Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

24.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50289

⸱

24 września 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Institute, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Division of Cardiology, Sapienza University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa. Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów. Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Streszczenie

Użycie pierwotnych kardiomiocytów (CM) w hodowli dostarczyło potężnego uzupełnienia mysich modeli chorób serca w pogłębianiu naszego zrozumienia chorób serca. W szczególności możliwość badania homeostazy jonów, funkcji kanałów jonowych, pobudliwości komórkowej i sprzężenia pobudzenie-skurcz oraz ich zmian w stanach chorobowych i mutacjach powodujących chorobę doprowadziła do istotnych informacji na temat chorób serca. Co więcej, brak odpowiedniej, unieśmiertelnionej linii komórkowej do naśladowania dorosłych CM oraz ograniczenia CM noworodków (którym brakuje wielu strukturalnych i funkcjonalnych biomechanik charakterystycznych dla dorosłych CM) w hodowli utrudniły nam zrozumienie złożonej zależności między szlakami sygnałowymi, kanałami jonowymi i właściwościami skurczowymi w dorosłym sercu, wzmacniając znaczenie badania dorosłych izolowanych kardiomiocytów. W tym miejscu przedstawiono metody izolacji, hodowli, manipulacji ekspresją genów przez białka ulegające ekspresji adenowirusa, a następnie analizy funkcjonalnej kardiomiocytów dorosłej myszy. Zastosowanie tych technik pomoże rozwinąć mechanistyczny wgląd w szlaki sygnałowe, które regulują pobudliwość komórkową, dynamikę Ca2 + i kurczliwość oraz zapewnią znacznie bardziej fizjologicznie istotną charakterystykę chorób sercowo-naczyniowych.

Wprowadzenie

Mysie modele chorób sercowo-naczyniowych posłużyły jako skuteczne narzędzia do wyjaśnienia podstawowych mechanizmów choroby1,2, jak również do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych1,3. W szczególności wykorzystanie zarówno mysich modeli nabytych chorób serca (takich jak przeciążenie ciśnienie)4,5, jak i transgenicznych modeli myszy pogłębiło naszą wiedzę na temat chorób serca6-8. Zastosowanie technik hodowli komórkowych do badania kaskad sygnałowych3,9,10 i zmian w poszczególnych białkach, które leżą u podstaw pobudliwości komórkowej i sprzężenia pobudzenie-skurcz w sercu11-13 na poziomie pojedynczej komórki, uzupełniło modele myszy in vivo. Jednak brak odpowiednich linii komórkowych, które odzwierciedlałyby strukturę i funkcję dorosłego CM, był znaczącym ograniczeniem. Badacze starali się przezwyciężyć ten problem, badając pojedyncze białka, takie jak kanały jonowe, w heterologicznych systemach ekspresji14 i chociaż badania te dostarczyły nam użytecznych informacji w zakresie biofizyki kanałów jonowych lub transportu białek, nieodpowiednia reprezentacja natywnego mikrośrodowiska CM jest znaczącym ograniczeniem. Po drugie, ponieważ większość tych heterologicznych komórek nie ma dojrzałego aparatu skurczowego, nie było możliwe zbadanie funkcji skurczowej i złożonej zależności między pobudliwością komórkową a skurczem. Z tego powodu naukowcy zwrócili się do pierwotnych hodowli komórek serca w wielu swoich badaniach funkcjonalnych in vitro. Wreszcie, izolowane badania kardiomiocytów pozwalają na ocenę funkcji skurczowej bez czynników zakłócających preparatu wielokomórkowego, w tym wpływu blizny lub zwłóknienia i orientacji włókien.

Pierwotne kardiomiocyty komorowe noworodków szczurów (NRVM) są stosunkowo łatwe do hodowli, mogą być infekowane adenowirusami i lentiwirusami do manipulowania ekspresją genów15, dlatego były z powodzeniem stosowane1, ale mają swoje własne ograniczenia. Chociaż zapewniają one fizjologiczne mikrośrodowisko1 i są koniem pociągowym pola sygnalizacyjnego, znaczne różnice między morfologią i organizacją subkomórkową NRVM i dorosłych kardiomioktaków sprawiają, że są one nieodpowiednim modelem do badania strumieni jonowych i sprzężenia wzbudzenie-skurcz w dorosłym sercu. W szczególności NRVM nie mają definitywnego podsystemu t-rurowego4. Ponieważ strumień i dynamika Ca2 + są krytycznie zależne od dojrzałej struktury kanalików t i siateczki sarkoplazmatycznej (SR)6, dynamika Ca2 + i badania funkcjonalne kurczliwości serca w NRVM nie są dokładnym odzwierciedleniem tych krytycznych procesów w dorosłych kardiomiocytach. Co więcej, niektóre składniki szlaków sygnałowych różnią się między noworodkami i dorosłymi myszami9, co stanowi kolejne ograniczenie w badaniu procesów chorobowych i ich wpływu na pobudliwość komórkową i kurczliwość w NRVM. Wreszcie, rozkład maszynerii kurczliwej prowadzi do wielokierunkowego i niejednorodnego skracania komórek, co ogranicza dokładność pomiarów kurczliwości.

