Method Article

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

DOI:

10.3791/50303

⸱

June 17th, 2013

 ,  , 
1Department of Psychology, University of Cincinnati, 2Department of Neurology, University of Cincinnati

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czułe i wiarygodne wskaźniki wyników behawioralnych są niezbędne do oceny potencjalnych terapii w badaniach przedklinicznych dla wielu chorób neurodegeneracyjnych. W chorobie Parkinsona testy sensomotoryczne wrażliwe na różne stopnie dysfunkcji nigrostriatalnej mają zasadnicze znaczenie dla testowania skuteczności potencjalnych terapii. Istnieją niezawodne i dość eleganckie pomiary sensomotoryczne dla szczurów, jednak wiele z tych testów mierzy asymetrię sensomotoryczną u szczura i nie jest całkowicie odpowiednich dla nowszych genetycznych mysich modeli PD. Zebraliśmy zestaw testów sensomotorycznych inspirowanych czułymi testami przeprowadzanymi na szczurach i dostosowanych do potrzeb myszy. Bateria testowa wyróżniona w tym badaniu została wybrana ze względu na a) jej czułość w szerokiej gamie mysich modeli choroby Parkinsona, b) łatwość wdrożenia do badania oraz c) niski koszt. Testy te okazały się przydatne w charakteryzowaniu nowych mysich modeli genetycznych choroby Parkinsona, a także w testowaniu potencjalnych terapii modyfikujących przebieg choroby.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona (PD) jest wyniszczającym zaburzeniem neurodegeneracyjnym, charakteryzującym się przede wszystkim postępującą utratą neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej i rozwojem inkluzji ciał Lewy'ego w układach centralnych i obwodowych. Pacjenci cierpią na upośledzenia sensomotoryczne, w tym bradykinezję, drżenie, sztywność i niestabilność postawy, które pogarszają się z czasem. Chociaż choroba występuje rzadko, rodzinne formy choroby odkryte w ciągu ostatnich 15 lat doprowadziły do zidentyfikowania nowych, ważnych celów dla potencjalnych terapii modyfikujących przebieg choroby. Mutacje w genach kodujących m.in. alfa-synukleinę, parkinę, DJ-1, LRRK2 i ATP13A2 oznaczają rozwój nowej "generacji" zwierzęcych modeli PD, genetycznych modeli myszy.

Doskonałe środki behawioralne niewywołane lekami istnieją dla szeroko badanego jednostronnego modelu szczurzego 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) PD. Należą do nich testy na asymetrię używania kończyn, inicjację ruchu, zaniedbanie somatosensoryczne, zdolności dosięgania, a ostatnio wokalizacje ultradźwiękowe1-6. Testy te są wrażliwe na różne stopnie utraty neuronów dopaminowych nigrostriatal i są szeroko stosowane do oceny skuteczności różnych rodzajów potencjalnych terapii7-11. Jednak w przypadku genetycznych modeli myszy nie ma jasnego konsensusu co do najlepszych testów sensomotorycznych do użycia lub ich liczby. Jest to problematyczne podczas charakteryzowania nowego genetycznego modelu myszy, w badaniach przedklinicznych i podczas prób porównań między modelami. W ciągu ostatniej dekady pracowaliśmy nad stworzeniem zestawu testów sensomotorycznych dla myszy, podobnych do tych, które z powodzeniem zastosowano u szczurów. Testy opisane w tym artykule zostały wykorzystane do scharakteryzowania wielu mysich modeli genetycznych PD i są obecnie wykorzystywane w badaniach przedklinicznych testujących nowe potencjalne terapie12.

