Modele myszy do miażdżycy przeszczepów

Podsumowanie

Opisujemy protokoły dla naszych modeli miażdżycy przeszczepów myszy (GA), które polegają na wprowadzeniu segmentu naczynia myszy do biorcy tego samego szczepu wsobnego. Poprzez krzyżowanie wsteczne dodatkowych zmian genetycznych z dawcą naczynia, model może ocenić wpływ określonych genów na GA.

Streszczenie

Miażdżyca tętnic (GA), zwana także vaskulopatią alloprzeszczepu, jest zmianą patologiczną, która rozwija się przez miesiące lub lata w przeszczepionych narządach, charakteryzującą się rozlanym, obwodowym zwężeniem całego drzewa naczyniowego przeszczepu. Najbardziej krytycznym składnikiem patogenezy GA jest proliferacja komórek przypominających mięśnie gładkie w obrębie błony wewnętrznej. Gdy ludzki odcinek tętnicy wieńcowej zostanie umieszczony w aorcie podnerkowej myszy z niedoborem odporności, błony wewnętrzne mogą zostać rozszerzone w odpowiedzi na adoptywnie przeniesione ludzkie limfocyty T allogeniczne do dawcy tętnicy lub egzogennego ludzkiego IFN-γ przy braku ludzkich limfocytów T. Wprowadzenie aorty myszy z jednego szczepu do innego biorcy szczepu myszy jest ograniczone jako model przewlekłego odrzucenia u ludzi, ponieważ ostra reakcja odrzucenia za pośrednictwem komórki w tym modelu mysim całkowicie eliminuje wszystkie komórki naczyniowe pochodzące od dawcy z przeszczepu w ciągu dwóch-trzech tygodni. Niedawno opracowaliśmy dwa nowe modele myszy, aby obejść te problemy. Pierwszy model polega na wprowadzeniu segmentu naczynia od samca myszy do samicy biorczyni tego samego szczepu wsobnego (C57BL/6J). Odrzucenie przeszczepu w tym przypadku jest skierowane tylko przeciwko niewielkim antygenom zgodności tkankowej kodowanym przez chromosom Y (obecnym u mężczyzny, ale nie u kobiety), a następująca po tym reakcja odrzucenia jest wystarczająco powolna, aby zachować komórki mięśni gładkich pochodzące od dawcy przez kilka tygodni. Drugi model polega na wprowadzeniu odcinka tętnicy od dawcy myszy C57BL/6J typu dzikiego do myszy gospodarza tego samego szczepu i płci, która nie ma receptora dla IFN-γ, a następnie podaniu mysiego IFN-γ (dostarczanego przez zakażenie wątroby myszy wektorem adenowirusowym. W tym przypadku nie ma odrzucenia, ponieważ zarówno myszy dawcy, jak i biorcy są tego samego szczepu i płci, ale komórki mięśni gładkich dawcy proliferują w odpowiedzi na cytokinę, podczas gdy komórki pochodzące od gospodarza, pozbawione receptora dla tej cytokiny, nie reagują. Poprzez krzyżowanie wsteczne dodatkowych zmian genetycznych z dawcą naczynia, oba modele mogą być wykorzystane do oceny wpływu określonych genów na progresję GA. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły dla naszych modeli GA myszy.