Użycie izolowanych dorosłych kardiomiocytów zapewnia zatem dokładniejszy system modelowania in vitro. Niezwykły wzrost wiedzy, który stał się możliwy dzięki manipulacjom genetycznym na myszach, podkreśla znaczenie uzyskania funkcjonalnych izolowanych kardiomiocytów od myszy. W rzeczywistości charakterystyka dorosłych CM wyizolowanych z modeli mysich rzuciła światło na wiele zdarzeń biologicznych i patologicznych. Wyizolowane CM z transgenicznych modeli myszy pozwoliły na badania przyrostu lub utraty funkcji białek na właściwości kurczliwe pojedynczych komórek2,16 oraz żywotności w modelach chorób, takich jak niedokrwienie/reperfuzja17,18, uzupełniając w ten sposób informacje uzyskane z badań in vivo na tych myszach. Zastosowanie izolowanych dorosłych CM z mysich modeli nabytej choroby serca3,19,20 (takich jak przeciążenie ciśnieniowe wywołane zwężeniem poprzecznym aorty, które naśladuje nadciśnienie lub zwężenie zastawki aortalnej) lub ćwiczenia5,21 (do modelowania przerostu fizjologicznego) pozwala na zbadanie interakcji kaskad sygnałowych zaangażowanych w te procesy z pobudliwością komórkową i sprzężeniem wzbudzenie-skurcz na poziomie pojedynczej komórki. Co więcej, możliwość manipulowania ekspresją genów za pomocą ekspresji genów sterowanych przez adenowirusy w dorosłych CM daje nam możliwość przeanalizowania składników złożonych szlaków sygnałowych.

Z punktu widzenia elektrofizjologicznego, eksperymenty z napięciem i prądem w całych ogniwach na izolowanych dorosłych CM były kluczowe w wyjaśnieniu natury strumieni jonowych na linii wyjściowej i w różnych stanach chorobowych. Ze względu na złożoną strukturę błony komórkowej i zróżnicowane struktury rusztowań białkowych między dorosłymi CM i NRVM lub heterologicznymi liniami komórkowymi, zdolność do łatania dorosłych komórek daje znacznie lepszą reprezentację wpływu niektórych białek błonowych, białek strukturalnych i partnerów oddziałujących z kanałami jonowymi na elektrofizjologiczne składniki dorosłego serca.

Pomimo tak znaczących zalet w badaniu dorosłych kardiomiocytów myszy, izolowanie i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy było wyzwaniem, co wymaga systematycznego i dokładnego opisu metodologii izolowania żywotnych kardiomiocytów myszy i utrzymywania ich w hodowli, aby umożliwić dalszą manipulację genetyczną za pomocą wektorów wirusowych. W poprzednich badaniach stosowano albo ostro izolowane dorosłe CM myszy, albo hodowane dorosłe CM szczurów. Te ostatnie są łatwiejsze do hodowli niż dorosłe myszy CM, a większość eksperymentów manipulujących ekspresją genów in vitro wykorzystywała CM dorosłych szczurów. Niewiele badań z powodzeniem zmieniło i zbadało funkcjonalną ekspresję genów u dorosłych CM myszy, co stanowi duże ograniczenie w zakresie eksperymentów. Dlatego tutaj szczegółowo przedstawiamy takie metodologie, zmodyfikowane w stosunku do poprzednich badań, dla izolacji7,8,22, hodowli3,10,15,23, infekcji adenowirusowej11-13,15 oraz analizy funkcjonalnej kardiomioktionów komorowych dorosłych myszy. Ten protokół izolacji skutkuje tolerancyjnymi, pobudliwymi kardiomiocytami tolerującymi Ca2+, które z powodzeniem hodowaliśmy przez okres do 72 godzin i przejściowo transfekowaliśmy adenowirusem. Funkcjonalność tych izolowanych komórek można ocenić za pomocą systemu obrazowania MMSYS14,24 i patch clamp, które również zostaną omówione.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Izolacja kardiomiocytów