Najczęstszymi testami używanymi do oceny funkcji motorycznych u myszy są aktywność na otwartym polu i test koordynacji Rotarod13. Chociaż oba te testy są zautomatyzowane, stosunkowo łatwe w użyciu i dostarczają informacji na temat funkcji sensomotorycznych, często brakuje im czułości potrzebnej do wykrycia subtelnych zmian w układzie dopaminowym nigrostriatalnym. Na przykład myszy z niedoborem parkiny z subtelnymi zmianami w funkcji dopaminy nie wykazują upośledzenia w rotarodzie, ale wykazują upośledzenie motoryczne w trudnym teście wiązki14. Ponadto myszy leczone umiarkowanymi dawkami neurotoksyny 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) nie wykazują upośledzenia rotarodu, ale mają znaczące zmiany w chodzie i upośledzenia w teście odwróconej siatki15. W związku z tym badania, w których do oceny fenotypowej wykorzystuje się wyłącznie rotarod, mogą pomijać bardziej subtelne upośledzenia. Optymalnym podejściem, naszym zdaniem, do charakterystyki behawioralnej jest takie, które obejmuje baterię testów, które są wrażliwe na różne aspekty funkcji czuciowych i motorycznych oraz subtelne zmiany w funkcji zwojów podstawy13-15. Tutaj opisujemy, jak mierzyć i analizować funkcje sensomotoryczne u myszy za pomocą trudnego testu przechodzenia wiązki, testu spontanicznej aktywności w cylindrze i testu reakcji na bodźce sensoryczne.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalnie myszy powinny być testowane podczas ich aktywnego (ciemnego) cyklu. Myszy w naszym laboratorium są utrzymywane w odwróconym cyklu światło/ciemność, co pozwala nam wygodnie testować myszy w ich aktywnym okresie (i naszym). Testowanie rozpoczyna się dopiero po upływie co najmniej jednej godziny od rozpoczęcia ciemnego cyklu. Jednak nie zawsze jest możliwe, aby badacz utrzymywał oddzielny pokój myszy z odwróconym cyklem światła. W takim przypadku wszystkie trzy testy można przeprowadzić podczas cyklu świetlnego, ale należy pamiętać, że czas przejścia przez belkę, liczba stopni i tyłów w cylindrze oraz czas kontaktu i usuwania mogą być dłuższe, gdy są testowane w tym czasie.

Wszystkie trzy opisane poniżej testy mogą być wykonane przez jednego eksperymentatora, ale dla tych, którzy nie są tak doświadczeni w obsłudze i pracy z myszami, lub mają niewielkie lub żadne doświadczenie w pomiarze zachowania u myszy, może być potrzebny dodatkowy eksperymentator. W takim przypadku drugi eksperymentator może pomóc w trudnym teście wiązki, umieszczając myszy na belce, podczas gdy drugi eksperymentator nagrywa próbę lub w teście usuwania kleju, drugi eksperymentator może uruchomić stoper, podczas gdy drugi umieszcza naklejkę na pysku i umieszcza mysz w klatce.