Wprowadzenie

Najbardziej krytycznym składnikiem patogenezy GA jest proliferacja komórek podobnych do mięśni gładkich w obrębie błony wewnętrznej; jeśli ten proces może zostać zatrzymany, jest mało prawdopodobne, aby GA postępowało. Wcześniejsze prace naszej grupy wykazały, że błony wewnętrzne ludzkich segmentów tętnic wieńcowych umieszczone w aorcie podnerkowej myszy z niedoborem odporności rozszerzają się w odpowiedzi na adoptywnie przeniesione ludzkie limfocyty T allogeniczne do dawcy tętnicy i że proces ten można zahamować przez neutralizację ludzkiego IFN-γ ¹⁸. Ponadto egzogenny ludzki IFN-γ może powodować proliferację komórek mięśni gładkich naczyń wewnętrznych (i przyśrodkowych) w tych przeszczepach tętniczych przy braku ludzkich limfocytów T ^{15, 17}. (Ważne jest, aby pamiętać, że człowiek i mysz IFN-γ nie krzyżują gatunków, co wyklucza pośredni wpływ na mysiego gospodarza w tym eksperymentalnym systemie). Te humanizowane modele mysie mają tę zaletę, że rekapitulują interakcje między ludzkimi komórkami T a komórkami naczyniowymi, a zmiany w błonie wewnętrznej są w dużej mierze zbudowane z komórek ludzkich (tj. pochodzących ze szczepu), jak zaobserwowano w próbkach klinicznych, ale nie podsumowują w pełni sytuacji klinicznej, ponieważ ignorują rolę makrofagów gospodarza i prawdopodobnie innych typów komórek zaangażowanych w kliniczne zmiany po przeszczepie. Konwencjonalny mysi model tego procesu mógłby teoretycznie rozwiązać ten problem, uzupełniając ograniczenia humanizowanego modelu poprzez zaangażowanie kompletnego układu odpornościowego gospodarza i zapewniając dodatkową korzyść w postaci umożliwienia zastosowania mocy mysich podejść genetycznych do GA. Dwa najczęściej stosowane modele mysie obejmują heterotopowy przeszczep serca i przeszczep tętnicy ortotopowej ¹. Zmiany, które rozwijają się w tętnicach heterotopowych przeszczepów serca, składają się w dużej mierze z komórek gospodarza, prawdopodobnie pochodzących ze szpiku kostnego, podczas gdy komórki wewnętrzne tętnic w przeszczepach ludzkiego serca są głównie pochodzenia przeszczepowego ^{5, 13, 19}. Jest to znaczące wyróżnienie, które skłoniło nas do opracowania alternatywnych modeli myszy. Wprowadzenie aorty myszy z jednego szczepu do innego biorcy szczepu myszy jest jeszcze bardziej ograniczone jako model przewlekłego odrzucenia u ludzi, ponieważ ostra reakcja odrzucenia za pośrednictwem komórek w tym modelu mysim całkowicie eliminuje wszystkie komórki naczyniowe pochodzące od dawcy z przeszczepu w ciągu dwóch-trzech ^tygodni. W związku z tym późniejsze zmiany obserwowane w segmencie naczynia wstawionego są wyłącznie reakcją komórek gospodarza, które ponownie zasiedliły rusztowanie naczynia zdekomórkowego, tworząc wysoce sztuczną sytuację o ograniczonym znaczeniu jako model zmian w naczyniach przeszczepu, które zachodzą w klinice. Niedawno opracowaliśmy dwa nowe modele myszy, aby obejść te problemy ²¹. Pierwszy model polega na wprowadzeniu segmentu naczynia od samca myszy do samicy biorczyni tego samego szczepu wsobnego (C57BL/6J). Drugi model polega na wprowadzeniu odcinka tętnicy od dawcy myszy C57BL/6J typu dzikiego do myszy gospodarza tego samego szczepu i płci, która nie ma receptora dla IFN-γ (IFN-γR-KO), a następnie podanie mysiego IFN-γ (dostarczonego w wyniku zakażenia wątroby myszy wektorem adenowirusowym). Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły i zalety naszych modeli GA myszy.

Protokół

Model przeszczepu allogenicznego i przeszczepu syngenicznego u myszy

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalne komitety ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania na Uniwersytecie Yale. W przypadku modelu przeszczepu allogenicznego segmenty aorty piersiowej samców, 4-5 tygodniowych myszy WT (C57BL/6J) lub IFN-γR-KO zostały wprowadzone do aorty brzusznej biorczyni w wieku 8-12 tygodni WT przy użyciu kompleksowej techniki zespolenia mikrochirurgicznego (szczegóły poniżej). W przypadku modelu przeszczepu syngenicznego segmenty aorty piersiowej od samców, 4-5 tygodniowych myszy WT zostały wprowadzone do aorty brzusznej samca, 8-12 tygodniowego IFN-γR1-KO przy użyciu kompleksowej techniki zespolenia mikrochirurgicznego. Po 1 tygodniu od operacji zwierzętom zaszczepiono dożylnie Ad5.CMV-mysz IFN-γ lub Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) w dawce 1 x 10⁹ PFU. Poziomy IFN-γ w surowicy myszy mierzono metodą ELISA (eBioscience) po 1 i 5 tygodniach od podania adenowirusa. Niektóre zwierzęta otrzymywały BrdU (Sigma-Aldrich) w dawce 100 mg/kg s.c. przez 2 tygodnie przed uśmierceniem.