Materiały (Rysunek 1)

Kleszcze do mikropreparacji
Kleszczyki do tkanek
Delikatne kleszczyki hemostatyczne
Kleszcze hemostatyczne
Kleszczyki mikropreparacyjne, ząbkowane, zakrzywione
Nożyce robocze, proste
Nożyce robocze, zakrzywione
15 ml probówki Falcon (5)
60 mm szalka Petriego
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Siatka nylonowa - Rozmiar porów 400 μm
Mały lejek
Woskowany, pleciony jedwab 4-0, 19 mm, długość 7-10 cm
Igła niepodskórna, końcówka, 24 G lub dostępna w handlu igła do karmienia zwierząt (24 x 1 cal, szer. / 1-1/4)
Heparyna sodowa
Mieszanina ketaminy/ksylazyny
Pipety Pasteura
Gogle preparacyjne OptiVision
System IonOptix MMSYS

Uwaga: Jeśli hodujesz komórki, zobacz sekcję 2 na temat hodowli komórkowej przed rozpoczęciem tego protokołu.

Uwaga: Wszystkie myszy były pod opieką obiektu barierowego i poświęcane zgodnie z zatwierdzonymi przepisami, praktykami i procedurami IACUC.

Uwaga: Przed rozpoczęciem procedury, cały system powinien zostać wstępnie podgrzany, aby upewnić się, że wszystkie elementy systemu Langendorffa (Rysunek 2A, Rysunek 3) są ogrzane do 37 °C, aby umożliwić prawidłową i pełną aktywność kolagenazy.

