Opisano protokół przewlekłych infuzji glukozy i intralipidów u szczurów. Model ten można wykorzystać do badania wpływu nadmiaru składników odżywczych na funkcjonowanie narządów i parametry fizjologiczne.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model przewlekłego wlewu składników odżywczych u szczura
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Postuluje się, że przewlekłe narażenie na nadmierne ilości składników odżywczych wpływa na funkcjonowanie kilku narządów i tkanek oraz przyczynia się do rozwoju wielu powikłań związanych z otyłością i zespołem metabolicznym, w tym cukrzycą typu 2. Aby zbadać mechanizmy, za pomocą których nadmierny poziom glukozy i kwasów tłuszczowych wpływa na komórkę beta trzustki i wydzielanie insuliny, ustaliliśmy model przewlekłej infuzji składników odżywczych u szczurów. Zabieg polega na cewnikowaniu prawej żyły szyjnej i lewej tętnicy szyjnej w znieczuleniu ogólnym; umożliwienie 7-dniowego okresu rekonwalescencji; podłączenie cewników do pomp za pomocą systemu obrotowego i przeciwwagi, który umożliwia zwierzęciu swobodne poruszanie się w klatce; oraz podawanie glukozy i/lub intralipidu (emulsji oleju sojowego, która po podaniu heparyny tworzy mieszaninę około 80% nienasyconych/20% nasyconych kwasów tłuszczowych) przez 72 godziny. Model ten ma kilka zalet, w tym możliwość precyzyjnego modulowania docelowych poziomów krążącej glukozy i kwasów tłuszczowych; możliwość jednoczesnego podawania związków farmakologicznych; oraz stosunkowo krótkie ramy czasowe w przeciwieństwie do modeli dietetycznych. Może być wykorzystany do zbadania mechanizmów dysfunkcji wywołanej przez składniki odżywcze w różnych narządach oraz do zbadania skuteczności leków w tym kontekście.
Wprowadzenie
Zaproponowano, że chronicznie podwyższony poziom glukozy i lipidów w krążeniu przyczynia się do patogenezy cukrzycy typu 2 poprzez zmianę funkcji kilku narządów zaangażowanych w utrzymanie homeostazy glukozy, w tym, ale nie tylko, komórki beta trzustki (omówione w 1). Hipoteza glukotoksyczności zakłada, że przewlekła hiperglikemia pogłębia defekt komórek beta, który w pierwszej kolejności doprowadził do hiperglikemii, tworząc w ten sposób błędne koło i przyczyniając się do pogorszenia kontroli glikemii u pacjentów z cukrzycą typu 2. Podobnie hipoteza glukoliotoksyczności sugeruje, że jednoczesne podwyższenie poziomu glukozy i lipidów, często obserwowane w cukrzycy typu 2, jest szkodliwe dla komórki beta.
Rozszyfrowanie komórkowych i molekularnych mechanizmów szkodliwego wpływu przewlekle podwyższonego poziomu składników odżywczych na funkcjonowanie komórek beta trzustki jest kluczem do zrozumienia patogenezy cukrzycy typu 2 1. W tym celu w wielu badaniach analizowano mechanizmy przewlekłego nadmiaru składników odżywczych ex vivo w izolowanych wyspach Langerhansa lub in vitro w klonalnych liniach komórkowych wydzielających insulinę. Jednak przełożenie wyników uzyskanych w tych systemach modelowych na cały organizm jest złożone, w szczególności dlatego, że stężenia kwasów tłuszczowych stosowanych w hodowanych komórkach lub wyspach trzustkowych rzadko odpowiadają poziomom krążącym w pobliżu komórek beta in vivo2. Z drugiej strony, mechanizmy niewydolności komórek beta w odpowiedzi na nadmiar składników odżywczych zostały zbadane w modelach cukrzycy u gryzoni, czego przykładem jest szczur Zucker Diabetic Fatty 3,4, myszoskoczek Psammomys obesus 5 i mysz wysokotłuszczowa karmiona dietą 6. Modele te charakteryzują się jednak wewnętrznymi nieprawidłowościami metabolicznymi i nie są łatwo podatne na manipulacje poziomem glukozy i/lub lipidów we krwi w bardziej kontrolowanym i mniej przewlekłym otoczeniu. Aby móc zmienić poziom krążących składników odżywczych w ciągu kilku dni u normalnych zwierząt, opracowaliśmy model przewlekłej infuzji u normalnych szczurów, który umożliwia nam zbadanie wpływu lipidów i glukozy, pojedynczo lub w połączeniu, na parametry fizjologiczne i funkcję 7,8.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Przegląd: Procedura polega na cewnikowaniu prawej żyły szyjnej i lewej tętnicy szyjnej w znieczuleniu ogólnym; umożliwieniu 7-dniowego okresu rekonwalescencji; połączeniu cewników z pompami za pomocą systemu obrotowego i przeciwwagi, który umożliwia zwierzęciu swobodne poruszanie się w klatce; oraz podawaniu glukozy i/lub Intralipidu (emulsji oleju sojowego, która po podaniu do środka tworzy mieszaninę około 80% nienasyconych / 20% nasyconych kwasów tłuszczowych; heparyna 9) przez 72 godziny.