Kompleksowa technika zespolenia mikrochirurgicznego (Wideo zostanie nagrane na potrzeby tej części):

1. Procedura dawcy

1. Znieczulenie myszy dawców za pomocą dootrzewnowych wstrzyknięć ketaminy (50 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
2. Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia umieść myszy dawcy pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu X8-30 na tacy w pozycji leżącej na plecach i użyj podkładki jodowej i podkładki alkoholowej do przygotowania ściany klatki piersiowej.
3. Naciąć przednią ścianę klatki piersiowej przez żebra i przeponę, aby odsłonić serce.
4. Otwórz prawy przedsionek, wstrzyknij 10 ml heparynizowanego (100 j./ml) roztworu soli fizjologicznej do lewej komory, aby przepłukać myszy za pomocą 10-milimetrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 25.
5. Wyciąć serce i płuca, aby odsłonić całą długość aorty piersiowej.
6. Dokładnie wypreparuj aortę piersiową, aby zminimalizować bezpośredni uraz, jednocześnie identyfikując, podwiązując i dzieląc gałęzie drewna za pomocą szwu 11-0 w pobliżu aorty.
7. Gdy aorta piersiowa jest wolna od otaczających tkanek, należy wyciąć całą aortę piersiową do przeszczepu.
8. Przepłukać odcięty koniec aorty dawcy heparynizowanym (100 j./ml) roztworem soli fizjologicznej i przechowywać go w tym samym roztworze na lodzie (do 6 godzin) do czasu przeszczepu.

