfozy. WPP odpowiada 0 godzinom po utworzeniu poczwarki (0 godzin APF), jak pokazano na rysunku 1, panel I. Zbierz WPP na szalce Petriego o średnicy 35 mm na złożonym Kimwipe zwilżonym 2,5 ml wody, aby utrzymać pewną wilgotność. Poczwarkę należy owiekzić do pożądanego etapu (godziny APF) w odpowiedniej temperaturze. Należy pamiętać, że wywoływanie przebiega 1,2 raza szybciej w temperaturze 29 °C i 2,2 razy wolniej w temperaturze 18 °C niż w standardowej temperaturze 25 °C¹⁴.
3. Zwierzęta poddane szokowi cieplnemu w celu aktywacji rekombinacji indukowanej przez flipazę szoku cieplnego (hs-flp) dla klonów śledzących linię, jeśli zajdzie taka potrzeba^9,11. W celu wywołania szoku cieplnego u larw należy zanurzyć fiolki w łaźni wodnej (nastawionej na 37 °C) i upewnić się, że larwy są całkowicie zanurzone. W celu doprowadzenia do szoku cieplnego poczwarki, należy uszczelnić szalkę Petriego Parafilmem i całkowicie zanurzyć ją w łaźni wodnej. Pamiętaj, aby usunąć Parafilm po szoku cieplnym, aby umożliwić wystarczającą wymianę tlenu do przeżycia zwierzęcia. Czas trwania szoku cieplnego zależy od aktywności użytego transgenu flipazy i liczby pożądanych klonów. Rutynowo używamy 7-8 minut na indukcję "flipout" linii śledzenia klonów¹⁵ u larw z transgenem hs-flp na pierwszym chromosomie i 2-4 minuty na szok cieplny poczwarek w szalkach 35 mm, podczas gdy transgen hs-flp na drugim chromosomie wymaga 20 minuty szoku cieplnego, aby uzyskać podobną liczbę klonów.

Szybkość podziału komórki i czas sekcji determinują rozmiar klonu w każdej tkance. W normalnych warunkach stwierdzamy, że klony indukowane w skrzydle larwalnym z 20-minutowym szokiem cieplnym (przy użyciu transgenu hs-flp na drugim chromosomie) i preparowane 48 godzin później, zawierają około 20-30 dobrze oddzielonych klonów o rozmiarach od 10 komórek na klon do dwóch komórek na klon, ze średnią około czterech komórek na klon. W przeciwieństwie do tego, 7-minutowy szok cieplny z tym samym transgenem hs-flp poczwarek na szalce Petriego w 0 godz. APF wypreparowanym 36 godzin później, daje dobrze oddzielone klony (około 15-25) w zakresie od jednej do czterech komórek ze średnią 2,2 komórki na klon. Takie dane można wykorzystać do określenia średniego czasu podwajania komórek dla badanej tkanki.