1. Kanaracja prawej żyły szyjnej i lewej tętnicy szyjnej
- Sterylizuj narzędzia chirurgiczne. Rurki kanonacyjne muszą być również wysterylizowane na zimno przy użyciu płynnego środka sterylizującego (2,6% aldehydu glutarowego) przed zabiegiem. Zanurz rurkę w autoklawizowanym pojemniku na 16-24 godziny. Przed użyciem spłucz i dokładnie spłucz sterylną wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie ślady aldehydu glutarowego.
- Zważ szczura, aby obliczyć dawki leku:
Karprofen 5 mg/kg: rozcieńczenie 1/10 = masa ciała (g) x 0,001 ml SC (przeciwbólowy)
Glikopironuran 0,01 mg/kg : rozcieńczenie 1/10 = m.c. (g) X 0,0012 ml SC (antycholinergiczne) - Znieczulij szczura za pomocą izofluranu i tlenu.
- Połóż szczura na brzuchu. Ogol obszar za uszami do podstawy ramion. Połóż szczura na plecach. Ogol obszar pod szyją do przednich łap.
- Przygotuj miejsce operacji chlorheksydyną, alkoholem i jodem. Podawać leki.
- Przenieś szczura na pole operacyjne.
- Stosując technikę aseptyczną, kanalizuj prawą żyłę szyjną i lewą tętnicę szyjną za pomocą kaniuli PE-50 podłączonej do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej 5 j. heparynizowanego soli fizjologicznej. Przepłucz kaniule 50 j. heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej, aby uniknąć zakrzepów w okresie rekonwalescencji. Użyj igieł 23G. Zamknij każdą kaniulę za pomocą szpilki 23G.
- Po operacji należy przyciąć dolne siekacze o około 2,5 mm i umieścić szczura w płaszczu infuzyjnym, aby zapobiec zjedzeniu kaniuli.
- Dostarczyć tlen (1 l/min przez 10 min), aby pomóc w ewakuacji izofluranu.
- Umieść szczura w ogrzewanej klatce, aż całkowicie się obudzi.
- Operować czterema szczurami, aby użyć jednego na każdy warunek infuzji (Tabela 1).
2. Opieka pooperacyjna (leczenie pooperacyjne i podłączenie cewników)
- Zważ szczury w 1. i 2. dniu po operacji.
- Podawać glikopirolan (BW(g) x 0,00048 ml) SC dwa razy w 1. dniu po operacji i raz w 2. dniu po operacji.
- W razie potrzeby można zastosować dodatkowe leczenie wspomagające: płyny, poduszkę rozgrzewającą, mokrą dietę, tlenoterapię, leki przeciwbólowe, antycholinergiczne.
- W 7 dniu po operacji zważ szczury, aby obliczyć szybkość przepływu do infuzji.
- Podłącz każdego szczura do systemu infuzyjnego za pomocą linki i krętlika zamontowanych na górze kratki klatki (Rysunek 1).