  1. Wstrzyknij dorosłym myszom (~ 12 tygodni) 150 jednostek USP heparyny sodowej do przestrzeni brzusznej.
  2. Znieczulenie należy wykonać wstrzyknięciem mieszaniny ketaminy i ksylazyny w dawce zależnej od masy ciała (Tabela 1).
    1. 80:12 mg/kg ketamina:ksylazyna przepis: 2,6 ml ketaminy (100 mg/ml) + 0,4 ml ksylazyny (100 mg/ml) + 37 ml PBS. Końcowy: ketamina = 6,5 mg/ml; ksylazyna = 1 mg/ml
  3. Przymocuj uspokojoną mysz do podkładki operacyjnej, wytnij serce i umieść w naczyniu o temperaturze pokojowej PBS lub 0,9% soli fizjologicznej (Rysunek 1J). Sól fizjologiczna pozwala na skurczenie się nienaruszonego serca w celu lepszego wytłaczania krwi w komorze i łatwej identyfikacji aorty przed krokiem 1.6. Myszy zostały sprawdzone, aby upewnić się, że są głęboko znieczulone poprzez utratę odruchu szczypania palców tylnych kończyn i spowolnienie częstości oddechów przed rozpoczęciem torakotomii.
  4. Użyj gogli preparacyjnych OptiVision (ryc. 1A), aby zidentyfikować i odsłonić aortę. Usunięcie tkanki wokół aorty, chociaż ułatwia wizualizację naczynia, nie jest konieczne do optymalizacji izolacji komórek, jeśli korzeń aorty jest wyraźnie widoczny.
  5. Zalać pompę buforem perfuzyjnym (Tabela 2). Temperatura powinna być utrzymywana na poziomie 37 °C przez cały czas trwania zabiegu przy użyciu kontrolowanej, cyrkulacyjnej łaźni wodnej (ryc. 2D).
  6. Zamontuj serce na aparacie Langendorffa (ryc. 2A). Za pomocą dwóch kleszczy do mikropreparowania (ryc. 1D-E) zagruntuj aortę wokół niepodskórnej, igły końcowej (24 G) silikonową rurką na dystalnym końcu. Alternatywnie można użyć komercyjnej igły do karmienia zwierząt (24 x 1 cal, W/1-1/4). Silikonowa rurka na igle 24 G lub igle do karmienia zwierząt pozwoli na zamocowanie szwu nad rowkiem. Umieść aortę na igle jako skarpetę. (Rysunek 2C).
    1. Uwaga: Ważne jest, aby upewnić się, że koniec igły spoczywa w aorcie wstępującej, najlepiej w korzeniu aorty dystalnie do prawej bezimiennej, ale nie rozciąga się przez zastawkę aortalną do lewej komory, ponieważ poważnie ograniczy to zdolność do skutecznego przenikania przez serce przez tętnice wieńcowe.
  7. Przymocuj serce do igły, zawiązując niewielką długość jedwabiu do szycia (7-10 cm długości) (ryc. 1K) wokół górnej części aorty, upewniając się, że opaska znajduje się na poziomie aorty wstępującej, poniżej prawej tętnicy bezimiennej, ale znajduje się powyżej końca igły.
  8. Opuść serce do wnętrza stożkowego szkła (rysunek 2B), aby pomóc utrzymać odpowiednią temperaturę otoczenia.
  9. Perfuzjować serce buforem perfuzyjnym przez 5 minut z szybkością 1 ml/min i zacisnąć odpływ szklanej komory, aby perfuzat mógł zebrać się w stożkowym szkle i otoczyć serce. Schemat trawienia serca pokazano na rysunku 3.
    1. W tym momencie powinieneś zauważyć wzrost głośności serca. Dodatkowo krew w tkance serca zostanie zastąpiona perfuzatem, powodując bladość tkanek.
  10. Zwolnij zacisk odpływowy, aby spuścić perfuzat. Zatrzymaj pompę, aby przesunąć rurkę z pojemnika buforowego perfuzyjnego do pojemnika buforowego enzymu (rysunek 2E). Ponownie uruchomić pompę, aby rozpocząć perfuzję serca buforem enzymatycznym (Tabela 2) w dawce 1 ml/min. Ponownie zacisnąć odpływ, aby bufor enzymatyczny mógł otoczyć serce.
    1. Tutaj, gdy enzym przenika do serca i trawi tkankę łączną, serce stanie się bledsze, a integralność strukturalna zmniejszy się.
    2. Aby określić, kiedy należy odciąć komory od strawionego serca, wyjmij serce ze stożkowego szkła, delikatnie ściśnij serce kleszczami i zbierz kilka kropli perfuzatu na małej szalce Petriego i sprawdź, czy pojedyncze komórki opadają.
    3. Dla nowicjuszy pomocne jest połączenie linii perfuzyjnej z manometrem. Kiedy serce jest trawione, ciśnienie gwałtownie spada, ponieważ tkanka łączna nie utrzymuje oporu. Manometr jest również przydatny dla nowicjuszy, aby upewnić się, że pozycja igły znajduje się powyżej zastawki aortalnej, a nie w komorze. Niskie ciśnienie wskaże, że igła znajduje się w komorze komorowej, a wysokie ciśnienie wskazuje, że igła dotyka zaworu.
  11. Przeciąć komory z serca do naczynia pełnego buforu transferowego (A) (Tabela 2), gdy ciśnienie w komorze zacznie drastycznie spadać lub gdy będziesz w stanie zobaczyć pojedyncze komórki w perfuzacie. Zwykle zajmuje to ~7-10 minut.
  12. Ponownie za pomocą kleszczy do mikropreparowania (ryc. 1C), zmiel komory na małe kawałki, aby się rozdzielić. Udane trawienie nie pozostawi prawie żadnych stałych kawałków tkanki po zmieleniu, a większość tkanki stanie się amorficzna po dysocjacji.
    1. Aby jeszcze bardziej zdysocjować tkankę, pipetować roztwór za pomocą plastikowej pipety Pasteura (ryc. 4), z której końcówka została odcięta pod kątem ~45°. Modyfikacja ta służy zwiększeniu wewnętrznej przestrzeni średnicowej końcówki pipety, zmniejszając w ten sposób naprężenia ścinające na komórkach podczas rozcierania tkanki.
    2. Przed wypreparowaniem tkanki kleszczami możliwe jest rozdzielenie poszczególnych komór i osobna dysocjacja komórek przedsionkowych, lewej lub prawej komory.
  13. Przymocuj kwadratową siatkę (Rysunek 1M) do małego lejka (Rysunek 1L) za pomocą zacisków i umieść to urządzenie filtrujące w 15 ml probówce Falcon (Rysunek 1I).
  14. Użyj zmodyfikowanej pipety Pasteura, aby usunąć roztwór komórek z naczynia i przefiltrować roztwór do probówki Falcon.
  15. Pozwól żywym komórkom osiąść na dnie probówki (sedymentacja żywych komórek powinna zająć 2-4 minuty).
  16. Podaniec 2,5 ml każdego z czterech roztworów wapnia (Tabela 3) do 4 oddzielnych probówek Sokoła o pojemności 15 ml.
  17. Ponownie za pomocą standardowej pipety Pasteura ostrożnie usuń osad komórek z dna probówki i przenieś komórki do pierwszego z roztworów wapnia.
  18. Pozwolić, aby komórki osiadły na dnie probówki i powtórzyć krok 1.17 w kolejnych roztworach wapnia, aż komórki znajdą się w ostatnim roztworze.
  19. Nie pozwól, aby komórki osiadły w czwartym roztworze wapnia. Zakręć rurkę i obróć ją na bok.