1. Trudna procedura pokonywania wiązki

  1. Odwróć 3 czyste klatki na myszy na blacie stołu lub w stacji wymiany klatek dla myszy. Wyrównaj klatki równomiernie, tak aby mogły utrzymać długość belki (1 metr).
  2. Zmontuj cztery sekcje belki od najszerszej do najwęższej sekcji i umieść na odwróconych klatkach dla myszy.
  3. Umieść klatkę domową myszy, które planujesz przetestować, na boku i na końcu belki tak, aby najwęższy koniec wiązki prowadził prosto do klatki domowej.
  4. Podnieś pierwszą mysz za podstawę ogona i podeprzyj jej tylne kończyny dłonią. Umieść mysz na szerokim końcu belki i puść jej ogon i zdejmij rękę.
  5. Pozwól myszy wąchać i poruszać się, aby lepiej zorientować się w urządzeniu - jeśli mysz się obróci, delikatnie przekieruj ją w żądanym kierunku.
  6. Podnieś klatkę domową (nawet jeśli mają w niej współwięźniów), trzymając ją w tej samej pozycji na boku i zbliż ją do myszy testowej. Gdy mysz testowa zacznie próbować wejść do klatki domowej, przesuń ją z powrotem, aby mysz nie wchodziła, ale robiła krok do przodu. Kontynuuj to aż do zejścia z belki. Na koniec pozwól myszy wejść do klatki domowej. Wykonaj tę samą procedurę dla każdej myszy w klatce. Jest to pierwsze badanie "wspomagane".
  7. Belka powinna być dokładnie oczyszczona między klatkami środkiem dezynfekującym dostarczonym przez personel opieki nad zwierzętami lub weterynarzem. W klatce ważne jest, aby usunąć mocz lub granulki kału z belki przed uruchomieniem następnej myszy, ponieważ odwróci to uwagę następnej myszy.
  8. Gdy wszystkie myszy w klatce przejdą jedną próbę z asystą, ponownie podnieś pierwszą mysz i umieść ją na szerokim końcu belki. W razie potrzeby delikatnie skieruj mysz ręką w żądanym kierunku i delikatnie dotknij jej grzbietu, aby zachęcić ją do poruszania się wzdłuż belki do klatki domowej. Jeśli mysz zatrzyma się, aby powąchać lub zejść z belki, popraw mysz ręką lub podnieś ją i umieść w tej samej sekcji, w której odeszła. Trzymaj rękę w pobliżu, aby poprowadzić mysz do końca belki. Chcesz spróbować zminimalizować zatrzymywanie się myszy i eksplorację podczas korzystania z belki. Im częściej odbywa się to podczas treningu, tym mniej mysz ma tendencję do robienia tego podczas testów.
  9. Próba kończy się, gdy mysz umieści jedną ze swoich przednich kończyn w klatce domowej. Następna mysz może następnie otrzymać swojądrugą próbę. Myszy otrzymują w sumie 5 prób w pierwszym dniu treningu, naprzemiennie na myszach, tak aby każda mysz miała interwał międzypróbny ~ 30 sekund lub więcej. Zazwyczaj w ciągu ostatnich kilku prób myszy samodzielnie przemierzają długość belki, bez potrzeby korygowania.
  10. 24 godziny później można rozpocząć 2 dzień szkolenia. W dniu 2 myszy otrzymują 5 kolejnych prób na tym samym ustawieniu wiązki, co w dniu 1. Myszy nie powinny potrzebować żadnej pomocy, ale mogą wymagać korekty lub dotknięcia z tyłu, aby zapobiec zatrzymywaniu się lub eksploracji.
  11. 24 godziny później może rozpocząć się właściwy dzień testu. Na dzień testowy belka jest ustawiana w podobny sposób, jak w poprzednich 2 dniach treningowych. Jednak teraz siatka odpowiadająca każdej szerokości belki jest umieszczana na górze każdego przekroju belki. Kamera wideo służy do rejestrowania wszystkich prób przejścia wiązki i może być wykonywana przez jednego lub wielu eksperymentatorów.
  12. Oznacz kartę niezbędnymi informacjami o eksperymencie (data, mysz #, próba # itp.). Umieść tę kartę przed kamerą i nagrywaj przez 2-3 sekundy, aby było jasne, która mysz jest testowana i na jakiej próbie się znajduje.
  13. Mysz jest umieszczana na powierzchni siatki w najszerszym odcinku belki i rejestrowana podczas ruchu wzdłuż belki. Nagranie powinno być na tyle blisko, aby cała długość korpusu myszy była widoczna w aparacie. Jeśli jest za daleko, poślizgnięcia są trudne do zauważenia, a jeśli jest zbyt blisko, ruchy kończyn mogą zostać pominięte. Kamera powinna być ustawiona tak, aby siatka znajdowała się pośrodku przeglądarki.
  14. W dniu testu wszystkie myszy otrzymują 5 prób na belce o powierzchni siatki.