- Przepłucz kaniule 5 j. heparynizowanej soli fizjologicznej, aby usunąć skrzepy. Ponownie przepłucz kaniule 50 j. heparynizowanej soli fizjologicznej, aby zapobiec krzepnięciu.
- Pozwól szczurom zaaklimatyzować się do uwięzi i obracaj się przez co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem infuzji.
3. Napar
- Pobrać 0,15 ml krwi z tętnicy szyjnej każdego szczura i zmierzyć glikemię. Spłucz kanule szyjne. Użyj 50 j. heparynizowanej soli fizjologicznej, aby zapobiec krzepnięciu w obu kaniulach każdego szczura.
- Przenieść próbkę krwi do probówki o pojemności 0,5 ml zawierającej 2% EDTA. Wirować z prędkością 10 000 obr./min przez 2 minuty i zamrażać osocze w temperaturze -20 °C.
- Napełnić dwie strzykawki o pojemności 60 ml dla każdego z warunków infuzji wymienionych poniżej. Umieść strzykawkę 1 w przedniej pozycji pompy, a strzykawkę 2 w tylnej pozycji pompy.
- Połącz każdą parę roztworów za pomocą łączników Y i wysterylizowanych węży CO-EX T22. Umieścić strzykawki na podwójnej pompie strzykawkowej Harvard 33.
- Zmień dno klatki i wyjmij całą żywność z górnej części grilla klatki.
- Zważ 150 g standardowej karmy i umieść na blacie grilla w klatce.
- Podłączyć strzykawki do krętlika na kratce klatki. Prawidłowo przepłukać strzykawki, aby usunąć uwięzione powietrze z przewodów.
- Obliczyć szybkość przepływu infuzji na podstawie masy ciała, która została pobrana przed podłączeniem szczura do systemu infuzyjnego. Dawki są obliczane za pomocą pliku programu Microsoft Excel, który przelicza szybkość infuzji glukozy () na ml/h.
- Ustawić pompę tak, aby podawała natężenie przepływu dla strzykawek o pojemności 60 ml zgodnie z ustawieniami producenta. Wprowadź stawkę dla strzykawki 1 (strzykawka przednia) i stawkę dla strzykawki 2 (strzykawka tylna).
- Uruchom pompę.
4. Monitorowanie
- Po uruchomieniu pompy należy sprawdzić, czy nie ma wycieku z krętlika lub kaniuli oraz czy przewód infuzyjny nie jest skręcony. Sprawdź również, czy w rurce nie ma pęcherzyków powietrza.
- Po 3 godzinach infuzji należy pobrać próbkę krwi w celu monitorowania glikemii. Powtórzyć po 6, 24, 48 i 72 godzinach infuzji. Jako środek ostrożności glikemia jest również monitorowana po 30, 34, 54 i 60 godzinach od naparu. Poziom glukozy we krwi można zmierzyć za pomocą jednej kropli krwi pełnej za pomocą przenośnego glukometru. Ogranicza to ilość krwi pobieranej podczas infuzji, a tym samym pozwala uniknąć znaczącej zmiany objętości krwi i/lub hematokrytu.
- Dawka dla strzykawki 1 jest modyfikowana w oparciu o wartości glikemii, aby utrzymać poziom glukozy we krwi na poziomie 220-250 mg/dl. Szybkość podawania strzykawki 2 nie zmienia się w ciągu 72 godzin infuzji, ponieważ wolne kwasy tłuszczowe są utrzymywane na poziomie 1 mmol/l.
- Warunki infuzji są dobierane w taki sposób, aby objętość otrzymana dla zwierząt kontrolnych była równoważna objętości otrzymanej dla zwierząt doświadczalnych (tabela 1).
- Po 24 godzinach od zaparzenia zmień dno klatki i zważ żywność pozostałą w kratce klatkowej. Włóż niezjedzoną porcję do kratki w klatce. Powtórz po 48 godzinach.
- Strzykawki należy napełniać codziennie, w razie potrzeby przez 72 godziny infuzji.
