Oddzielenie embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy

Podsumowanie

Opisano protokół separacji ektodermy twarzy i mezenchymy zarodka. Używamy Dispase II do leczenia najpierw całych zarodków, następnie wycinamy całe wypukłości twarzy, a następnie oddzielamy ektodermę twarzy i mezenchymę.

Streszczenie

Szczeliny ustno-twarzowe są najczęstszymi wadami twarzoczaszki, które dotykają 1,5 na 1000 noworodków na całym świecie^1,2. Rozszczep jamy ustnej twarzy jest spowodowany nieprawidłowym rozwojem twarzy³. U ludzi i myszy początkowy wzrost i wzór twarzy opiera się na kilku małych zawiązkach tkanki, wypukłości twarzy^4,5. Twarz wywodzi się z sześciu głównych protuberancji: parzystych wyrostków czołowych nosowych (FNP), protuberancji szczękowych (MxP) i protuberancji żuchwy (MdP). Te protuberancje składają się z obrzęków mezenchymy, które są otoczone leżącym nad nimi nabłonkiem. Badania na wielu gatunkach wykazały, że przesłuch sygnalizacyjny między ektodermą twarzy a mezenchymą ma kluczowe znaczenie dla kształtowania twarzy⁶. Brakuje jednak mechanistycznych szczegółów dotyczących genów zaangażowanych w te przekaźniki sygnalizacyjne. Jednym ze sposobów na uzyskanie kompleksowego zrozumienia ekspresji genów, wiązania czynników transkrypcyjnych i znaczników chromatyny związanych z rozwijającą się ektodermą twarzy i mezenchymą jest wyizolowanie i scharakteryzowanie oddzielonych przedziałów tkankowych.

Tutaj prezentujemy metodę oddzielania ektodermy twarzy od mezenchymy w dniu embrionalnym (E) 10.5, krytycznym etapie rozwoju w tworzeniu się twarzy myszy, który poprzedza fuzję protuberancji. Nasza metoda jest zaadaptowana z podejścia, które wcześniej stosowaliśmy do preparowania wypukłości twarzy⁷. W tym wcześniejszym badaniu wykorzystaliśmy myszy wsobne C57BL/6, ponieważ szczep ten stał się standardem w genetyce, genomice i morfologii twarzy⁸. W tym przypadku jednak, ze względu na bardziej ograniczoną ilość dostępnych tkanek, wykorzystaliśmy niekrewny szczep CD-1, który jest tańszy w zakupie, bardziej wytrzymały w hodowli i ma tendencję do produkcji większej liczby zarodków (12-18) na miot niż jakikolwiek wsobny szczep myszy⁸. Po wyizolowaniu zarodka do leczenia całego zarodka zastosowano neutralną proteazę Dispase II. Następnie wypreparowano wypukłości twarzy i oddzielono ektodermę twarzy od mezenchymy. Ta metoda utrzymuje zarówno ektodermę twarzy, jak i mezenchymę w stanie nienaruszonym. Próbki uzyskane przy użyciu tej metodologii mogą być wykorzystane do technik takich jak wykrywanie białek, test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), badania mikromacierzy i sekwencjonowanie RNA.

Protokół

1. Przygotuj Dispase II

1. Przygotuj świeżą sól fizjologiczną buforowaną przez Hepes (HBS) (50 mM Hepes/KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Dodać 2 ml 0,5 M Hepes/KOH pH 7,4 i 1,2 ml 2,5 M NaCl do 16,8 ml Ultrapure_H2O.
2. Zrobić 10 mg/ml Dypaza II. Odważyć 0,2 g Dispase II (Roche, Cat# 4942078001) i rozpuścić w 20 ml HBS. Przygotować 1,0 ml porcji w oddzielnych probówkach Eppendorfa i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.
3. Rozcieńczyć 10 mg/ml Dispase II w stosunku 1:10 w PBS przed użyciem. Rozcieńczoną Pipezę II umieścić na lodzie.

2. Sekcja zarodków CD-1 E10.5 od ciężarnej kobie....

Wyniki

Po traktowaniu Dispase II ektoderm zarodka wykazuje tendencję do rozluźniania. Wyrostki twarzy powinny pozostać nienaruszone po sekcji (Rysunek 2A). Izolowana ektoderm twarzy jest przejrzysta i wolna od tkanki mezenchymy (Rysunek 2B). Aby określić skuteczność protokołu i wykryć zanieczyszczenia krzyżowe, przeprowadzono analizę ekspresji Zic3⁹ (wyrażanego w przedmózgowiu), specyficznego dla ektodermy cdh1⁵ oraz specyficznego dla mezenchymy sox10¹⁰ przy uży.......

Dyskusja

Protokół ten zapewnia prostą metodę oddzielania embrionalnej ektodermy twarzy myszy i mezenchymy w oparciu o początkowy etap leczenia Dispase II. W poprzednich badaniach przeprowadziliśmy sekcję wypukłości twarzy przed zabiegiem Dispase II, ale konsekwentnie stwierdzaliśmy, że mezenchyma staje się "lepka" i trudniejsza do manipulowania. Nasz nowy protokół pozwala uniknąć tego problemu. Skojarzone leczenie Dispase II z delikatną siłą fizyczną poprzez pipetowanie w górę i w dół ułatwia oddzielenie ektodermy i mezenchymy. C.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dyspaza II (proteaza obojętna, stopień II)	Roche	4942078001	Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego Dyspazy II w HBS. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & C .
RNAlater	Ambion	AM7021