2. Procedura odbiorcy

1. Wstrzyknąć myszom biorcom ip ketoprofen (5 mg / kg) w celu znieczulenia, a następnie znieczulić myszy ip ketaminą (50 mg / kg) i ksylazyną (10 mg / kg). Myszy biorcy są głęboko znieczulone w ciągu 10 minut przez 60-90 minut. Podczas zabiegu poziom znieczulenia ocenia się co 15 minut, ściskając przednią ścianę brzucha lub stopę za pomocą kleszczy. Jeśli zwierzę zareaguje na szkodliwe bodźce w dowolnym momencie podczas operacji, dodatkowa dawka ketaminy i ksylazyny (1/4 lub 1/3 dawki pierwotnej) zostanie podana przez s.c. lub domięśniowo.
2. Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia należy zgolić sierść w przedniej części brzucha za pomocą golarki elektrycznej, oczyścić skórę za pomocą Jodine Prep Pad i Alcohol Prep Pad, zakryć oczy maścią okulistyczną. Podczas operacji zostaną zastosowane następujące techniki aseptyki, w tym czyszczenie stołu operacyjnego 10% wybielaczem, noszenie sterylnych rękawiczek i używanie wysterylizowanych narzędzi mikrochirurgicznych (narzędzia sterylizowane parą na początku operacji, a następnie narzędzia sterylizowane gorącymi szklanymi kulkami między wieloma operacjami itp.).
3. Umieść myszy biorców pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu X8-30 na tacy w pozycji leżącej.
4. Naciąć ścianę brzucha na linii środkowej od ksylfoidalności do kości łonowej i rozsunąć ścianę brzucha za pomocą mikroretraktora, aby odsłonić jamę brzuszną.
5. Cofnij jelita wyżej i owiń gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Myszy biorcy zostają wychłodzone przez utratę ciepła przez uzewnętrznione jelita. Ważne jest, aby utrzymać ciepło zwierząt. Jednak płyta grzewcza nie jest używana podczas operacji, ponieważ umiarkowana hipotermia jest korzystna w zapobieganiu urazom kręgosłupa podczas niedrożności przepływu krwi w aorcie, a także występuje nieefektywny transfer ciepła przy braku przepływu krwi do dolnej połowy ciała myszy.
6. Przesuń narządy rozrodcze niżej, owiń obszary brzucha myszy biorców gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej i użyj jej do cofnięcia odbytnicy na prawą stronę brzucha. Odsłonięte tkanki są okresowo nawadniane roztworem soli fizjologicznej podczas przeszczepu.
7. Dokładnie wypreparuj tępo odcinek aorty podnerkowej między naczyniem nerkowym a rozwidleniem aorty dystalnie i oddzielnie od żyły głównej dolnej (IVC).
8. Zidentyfikuj i podwiąż wszystkie małe gałęzie pochodzące z tego segmentu aorty brzusznej za pomocą nici monofilamentowej z poliamidu 11-0.
9. Zacisnąć krzyżowo izolowany segment aorty brzusznej za pomocą dwóch zacisków naczyniowych oddalonych od siebie o 5 mm, po jednym na każdym końcu.
10. Przeciąć aortę brzuszną między zaciskami za pomocą ostrych mikronożyczek, aby utworzyć miejsca zespolenia.
11. Należy wyciąć mały odcinek aorty brzusznej (do 0,4 mm długości) z jednego odciętego końca przeciętej aorty biorcy, aby pomieścić przeszczep aorty dawcy.
12. Przepłukać segmenty aorty między zaciskami za pomocą heparynizowanego roztworu soli fizjologicznej, aby usunąć pozostałą krew. Odcinki aorty między klamrami a przeszczepem aorty dawcy są okresowo przepłukiwane heparynizowanym (100 U/ml) roztworem soli fizjologicznej (do 40 ml/kg) podczas zespolenia.
13. Przeciąć obie strony aorty dawcy ostrymi mikronożyczkami, aby utworzyć segment przeszczepu o długości 2,5 mm do przeszczepu.
14. Umieścić przeszczep aorty dawcy w pozycji ortotopowej, zespoleć bliższy i dalszy koniec przeszczepu dawcy z bliższym i dalszym końcem cięcia biorcy odpowiednio z bliższym i dalszym końcem cięcia aorty brzusznej, z wzorem od końca do końca przy użyciu nici z monofilamentu poliamidowego 11-0.
15. W przypadku szwów ciągłych najpierw umieść szwy rozwleczone w pozycjach godziny 3 i 9. Pomiędzy dwoma szwami odciągowymi po każdej stronie przeszczepu, zespol obie krawędzie cięcia w 3-4 szwach za pomocą szwów biegnących i zawiąż szwy biegnące, aby szwy pozostały podwójnym węzłem. Ponieważ obie warstwy zamknięcia są ciągłe, zwiększa się ryzyko rozejścia się. Przeszczep aorty dawcy powinien mieć odpowiednią długość, aby połączyć proksymalny i dystalny koniec aorty brzusznej biorcy.
16. W przypadku przerwanych szwów należy najpierw wykonać cztery zespolenia na godzinie 3 i 9 po obu stronach przeszczepu, a następnie zespoleć oba przecięte krawędzie w 3-4 szwach między dwoma szwami podciągowymi po każdej stronie przeszczepu.
17. Zwolnij dystalny zacisk, aby umożliwić wsteczny przepływ do przeszczepu, zidentyfikuj miejsca krwawienia i wykonaj dodatkowe szwy w ciągu 3 minut.
18. Po upewnieniu się, że hemostaza jest zadowalająca, zwolnij proksymalny zacisk.
19. Potwierdzić drożność przeszczepu przez obecność energicznej pulsacji w przeszczepie i bliższym sąsiednim segmencie natywnej aorty brzusznej, w szczególności w dystalnym sąsiednim odcinku aorty brzusznej i tętnicy krezkowej dolnej. Należy rozważyć zakrzepicę w miejscach zespolenia, jeśli pulsacja zmniejsza się w ciągu kilku minut po przywróceniu przepływu krwi.
20. Wróć jelita do jamy brzusznej.
21. Szew zamyka ścianę brzucha za pomocą nylonowego szwu 5-0 odpowiednio w warstwie mięśniowej i warstwie skóry.
22. Umieść myszy biorcy w czystej klatce na poduszce grzewczej i odczekaj 1-2 godziny, aż myszy odzyskają przytomność i dojdą do siebie po znieczuleniu. Ważne jest, aby podczas rekonwalescencji utrzymać zwierzę w odpowiednim cieple. Trzymaj myszy w ciepłej i suchej klatce, zanim zwierzę obudzi się ze znieczulenia.
23. Oceń funkcję motoryczną kończyn tylnych po wyzdrowieniu myszy i ponownie drugiego dnia. Udana operacja przeszczepu zostanie potwierdzona, jeśli w drugim dniu nie zaobserwuje się dysfunkcji kończyn tylnych u myszy biorców.
24. Podawać myszom biorcy ketoprofen w wodzie pitnej (5 mg/kg/d = 27 ug/ml w wodzie pitnej) przez 48 godzin. Jeśli którakolwiek z myszy biorców cierpi z powodu bólu, którego nie złagodziły pooperacyjne leki przeciwbólowe, o czym świadczy utrata mobilności, brak pielęgnacji, nieprawidłowa postawa itp., zostaną poddane eutanazji. Zwierzęta zostaną poddane eutanazji w określonych punktach końcowych po 1-60 dniach.