2. Hodowla komórkowa

  1. Przed izolacją rozmieścić na szklanych szkiełkach nakrywkowych 1 μg/ml naturalną mysią lamininę i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 2%CO2. Pozwól również posiewowi i pożywkom hodowlanym (Tabela 4) ogrzać się w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 2% CO2 . Pozwala to na zrównoważenie rozpuszczonego w pożywceCO2 .
    1. Nie zdejmuj górnej części z nośnika. Po prostu poluzuj górę, aby uniknąć zanieczyszczenia.
  2. Pozwól, aby izolowane komórki osadzały się na dnie probówki Falcon.
  3. Usunąć osad za pomocą standardowej plastikowej pipety Pasteura i ponownie zawiesić w odpowiedniej ilości materiału galwanicznego.
  4. Umieścić komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą w naczyniu o odpowiedniej wielkości i inkubować w temperaturze 37 °C i 2% CO2 przez co najmniej 30-60 minut, aby komórki mogły przylgnąć do szkiełek nakrywkowych.
  5. **W przypadku transfekcji adenowirusem należy rozcieńczyć wirusa w odpowiedniej ilości pożywki galwanicznej i zastąpić pożywkę galwaniczną w naczyniu pożywką zawierającą wirusa. Pozwól wirusowi inkubować na komórkach przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 2% CO2.**
  6. Usuń pożywkę galwaniczną z naczynia i zastąp ją pożywką hodowlaną.
  7. Ostrożnie zmieniaj pożywkę hodowlaną każdego dnia, aby nie naruszyć komórek na szkiełkach nakrywkowych.

Korzystając z tej procedury, komórki były pomyślnie hodowane przez okres do 72 godzin. Obrazy komórek hodowanych i transfekowanych GFP można znaleźć na rysunku 5.