2. Analiza obrazu z belki

  1. Filmy można oglądać bezpośrednio z kamery lub podłączyć do telewizora lub komputera, aby uzyskać większy widok ekranu. Kasety wideo powinny być oceniane przez eksperymentatora ślepego na genotyp i warunki leczenia w ramach eksperymentu.
  2. Błędy w każdej próbie są oceniane, gdy wideo jest odtwarzane w zwolnionym tempie. Poślizgi lub błędy są liczone, gdy mysz jest skierowana i porusza się do przodu. Poślizgnięcie się przez siatkę lub na zewnątrz siatki jest uważane za błąd, gdy kończyna ześlizguje się poza 0,5 cm poniżej powierzchni siatki (w połowie). Wszelkie poślizgnięcia popełnione po zatrzymaniu myszy lub ustawieniu głowy na bok nie są uważane za błędy. Jeśli mysz nie porusza się do przodu, a kończyna lub kończyny wielokrotnie prześlizgują się przez siatkę, NIE jest to uważane za błąd. Na wąskim odcinku belki podstawa tylnych kończyn może znajdować się na siatce, a palce u nóg zwisać z boku, nie jest to uważane za błąd.
  3. Kroki są również liczone w zwolnionym tempie. Tylna kończyna skierowana w stronę kamery służy do śledzenia liczby kroków. Liczenie rozpoczyna się, gdy mysz zrobi pierwszy krok do przodu, a kończy, gdy mysz umieści przednią kończynę w klatce domowej.
  4. Czas do pokonania jest mierzony za pomocą stopera i odbywa się w czasie rzeczywistym. Odliczanie czasu rozpoczyna się, gdy mysz zaczyna poruszać się do przodu i kończy się, gdy pierwsza przednia łapa zostanie umieszczona w klatce domowej.

3. Spontaniczna aktywność w procedurze cylindrycznej

  1. Odwróć 3 czyste klatki na myszy na blacie stołu lub w stacji wymiany klatek dla myszy. Ustaw dwie klatki obok siebie w odległości ~18 cm od siebie tak, aby przód klatek był skierowany w stronę eksperymentatora. Pozostała klatka jest umieszczona za pozostałymi dwiema klatkami i posłuży do podparcia lustra.
  2. Umieść kawałek szkła na 2 klatkach i ustaw go tak, aby szkło było podtrzymywane przez zewnętrzną krawędź pierwszych 2 klatek.
  3. Umieść cylinder na górze szkła, a lustro pod kątem pod szkłem, opierając się o 3. klatkę z tyłu. Kąt może wynosić od 30 ° do 45 °, ale co ważniejsze, widok z lustra musi obejmować pełną średnicę cylindra.
  4. Ustaw kamerę wideo przed lustrem i wyreguluj zarówno lustro, jak i kamerę wideo, aż będziesz mógł view cała średnica dna cylindra.
  5. Ustaw minutnik na 3 minuty i oznacz kartę ważnymi szczegółami eksperymentu (data, mysz# itp.). Nagrywaj etykietę przez 2-3 sekundy.
  6. Umieść mysz w cylindrze i naciśnij przycisk nagrywania i timera. Nagrywaj mysz przez trzy minuty. Ważne jest, aby obszar testowy był cichy, ponieważ głośne dźwięki i rozmowy mogą rozpraszać mysz i potencjalnie powodować zawieszanie się.
  7. W ciągu 3 minut użyj licznika ręcznego, aby policzyć, ile tylnych ruchów wykonuje mysz w cylindrze. Tył definiuje się jako ruch pionowy, w którym obie przednie kończyny znajdują się nad podłogą, tak że mysz stoi tylko na tylnych kończynach. Po upływie 3 minut wyjmij mysz i umieść ją z powrotem w klatce domowej.
  8. Wyczyść cylinder i szybę środkiem dezynfekującym dostarczonym przez personel opieki nad zwierzętami lub weterynarza. Poczekaj, aż roztwór czyszczący wyschnie przed umieszczeniem następnej myszy w cylindrze.