Analiza przeszczepu

Przeszczepy tętnic w alloprzeszczepie zostały pobrane po 4 tygodniach, a przeszczepy w modelu przeszczepu syngenicznego były 6 tygodni po operacji (5 tygodni po infekcji wirusowej) i przeanalizowane za pomocą standardowych technik histologicznych dla barwienia Elastica-van Gieson (EVG), barwienia hematoksyliną i eozyną (HE) oraz barwienia immunofluorescencyjnego. Zdjęcia wykonano przy użyciu mikroskopu immunofluorescencyjnego (Zeiss). Liczenie komórek w jądrach otoczonych dodatnim barwieniem immunologicznym przeprowadzono w dużym powiększeniu i uśredniono z 5 przekrojów dla każdego przeszczepu. Pomiary powierzchni przeszczepu światła (w obrębie śródbłonka), błony wewnętrznej (między śródbłonkiem a wewnętrzną blaszką elastyczną, IEL), pożywki (między IEL a zewnętrzną blaszką elastyczną, EEL), grubości ścianki (między śródbłonkiem a zewnętrzną blaszką elastyczną) i całego naczynia (w obrębie EEL) obliczono na podstawie 5 szeregowych przekrojów poprzecznych w odległości 150 μm od siebie dla każdego przeszczepu, przy użyciu wspomaganej komputerowo analizy obrazu i obrazu NIH 1.60 (http://rsbweb.nih.gov/nih-image).

Analiza statystyczna

Wszystkie dane są wyrażone jako średnia ± SEM. Dwustronne, sparowane testy t oraz dwukierunkowa analiza ANOVA zostały przeprowadzone przy użyciu oprogramowania Prism (GraphPad Software). Różnice w stosunku do P<0,05 uznano za wskazujące na istotność statystyczną.

Wyniki

Model miażdżycy miażdżycy alloprzeszczepu u myszy (GA): W tym modelu, męska aorta dawcy jest przeszczepiana żeńskiemu biorcy, tak że gospodarz indukuje alloreaktywne odpowiedzi alloimmunologiczne za pośrednictwem limfocytów T przeciwko niewielkiemu antygenowi Y (specyficzny dla mężczyzn antygen zgodności tkankowej H-Y) wyrażony na przeszczepie ¹², a z kolei IFN-γ wytwarzany przez limfocyty T napędza proliferację VSMC ²⁰, jak obserwowano w innych modelach ^{przeszczepu allogeniczn...}

Dyskusja

Opisane protokoły koncentrują się na mysich modelach GA. Procedury te mogą być stosowane do innych modeli przeszczepów przeszczepów. Modele te obejmują humanizowany ksenoprzeszczep (tj. ludzkie segmenty tętnicy wieńcowej umieszczone w aorcie podnerkowej myszy z niedoborem odporności) oraz mysi model GA z ostrym odrzuceniem (tj. aorta myszy z jednego szczepu genetycznego do innego biorcy szczepu genetycznego). Opisane przez nas modele myszy są bardziej zbliżone do zamykania zmian w ludzkim GA na. Pierwsz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C57BL / 6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Dawca (5 tygodni) < br / > Biorca (8-12 tygodni)
Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Roztwór do przechowywania (50 mg / ml) Roztwór roboczy (5 mg / ml)
Sterylny roztwór ksylazyny	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Roztwór do przechowywania (100 mg / ml) Roztwór roboczy (1 mg / ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Roztwór do przechowywania (100 mg / ml) Roztwór roboczy - doustnie (0,027 mg / ml)
Heparyna Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Roztwór do przechowywania (1000 U / ml) Roztwór roboczy (100 U / ml)
Roztwór soli fizjologicznej (sterylne 0,9% Chlorek sodu)	CareFusion	AL4109
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	Aby przygotować znieczulającą
wazelinę Maść oftalmiczna	Dechra Produkty weterynaryjne	NDC 17033-211-38
Jodowe podkładki przygotowawcze	Triada jednorazowe, Inc.	NDC 50730-3201-1
Podkładki do przygotowywania alkoholu	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Mikroskop	Leica	MZ95
Mikronożyczki	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Nożyczki sprężynowe	FST	15009-08	Do transekcji aorty dawcy lub biorcy
Bardzo wąskie nożyczki	FST	14088-10
Uchwyt igły/kleszcze	MICRINS	MI1542	Do trzymania igły
Kleszcze drobne	FST	11254-20
Kleszcze	FST	11251-35
Kleszcze o standardowym wzorze	FST	11000-12
Kleszcze	FST	13011-12
LANCASTER Wziernik do oczu	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Klips do mikronaczyń krwionośnych	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Nakładanie kleszczy z zamkiem	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
poliamidowy szew monofilamentowy	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 szew, igła = 70 mikronów
monofilamentowy nylonowy szew	syneturowy (Covidien)	SN-1956	6-0 szew
włókninowy Songes	McKesson Corp.	Numer 94442000
Strzykawka		REF 309659
3 ml Strzykawka	BD	REF 309657
10 ml Strzykawka	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Igła podskórna	BD	REF 305196
25G 7/8, Igła podskórna	BD	REF 305124
27G 1/2, Igła podskórna	BD	REF 305109
30G 1/2, igła podskórna	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trymer	Wahl	9854-500
Tabela 2. Specjalne odczynniki i sprzęt.