2. Sekcja

1. Delikatnie przenieś larwy/poczwarki do przezroczystego szklanego naczynia rozwarstwiającego zawierającego 1X PBS.
2. Używając mikroskopu preparacyjnego i dużej ilości światła, delikatnie chwyć larwę za brzuch ostrym kleszczem Inox #5, przetnij przednią trzecią część mikronożyczkami i odwróć przednią trzecią, popychając obszar ust do wewnątrz w kierunku tylnej, trzymając stabilnie naskórek larwy (ryc. 1A). Ostrożnie usuń nieprzezroczyste ciało tłuszczowe i wszelkie pozostałe jelita, aby zwiększyć widoczność pożądanych tkanek, takich jak skrzydło, oko lub mózg. Wypreparuj pożądane tkanki; czyste usuwanie skrzydeł z tchawicy i naskórka za pomocą kleszczy, oczu z haczyków na usta lub mózgu z oczu (ryc. 1G).
3. Do preparowania poczwarki należy użyć kleszczyka, aby delikatnie chwycić poczwarkę za przedni koniec obudowy poczwarki, w której znajduje się pęcherzyk powietrza, aby uniknąć uszkodzenia poczwarki wewnątrz (ryc. 1C). Kleszcze lub mikronożyczki w przeciwnej ręce mogą być użyte, aby pomóc ustawić pływającą poczwarkę w celu prawidłowego uchwycenia. Czysto przetnij tylny koniec poczwarki mikronożyczkami. To cięcie w przekroju poprzecznym powinno być wykonane pod niewielkim kątem w kierunku grzbietowej części zwierzęcia, aby uwolnić ciśnienie wewnętrzne bez wtłaczania tkanki tłuszczowej do pożądanych tkanek klatki piersiowej i głowy. Ciąć ostrożnie wzdłuż środkowej części grzbietu, unikając skrzydeł i przedniego kompleksu oko-mózg. Ostrożnie wyjmij poczwarkę z obudowy poczwarki, chwytając tylną krawędź naskórka poczwarki i wyciągając ją z obudowy poczwarki (ryc. 1D). Zrób mały otwór w naskórku przed kompleksem oko-mózg za pomocą kleszczy. Używając szklanej pipety Pasteura z gumową gruszką, delikatnie przemyj roztwór preparacyjny PBS przez częściowo wypreparowaną poczwarkę, aby usunąć histolizowany tłuszcz i pozostałą tkankę jelitową. To również skutecznie smaruje szklaną pipetę lipidami i białkami, co zmniejsza częstość przywierania wypreparowanych tkanek do wnętrza szklanej pipety w późniejszym czasie.
4. Aby uzyskać skrzydła poczwarki, naskórek otaczający skrzydło i samo skrzydło muszą zostać oderwane od poczwarki (ryc. 1E). Można to zrobić, przytrzymując poczwarkę za głowę jednym kleszczem, podczas gdy używając innego kleszcza do uchwycenia najbardziej tylnego końca naskórka skrzydła i wyciągając lub manewrując kleszczem pod skrzydłem w pobliżu zawiasu przed usunięciem go z boku tuszy (ryc. 1E). Skrzydło można następnie przeciąć lub rozerwać na zawiasie, aby usunąć je z korpusu i ułożyć w stos z dala od tusz i innego materiału.
5. Aby uzyskać poczwarkę oczu lub mózgu, umyj poczwarkę, aż kompleks oko-mózg zostanie usunięty i wolny od poczwarki (ryc. 1F, 1H). Za pomocą kleszczy delikatnie odciągnij oko poczwarki od mózgu i zachowaj pożądaną tkankę.
6. Nie należy poświęcać więcej niż 45 minut na analizę każdej próbki, ponieważ wyniki stają się mniej dokładne, im dłużej komórki pozostają w PBS po otwarciu zwierząt.

3. Dysocjacja tkanek i barwienie DNA

1. Za pomocą nasmarowanej pipety Pasteura ostrożnie przenieś wypreparowane tkanki do 0,5 ml roztworu barwienia żywego DNA w probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml (ryc. 1G). Przenieś jak najmniej PBS (mniej niż 300 μl) do roztworu barwienia DNA, ponieważ rozcieńczenie trypsyny zahamuje dysocjację tkanek.
2. Inkubować probówki z wytrząsaniem w temperaturze 23 °C przy 500 obr./min (używamy termomiksera Eppendorf).
3. Inkubować przez 70 minut, a następnie delikatnie wirować przez 5 sekund ze średnią prędkością (ustawienie 5). Nadmierne wirowanie spowoduje rozerwanie komórek i powstanie gruzu, podczas gdy niedostateczne wirowanie doprowadzi do grudek komórek. Przywrócić próbki do wytrząsania w temperaturze 23 °C przy 500 obr./min przez dodatkowe 15–20 minut, a następnie ponownie wirować je przez 5 sekund z prędkością 5.
4. W przypadku mózgów i oczu poczwarek starszych niż 36hAPF wymagany jest zmodyfikowany protokół. Dysocjuj tkanki w roztworze barwienia DNA w temperaturze 23 °C przy 500 obr./min przez 45-60 minut w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Następnie, jeden po drugim, ręcznie dysocjuj duże kawałki tkanki, przenosząc je do naczynia preparacyjnego wraz z około 50 μl roztworu barwienia DNA i szybko pipetując w górę iw dół za pomocą ręcznie rysowanej pipety ^{Pasteura 16} (o otworze około 100-150 μm). Przenieść każdą zdysocjowaną próbkę z resztą 0,5 ml roztworu barwienia DNA do probówki o pojemności 5 ml. Inkubować przez dodatkowe 45–30 minut (do 90 minut całkowitego czasu inkubacji) w temperaturze 23 °C z wytrząsaniem z prędkością 500 obr./min, aż grudki przestaną być widoczne.
5. W pełni zdysocjowane próbki powinny mieć bardzo mało widocznych dużych kawałków tkanki, chociaż należy pamiętać, że bezkomórkowy przezroczysty naskórek skrzydła poczwarki nie ulegnie dysocjacji.