- Podczas infuzji należy zawsze obserwować szczura pod kątem jakichkolwiek oznak stanu zapalnego lub dyskomfortu. W razie potrzeby należy zastosować odpowiednią opiekę.
5. Eutanazja poinfuzyjna
- Po 72 godzinach infuzji, szczury są znieczulane dożylnie 0,5 ml koktajlu ketamina/ksylazyna (182 mg/kg ketaminy i 11,6 mg/kg ksylazyny rozcieńczonej 1:2 0,9% NaCl).
- Odruch szczypania palców u nóg służy do weryfikacji poziomu znieczulenia. W razie potrzeby podaje się dodatkowy środek znieczulający.
- Gdy szczur jest znieczulony, jama brzuszna jest otwierana za pomocą nożyczek chirurgicznych. Szczur wykrwawia się, pobierając 10-15 ml krwi do strzykawki z aorty lub żyły głównej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Z serii 42 szczurów, które przeszły operację, 5 zwierząt padło w okresie pooperacyjnym, a 1 szczur padł podczas infuzji, co daje ogólną przeżywalność na poziomie 86%. Średnia masa ciała 37 szczurów, którym ostatecznie wykonano infuzję, wynosiła 608±5 g przed operacją i 588±6 g w momencie rozpoczęcia infuzji (średnia±SE; n=37; P<0.0001 w teście t dla prób zależnych). Poniższe reprezentatywne wyniki uzyskano w dwóch grupach infuzyjnych: soli fizjologicznej (SAL) oraz glukozy + Intralipid (GLU+IL). Rysunki 2A
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Chociaż w wielu wcześniejszych badaniach stosowano przewlekłe wlewy glukozy (np. 10-15) lub lipidów (np. 16,17) u gryzoni, według naszej wiedzy łączny napar obu paliw odnotowano tylko u myszy 18. Przedstawiony tutaj model przewlekłej infuzji oferuje kilka korzyści w badaniu wpływu nadmiaru składników odżywczych na różne funkcje biologiczne u szczurów. Po pierwsze, nie obejmuje gryzoni genetycznie otyłych, a ponieważ powszechna otyłość u ludzi jest poligeniczna...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Vincent Poitout jest współzałożycielem i otrzymał kontrakty badawcze od Bêtagenex Inc., organizacji zajmującej się badaniami na zlecenie, która oferuje model infuzji przedstawiony w tym artykule jako usługę komercyjną.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (R01DK58096 Vincentowi Poitoutowi). Vincent Poitout jest kierownikiem Kanadyjskiej Katedry Badawczej w dziedzinie cukrzycy i funkcji komórek beta trzustki. Bader Zarrouki otrzymał stypendia podoktorskie od firm Merck i Eli Lilly. Ghislaine Fontés otrzymała stypendium podoktoranckie od Kanadyjskiego Towarzystwa Diabetologicznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sól fizjologiczna 0,9% | BD | JB1324 | |
| Dekstroza 70% | McKesson | ||
| Intralipid 20% | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Metrycyd (aldehyd glutarowy 2,6%) | Metrex | 11-1401 | |
| Heparyna Sód 10 000 USP u/ml | PPC | ||
| Karprofen | Metacam | ||
| Glikopirolan | Sandoz | ||
| Izofluran | Abbott | ||
| Chlohekdydyna 2% | |||
| Alkohol 70% | |||
| Jod | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| Złącze 22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| Krętlik 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Łącznik Y 22G | Instech Solomon | ||
| Przeciwwaga i ramię | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G igły | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G | Instech Solomon | SP23/12 | |
| Uwięzi (12 cali) | Lomir | RT12D | |
| Płaszcze infuzyjne | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| Element mocujący | Lomir | RS T1 | |
| 60 ml | BD | 309653 | |
| Strzykawka 1 ml | BD | 309602 |
Bibliografia
- Poitout, V., Robertson, R. P. Glucolipotoxicity: fuel excess and beta-cell dysfunction. Endocr. Rev. 29, 351-366 (2008).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 289-298 (2010).
- Unger, R. H. Minireview: weapons of lean body mass destruction: the role of ectopic lipids in the metabolic syndrome. Endocrinology. 144, 5159-5165 (2003).