3. System MMSYS

  1. Zasil system MMSYS, upewniając się, że lampa łukowa jest uruchamiana jako pierwsza.
  2. Podłącz rurki pompy do odpowiednich wlotów i wylotów komory MMSYS (Rysunek 6).
  3. Zalać system buforem wapniowym (B) (Tabela 2).
  4. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe o odpowiedniej wielkości w komorze i zamocuj (Rysunek 6E). W większości studzienek MMSYS stosuje się szkiełka nakrywkowe o średnicy 22 mm lub 25 mm. Zapoznaj się z instrukcją obsługi MMSYS, aby określić odpowiednie szkiełko nakrywkowe dla swojej komory.
  5. Przenieść 500 μl roztworu komórkowego do małej probówki Eppendorfa.
  6. Dodać 0,5 μl Fura2-AM (roztwór podstawowy 1 μg/μl) do małej probówki z komórkami i pozostawić je do inkubacji w ciemności w temperaturze pokojowej przez 5-7 minut. Dzięki temu Fura2-AM może "załadować się" do komórek poprzez szybką pasywną dyfuzję przez błonę komórkową.
    1. Pozwól, aby komórki załadowane Fura-2 opadły na dno probówki, a nadmiar Fury przemyj 500 μl buforu wapniowego B.
  7. Wyłącz światła w pokoju.
  8. Używając standardowej pipety Pasteura, wrzuć 1-2 krople (w zależności od stężenia komórek) "załadowanego" roztworu komórek na środek komory (Rysunek 6C) i pozwól komórkom osiąść na szkiełku nakrywkowym przez 5 minut.
    1. Zagęszczenie komórek w komorze powinno być takie, aby pojedyncze, nienakładające się na siebie komórki można było łatwo wyświetlić na platformie akwizycji danych MMSYS.
  9. Ostrożnie zacznij przepływać bufor wapniowy (B) przez komorę.
  10. Zwiększyć temperaturę komory do 37 °C.
    1. WAŻNE: Nie włączaj urządzenia grzewczego, dopóki przepływ nie zostanie zainicjowany. Może to spowodować poważne uszkodzenie termosprzęgu ze sprzężeniem zwrotnym (Rysunek 6A).
  11. Upewnij się, że komora jest podłączona do MyoPacer za pomocą przewodów połączeniowych (Rysunek 6B) i zacznij nawiązywać tempo dla komórek z częstotliwością 5 Hz przy 1,5-krotności progu stymulacji dla komórek.
  12. Wybierz komórkę, która bije z odpowiednią częstotliwością i przesuń ją do otworu kadrowania.
  13. Dostosuj wymiary przysłony kamery i kadrowania tak, aby cała komórka znajdowała się na środku okna, skierowana poziomo, z widocznymi sarkomerami.
    1. Dla długości ogniwa dopasuj czerwone i zielone (prawy i lewy) wskaźniki fotodiody do krawędzi ogniwa. Dostosuj kontrast, aby zoptymalizować kontrast czerni i bieli na krawędziach komórki. Więcej informacji można znaleźć w instrukcji obsługi Ionoptix.
  14. Umieść pudełko w obszarze komórki zawierającym dobrze zdefiniowane sarkomery i dostosuj ostrość, aby zoptymalizować szczyt widma mocy (czerwony). Dostosuj także jasność mikroskopu, aby zoptymalizować niebieskie okno wygładzania i informacje o kontraście czerni.
  15. Dostosuj zielone paski progowe, aby uchwycić jak najwięcej czerwonego widma mocy (szczytu) i jak najmniej tła.
  16. Rozpocznij nagrywanie.
  17. Po zarejestrowaniu wystarczającej ilości danych kliknij "Pauza", aby tymczasowo zatrzymać nagrywanie i, upewniając się, że ani ostrość, ani wymiary viewokienko nie uległy zmianie, przesuń stolik mikroskopu do obszaru szkiełka nakrywkowego, w którym nie widać żadnych komórek ani materiału komórkowego. Długość nagrania różni się w zależności od protokołu eksperymentalnego badacza.
    1. Uwaga: Kliknięcie "Zatrzymaj" zakończy nagrywanie i nie będzie można nagrać tła dla tej komórki.
  18. Kliknij "Wznów", aby zarejestrować pomiar tła.
  19. Po nagraniu wystarczającej ilości tła kliknij "Stop", aby zakończyć nagrywanie.
  20. Kliknij "Plik >> Zapisz", aby zapisać wszystkie ślady dla tej komórki w jednym pliku .zpt.
  21. Powtarzaj kroki od 3.12 do 3.20, aż zostanie zarejestrowana wystarczająca liczba komórek.
  22. Zapoznaj się z instrukcją obsługi IonOptix-MMSYS 12, aby uzyskać instrukcje dotyczące analizy zarejestrowanych danych. Charakterystyczne zarejestrowane dane kardiomiocytów typu dzikiego przedstawiono na rycinie 7.

4. Zacisk łatki

Zaciskanie kropek różnych typów komórek zostało już dobrze opisane w tym czasopiśmie25-28. Dlatego skupiamy się na niektórych krytycznych parametrach dla skutecznego zaciśnięcia plastrów dorosłych kardiomiocytów wyizolowanych przy użyciu opisanego przez nas protokołu.