4. Cytometria przepływowa

1. Włącz cytometr Attune i otwórz oprogramowanie Attune. Lasery cytometryczne powinny być włączane za pomocą menu startowego, a przed każdym dniem pozyskiwania danych należy wykonywać codzienny test wydajności za pomocą koralików śledzących wydajność z odpowiednimi wynikami. Poziom płynów powinien być wypełniony co najmniej do połowy, a odpady opróżnione przed testem wydajności. Szczegóły dotyczące uruchamiania, prawidłowej kalibracji i obsługi Attune można znaleźć w Podręczniku użytkownika Attune ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf)
2. Zaprojektuj nowy szablon, tworząc 4 wykresy punktowe i 2 histogramy w pustym obszarze roboczym z parametrami wskazanymi w punkcie 4.3 lub wybierz wcześniej zaprojektowany szablon odpowiedni dla eksperymentu i wskaż liczbę próbek do pobrania. Dostarczyliśmy szablony Attune (pliki w formacie .get) do analizy cyklu komórkowego Drosophila na żywo z ekspresją Vybrant DyeCycle Violet i GFP lub RFP w Załączniku I.
3. Dostarczone szablony zawierają cztery wykresy punktowe i dwa histogramy z parametrami wskazanymi na rysunku 2. Kanały detekcji obejmują: FSC i SSC - rozproszenie do przodu i rozproszenie boczne wskazujące rozmiar komórki i złożoność błony, wysokość (H), szerokość (W) i obszar (A) VL1 - wskazujące na wzbudzenie laserem fioletowym DyeCycle Violet barwiące DNA oraz BL1-A - Obszar kanału 1 niebieskiego lasera, wskazujący fluorescencję GFP. Dostarczony szablon do analizy zapytania ofertowego jest identyczny z szablonem do analizy GFP, z tą różnicą, że korzysta z kanału niebieskiego lasera 3 (BL3-A), który jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania zapytań ofertowych.
4. Wykresy punktowe w szablonach mają bramki, które ograniczają analizę do pożądanych populacji oraz ograniczają szczątki i grudki komórek z analizy (rysunek 2). Bramka 1 nie obejmuje gruzu i grudek w oparciu o SSC vs. FSC (rysunek 2A). Bramka 2 wyklucza niebarwione komórki, komórki apoptotyczne sub G1 i grudki komórek na podstawie identyfikacji singli (VL1Area vs. VL1Width) (Figura 2B). Bramka 3 jest bramką pochodną, obejmującą komórki w bramkach 1 i 2 i identyfikuje komórki ujemne GFP (lub RFP) w stosunku do zawartości DNA na podstawie VL1Height (figura 2C). Bramka 4 jest bramką pochodną, obejmującą komórki w obrębie bramek 1 i 2 i identyfikuje komórki dodatnie GFP (lub RFP) w stosunku do zawartości DNA (ryc. 2C). Wykresy punktowe wielkości komórki mierzonej za pomocą GFP (lub RFP) w porównaniu z rozproszeniem do przodu (FSC) są używane do generowania bramek 5 i 6 (rysunek 2D). Dwa histogramy przedstawiają zawartość DNA na osi X i liczbę komórek na osi Y dla populacji zdefiniowanych przez bramkę 3 i bramkę 4. (Rysunek 2E i 2F) W razie potrzeby można również dołączyć histogramy dotyczące rozmiaru komórki (nie pokazano). W przypadku histogramów wielkości komórek populacje powinny być ustawione na bramki 5 i 6, wykreślając FSC na osi X i zliczania na osi y.
5. Ustaw nagrywanie tak, aby zatrzymało się na 10 000 pozytywnych zdarzeń GFP lub RFP (będzie to bramka 4, pochodna bramka bramki 1, bramka 2 i dodatnia bramka GFP lub RFP). Zakresy od 6 000 do 10 000 pozytywnych zdarzeń GFP były tradycyjnie celem dla profili jakości publikacji^9,11. Sugerujemy użycie co najmniej 15 skrzydeł lub oczu, które są w około 50% dodatnie pod względem GFP, aby uzyskać wystarczającą liczbę zdarzeń Gate^{4 10} dla profili wysokiej jakości. Jednak udało nam się uzyskać jasne dane do wstępnej analizy cyklu komórkowego z zaledwie 6 skrzydeł (Figura 3A). Ustaw objętość akwizycji na 300 μl, pozwoli to na użycie około 460 μl z całkowitej próbki 0,5 ml. Tabela 2 przedstawia odpowiednie ustawienia progu i napięcia podane w szablonie dla przykładu na rysunku 2.
6. Badaj próbki z czułością standardową lub wysoką czułością 100 μl/min i nagrywaj. W naszej analizie znajdujemy niewielką lub żadną różnicę w różnych poziomach czułości. Ze względu na akustyczne ogniskowanie komórek, cytometr ten może dokładnie mierzyć próbki przy bardzo dużych natężeniach przepływu. W przeciwieństwie do tradycyjnych cytometrów, nie znajdujemy żadnych zagrożeń dla danych, pozyskując z prędkością do 1500 zdarzeń na sekundę. Nagrane pliki danych generowane przez oprogramowanie Attune są w formacie .fcs, który jest kompatybilny z większością programów do modelowania cyklu komórkowego.