- Harmon, J. S., Gleason, C. E., Tanaka, Y., Poitout, V., Robertson, R. P. Antecedent hyperglycemia, not hyperlipidemia, is associated with increased islet triacylglycerol content and decreased insulin gene mRNA level in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 50, 2481-2486 (2001).
- Bachar, E., Ariav, Y., Cerasi, E., Kaiser, N., Leibowitz, G. Neuronal nitric oxide synthase protects the pancreatic beta cell from glucolipotoxicity-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis. Diabetologia. 53, 2177-2187 (2010).
- Peyot, M. L., et al. Beta-cell failure in diet-induced obese mice stratified according to body weight gain: secretory dysfunction and altered islet lipid metabolism without steatosis or reduced beta-cell mass. Diabetes. 59, 2178-2187 (2010).
- Hagman, D. K., et al. Cyclical and alternating infusions of glucose and intralipid in rats inhibit insulin gene expression and Pdx-1 binding in islets. Diabetes. 57, 424-431 (2008).
- Fontes, G., et al. Glucolipotoxicity age-dependently impairs beta cell function in rats despite a marked increase in beta cell mass. Diabetologia. 53, 2369-2379 (2010).
- Stein, D. T., et al. Essentiality of circulating fatty acids for glucose-stimulated insulin secretion in the fasted rat. J. Clin. Invest. 97, 2728-2735 (1996).
- Leahy, J. L., Cooper, H. E., Weir, G. C. Impaired insulin secretion associated with near normoglycemia. Study in normal rats with 96-h in vivo glucose infusions. Diabetes. 36, 459-464 (1987).
- Hager, S. R., Jochen, A. L., Kalkhoff, R. K. Insulin resistance in normal rats infused with glucose for 72 h. The American Journal of Physiology. 260, 353-362 (1991).
- Laybutt, D. R., Chisholm, D. J., Kraegen, E. W. Specific adaptations in muscle and adipose tissue in response to chronic systemic glucose oversupply in rats. The American Journal of Physiology. 273, E1-E9 (1997).
- Jonas, J. C., et al. High glucose stimulates early response gene c-Myc expression in rat pancreatic beta cells. The Journal of Biological Chemistry. 276, 35375-35381 (2001).
- Tang, C., et al. Glucose-induced beta cell dysfunction in vivo in rats: link between oxidative stress and endoplasmic reticulum stress. Diabetologia. 55, 1366-1379 (2012).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: a new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56, 1792-1801 (2007).
- Magnan, C., Gilbert, M., Kahn, B. B. Chronic free fatty acid infusion in rats results in insulin resistance but no alteration in insulin-responsive glucose transporter levels in skeletal muscle. Lipids. 31, 1141-1149 (1996).
- Goh, T. T., et al. Lipid-induced beta-cell dysfunction in vivo in models of progressive beta-cell failure. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292, 549-560 (2007).
- Pascoe, J., et al. Free fatty acids block glucose-induced beta-cell proliferation in mice by inducing cell cycle inhibitors p16 and p18. Diabetes. 61, 632-641 (2012).
- Bell, C. G., Walley, A. J., Froguel, P. The genetics of human obesity. Nature Reviews. Genetics. 6, 221-234 (2005).
- Fontes, G., Hagman, D. K., Latour, M. G., Semache, M., Poitout, V. Lack of preservation of insulin gene expression by a glucagon-like peptide 1 agonist or a dipeptidyl peptidase 4 inhibitor in an in vivo model of glucolipotoxicity. Diabetes Res. Clin. Pract. 87, 322-328 (2010).
- Crawford, P. A., Schaffer, J. E. Metabolic stress in the myocardium: Adaptations of gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. , (2012).
- Kewalramani, G., Bilan, P. J., Klip, A. Muscle insulin resistance: assault by lipids, cytokines and local macrophages. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab Care. 13, 382-390 (2010).
- Cusi, K. Role of obesity and lipotoxicity in the development of nonalcoholic steatohepatitis: pathophysiology and clinical implications. Gastroenterology. 142, 711-725 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