  1. Za pomocą ściągacza do pipet i szkła borokrzemianowego (z żarnikiem: średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm - długość 10 cm) wyciągnij pipetę, która po napełnieniu roztworem pipet wykazuje ~2,0-3,0 MΩ (Tabela 5).
  2. Delikatnie wypoleruj końcówkę pipety za pomocą Narishige lub innej pionowej polerki ogniowej. Rezystancja pipety z plastrem powinna wynosić 2-4 MO po polerowaniu ogniowym.
  3. Włącz komputer, wzmacniacz (Axopatch 200B), przetwornik A-D (Digidata 1440A, Axon Instruments) i mikromanipulator (MP-285). W przypadku mocowania łatek na całe ogniwa zaczynamy od standardowych parametrów, jak opisano wcześniej.
  4. W przypadku hodowlanych dorosłych CM należy wyjąć je z inkubatora i delikatnie umyć szkiełko nakrywkowe, na którym CM są powlekane PBS w temperaturze pokojowej.
  5. Delikatnie wyjmij szkiełko nakrywkowe i umieść je w komorze perfuzyjnej w mikroskopie odwróconym (Nikon TE 2000).
    1. Upewnij się, że wlot systemu perfuzyjnego i wylot (do zasysania) znajdują się tuż nad powierzchnią szkiełka nakrywkowego.
  6. Rozpocznij perfuzję odpowiednim roztworem zewnątrzkomórkowym (Tabela 5).
  7. W przypadku świeżo zdysocjowanych dorosłych CM umieść szkiełko nakrywkowe pokryte kolagenem w systemie perfuzyjnym, jak powyżej.
    1. Ponieważ komórki będą w roztworze, delikatnie zastąp roztwór buforem zewnątrzkomórkowym.
  8. Używając zmodyfikowanej pipety Pasteura (ryc. 4), delikatnie zawiesić komórki w buforze zewnątrzkomórkowym, pobrać porcję i umieścić ją na szkiełku nakrywkowym.
  9. Pozwól komórkom przyczepić się na 10-15 minut przed rozpoczęciem perfuzji, jak w 4.4.
  10. Wypełnij z powrotem pipetę z łatami na całe komórki buforem wewnątrzkomórkowym za pomocą igły Microfil (World Precision Instruments, 28 G). Upewnij się, że na końcówce pipety nie ma pęcherzyków powietrza; Delikatnie postukaj, aby pęcherzyki powietrza wypłynęły na powierzchnię roztworu.
  11. Przymocuj napełnioną pipetę z plastrem do uchwytu na pipetę, upewniając się, że mikroelektroda styka się z roztworem wewnętrznym.
    1. Używamy elektrod chlorkowo-srebrowych, ale należy dbać o "chlorowanie" drutów srebra przynajmniej raz w tygodniu, zanurzając je na noc w domowym wybielaczu.
  12. Delikatnie opuść pipetę do kąpieli, upewniając się, że elektroda kąpielowa jest przez cały czas zanurzona w kąpieli/roztworze zewnątrzkomórkowym. W tym momencie zrównoważyć wszelkie potencjały złączy cieczy. Duże potencjały złączowe mogą być oznaką pogarszającego się stanu chlorku srebra na elektrodach.
  13. Zdrowe cylindryczne dorosłe CM są identyfikowane w mikroskopie i wyśrodkowane w polu widzenia. Jak opisano wcześniej, połączenie przesuwania mikromanipulatora i regulacji ostrości pozwala na bliskie zbliżenie pipety z plastrem do powierzchni CM.
    1. Gdy znajdą się one w tej samej płaszczyźnie ogniskowej, stosujemy kombinację wizualizacji ogniwa i impulsu testowego (dostępnego w Axopatch 200B).
    2. Gdy rezystancja pipety zmniejszy się o połowę (co sugeruje, że pipeta styka się z powierzchnią celi), a kuweta nadal wygląda na cylindryczną, ustanawiamy uszczelnienie gigaomowe za pomocą delikatnego ssania.
    3. W przypadku CM preferujemy ssanie przez usta, aby wytworzyć podciśnienie. Jeśli uda nam się uzyskać gigaseal, ponownie używamy delikatnego, rytmicznego ssania przez usta, aby "włamać się" do komórki, aby ustanowić tryb łaty na całe komórki.
  14. Typowe potencjały spoczynkowe zdrowych CM są rzędu -85 do -90 mV. Po uzyskaniu gigaseal należy zmierzyć spoczynkowy potencjał membrany za pomocą cęgów prądowych o wartości I=0 pA.
    1. Jeśli spoczynkowy potencjał błonowy jest zdepolaryzowany, może to wskazywać na uszkodzoną komórkę lub słabe uszczelnienie.
  15. Ponieważ CM są dużymi ogniwami o dużej powierzchni, należy zwrócić szczególną uwagę na kompensację pojemności, zwłaszcza gdy konieczne jest zbadanie szybko aktywujących się prądów, takich jak kanał sodowy. Jeżeli nie można uzyskać odpowiedniej kompensacji pojemności za pomocą wbudowanych ustawień kompensacji w generatorze impulsów, może być konieczne zastosowanie impulsów wstępnych przy napięciu podprogowym i przeciwnej polaryzacji oraz odjęcie prądu wynikowego od rejestrowanego sygnału. Taki protokół można łatwo zaprogramować w Axopatch.