5. Analiza danych

1. Można porównać histogramy wielkości komórki i zawartości DNA dla populacji GFP (lub RFP) dodatnich i ujemnych. Można je ręcznie nakładać warstwami, kopiując i wklejając za pomocą oprogramowania Adobe Photoshop. Jeśli oś y jest ustawiona na automatyczną, oś y będzie skalowana z najwyższą liczbą dla każdej próbki. Nałożenie dwóch wykresów z osią Y ustawioną na automatyczne skalowanie powoduje utworzenie nakładki histogramów z osiami ustawionymi na globalne maksimum dla każdej populacji. Pozwala to na łatwe wizualne porównanie względnych zmian w fazach cyklu komórkowego, nawet jeśli całkowita liczba komórek w populacjach GFP dodatnich i GFP ujemnych nie jest równoważna (przykład na rysunku 3B). Alternatywnie można ustawić niestandardową oś y (opcja ręczna osi y) na stałą wartość histogramów. W takim przypadku można porównać względną liczbę komórek dla dwóch populacji. Ponieważ Attune wykorzystuje zdefiniowaną objętość próbki na przebieg, bezwzględną kwantyfikację komórek dla każdego przebiegu, w każdej bramce z procentami całkowitej populacji, można uzyskać z tabeli statystycznej generowanej automatycznie podczas przebiegu w obszarze roboczym (przykład na rysunku 3F). Wykresy punktowe i histogramy można również łatwo nakładać na siebie w oprogramowaniu Attune, po prostu przeciągając i upuszczając różne próbki z menu pliku próbki po prawej stronie na żądany wykres otwartej próbki w celu porównania. Jednak w celu nałożenia na siebie subpopulacji z jednej próbki (tj. dodatniej i ujemnej GFP w tej samej próbie) używamy programu Photoshop.
2. Do znalezienia względnych wartości procentowych w różnych fazach cyklu komórkowego dla populacji można zastosować dwie metody. Metoda aproksymacji opiera się na regionach zdefiniowanych przez użytkownika w celu wyznaczenia granic pików G1, S, G2 i >G2. Metoda ta umożliwia szybkie i łatwe oszacowanie wartości procentowych w regionach zdefiniowanych przez użytkownika (rysunek 3E). Ustaliliśmy nasze regiony na podstawie bezpośredniego testu z komórkami Drosophila Kc, oznaczonymi do fazy S przy użyciu inkorporacji etynylo-deoksyurydyny (EdU). Druga metoda wykorzystuje oprogramowanie do modelowania innych firm do szacowania rozkładu cyklu komórkowego. Użyliśmy oprogramowania ModFitLT (Verity Software House) na przykład na rysunku 3F.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki dla próbki skrzydła larwy, wykazującej ekspresję GFP w tylnej połowie tkanki, z wykorzystaniem dostarczonego szablonu GFP. Podobne wyniki uzyskano dla tego samego rodzaju tkanki i wzorca ekspresji w przypadku RFP, stosując dostarczony szablon RFP (Rysunek 3A). Dostarczone szablony i napięcia (Tabela 2) są odpowiednie do analizy oczu larwalnych (Rysunek 3B), mózgów i skrzydeł, a także oczu poczwarki, mózgów (Rysunek 3D<...

Dyskusja

Opisany tutaj protokół pozwala na analizę cyklu komórkowego, względnej wielkości komórki i względnej liczby komórek w żywych tkankach Drosophila na różnych etapach rozwoju. Gdy ta analiza jest połączona z ekspresją białek fluorescencyjnych specyficznych dla typu komórki lub śledzeniem linii, można uzyskać szczegółowe informacje na temat odpowiedzi komórkowych na dyskretne zaburzenia cyklu komórkowego lub wzrostu. Jako dowód zasady, zakłóciliśmy spoczynek w mózgu muchy poczwarkowej poprzez ekspresję regulatorów c...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12x75 mm Polistyrenowa probówka okrągłodenna 5 ml BD	Falcon	352058	probówki 5 ml
Attune Akustyczny cytometr skupiający	Life Technologies/ Applied Biosystems	4445315	konfiguracji niebieskiej / fioletowej
Oprogramowanie cytometru Attune (wersja 1.2.5)	Life Technologies/ Applied Biosystems	Free	PC
Koraliki do śledzenia wydajności Attune (5 x 106 koralików/ml)	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	Do codziennego testu wydajności
Kleszcze Dumont #5 Inox	Narzędzia do nauki o naczyniach	11251-20
Szalki z zarodkami 30 mm x 12mm	Mikroskopia elektronowa Nauki	70543-30	Szklane naczynia preparacyjne
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670051
Roztwór trypsyny-EDTA (10x)	Sigma	T4174
Vannas-Tü Nożyczki sprężynowe bingen	Fine Science Tools	15003-08	Prosta krawędź tnąca 5 mm
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Life Technologies/ Invitrogen	V35003
Tabela 1. Wymagane odczynniki i instrumenty.
Roztwór barwienia żywego DNA (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ wolny PBS (pH 7,2) 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 μ l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (należy pamiętać, że jest to 0,25 raza większe stężenie niż zalecane dla komórek ssaków. Okazuje się, że wyższe stężenia są toksyczne dla komórek Drosophila). 10X Ca2+ Mg2+ wolny PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dwuzasadowy), 20mM KH2PO4 (monobasic) dostosowane do pH 7.2
FSC SSC BL1 VL1 Próg (x1000) 100 10 10 10 Napięcie (mV) 2950 4250 1800 1150 Tabela 2. Ustawienie progu i napięcia dla analizy na rysunku 2.