  16. Po ustaleniu trybu łatania całego ogniwa odczekaj 15 minut, aby umożliwić równowagę i zapewnić stabilność uszczelki przed rozpoczęciem protokołów cęgowania napięcia lub prądu. Korzystamy ze standardowych protokołów, które zostały już wcześniej opisane w tym i innych czasopismach i nie będą rozwijane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Izolacja dorosłych kardiomiocytów pozwala na uzyskanie komórek o kształcie pręcikowatym, prążkowanych i spoczynkowych (niebijących samoistnie) (Rycina 5A). Martwe komórki będą miały kształt kulisty i nie będą wykazywać prążkowania. Komórki spoczynkowe można hodować i transfekować adenowirusami w celu manipulacji ekspresją genów (Ryciny 5B oraz 5C). Po 24 h hodowli morfologia żywych komórek nie ulega zmianie, pozostają one tolerancyjne na Ca2+ i mogą być stymul...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie opisaliśmy techniki niezbędne do skutecznej izolacji i hodowli dorosłych CM z serca myszy. Nasza technika pozwala na późniejsze badanie funkcji CM i pobudliwości przy użyciu metod opisanych powyżej. Krytycznym parametrem dla badania funkcjonalności dorosłych CM jest zdrowie i jakość izolowanych CM. Jak opisano powyżej, nasze techniki pozwalają na uzyskanie wysokiej wydajności funkcjonalnych komórek, które są podatne na manipulację ekspresją genów przy użyciu infekcji adenowirusowych/lentiwirusowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek soduSigmaS7653
Chlorek potasuSigmaP9333
Chlorek magnezuSigmaM8266
HEPESSigmaH3375
Fosforan sodu jednozasadowySigmaS8282
D-glukoza minimalnaSigmaG8270
TaurynaSigmaT0625
Monoksym 2,3-butanodionuSigmaB0752
Kolagenaza BRoche Nauki stosowane11088807001
Kolagenaza DRoche Nauki stosowane11088858001
Proteaza XIV ze Streptomyces griseusSigmaP5147
Albumina z surowicy bydlęcejSigmaA2153
Chlorek wapniaSigmaC8106
Minimum niezbędnych pożywekSigma51411C
Roztwór albuminy z surowicy bydlęcejSigmaA8412
L-glutaminaSigmaG3126
Penicylina-StreptomycynaSigmaP4333
Pożywka z seleninu insuliny-transferyny sodu suplementSigmaI1884
Chlorek cezuSigma289329
GlutaminianSigmaG3291
Sól magnezowa adenozyny 5'-trifosforanuSigmaA9187
Glikol etylenowy-bis(2-aminowy– kwas N,N,N',N'-tetraoctowySigmaE3889
Roztwór wodorotlenku cezuSigma232041
Roztwór wodorotlenku tetraetyloamonuSigma86643
Szklany wizjer lornetkowy OptiVisorDohegan Optical Company Inc.Nie dotyczy
Kleszczyki do tkanek, 5,5", 1x2 zębyRoboz ScientificRS-8164
Kleszcze Moloney - 4,5" (11,5 cm) długości lekkiej krzywizny, ząbkowane Kleszcze Roboz ScientificRS-8254
Dumont #3, Dumostar, rozmiar końcówki 0,17 x 0,10 mmRoboz ScientificRS-4966
Kleszczyki do komarów Packer 5" Proste płaskieRoboz ScientificRS-7114
Nożyczki do mikro preparacji 4,5 "Zakrzywione Ostre / Ostre Roboz ScientificRS-5917
Mikro nożyczki preparacyjne 3,5" Proste Ostre / Ostre20mmRoboz ScientificRS-5907

Bibliografia

  1. Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
  2. Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
  3. Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
  4. Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
  5. Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
  6. Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
  7. Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
  8. Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
  9. Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
  10. Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
  11. Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
  12. Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
  13. Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O'Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
  14. Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
  15. Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
  16. Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
  17. Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
  18. Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
  19. Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
  20. Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
  21. Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
  22. Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
  23. Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
  24. Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -S. Methods in Molecular Biology. 689, Humana Press. 205-214 (2010).
  25. Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269(2011).
  26. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936(2008).
  27. Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107(2010).
  28. Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351(2010).
  29. Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
  30. Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
  31. Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
  32. Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kardiomiocyty doros ej myszyizolacja kardiomiocyt whodowla kardiomiocyt wanaliza gospodarki wapniowejpomiar kurczliwo ciadenowirusowa ekspresja gen wsystem buforu perfuzyjnegotrawienie buforem enzymatycznympomiar d ugo ci sarkomeruanaliza ratiometryczna
Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.