4. Analiza spontanicznej aktywności

  1. Filmy można oglądać bezpośrednio z kamery lub podłączyć do telewizora lub komputera, aby uzyskać większy widok ekranu. Kasety wideo powinny być oceniane przez eksperymentatora ślepego na genotyp i warunki leczenia w ramach eksperymentu.
  2. Kroki kończyn przednich są liczone, gdy wideo jest odtwarzane w zwolnionym tempie. Krok kończyny przedniej jest liczony, gdy zwierzę przesuwa kolejno obie kończyny przednie po podłodze cylindra jednym kolejnym ruchem. Ruch kończyn przednich nie jest liczony, jeżeli czas między ruchem jednej kończyny przedniej a drugą kończyną przednią jest dłuższy niż 5 sekund. Kroki kończyn tylnych są liczone w taki sam sposób jak kroki kończyn przednich.
  3. Czas spędzony na pielęgnacji jest mierzony za pomocą stopera i odtwarzania wideo w czasie rzeczywistym. Mierzone są napady pielęgnacyjne na pysku, wibrysach i tułowiu.

5. Usuwanie kleju

  1. Umieść mysz w jej klatce domowej w pomieszczeniu testowym lub w stacji wymiany klatki dla myszy.
  2. Wyjmij pojemnik na karmnik z klatki i załóż pokrywę klatki. Pozwól myszom/myszom przyzwyczaić się do pomieszczenia testowego i klatki bez karmnika przez 1 godzinę.
  3. Do testowania użyj czystej klatki, aby umieścić kolegów z klatki, tak aby mysz testowa była jedyną w klatce domowej. Usuń ~3/4 ściółki i umieść ją w czystej klatce ze współwięźniami.
  4. W klatce domowej zakarkuj mysz testową, aby ją unieruchomić i za pomocą pary małych kleszczyków umieść jedną etykietę samoprzylepną na pysku myszy. Delikatnie dociśnij kleszczem etykietę na pysku i zwolnij mysz. Umieść pokrywę na klatce i uruchom stoper. Gdy mysz podejmie próbę usunięcia etykiety przednimi łapami, zapisz czas. Jeśli mysz nawiąże kontakt, ale nie usunie etykiety, utrzymuj stoper włączony, aż ją usunie i również zarejestruj ten czas (czas kontaktu i usuwania).
  5. Jeśli mysz nie dotknie lub nie usunie naklejki w ciągu 60 sekund, próba zostanie zakończona, a naklejka zostanie usunięta ręcznie przez eksperymentatora.
  6. Umieść mysz testową w czystej klatce i wyjmij następną mysz, a następnie umieść ją w klatce domowej i rozpocznij testowanie. Wszystkie myszy otrzymują 3 próby. Ważne jest, aby naprzemiennie przechodzić między myszami, zamiast wykonywać wszystkie trzy próby na myszy w tym samym czasie. Próby, w których etykieta odpada lub nie jest zabezpieczona na pysku, nie są brane pod uwagę.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wymagająca wiązka, spontaniczna aktywność w cylindrze i testy usuwania kleju są bardzo użytecznymi testami funkcji sensomotorycznych u myszy. Znaleźliśmy zmiany w funkcjach sensomotorycznych za pomocą tych testów w wielu genetycznych i toksycznych mysich modelach choroby Parkinsona, w tym nokaut parkiny, parkina Q311X, Pitx3-aphakia, nadekspresja alfa-synukleiny i jednostronna 6-hydroksydopaminamyszy 14, 16-19. Tutaj pokazujemy dane zebrane od myszy z nadekspresją ludzkiej alfa-synukleiny typu dzikiego pod promotorem Thy1 (Thy1-aSyn) i myszy Pitx3-aphakia 18,20. Na wymagającej wiązce niezawodnie wykrywamy zwiększone błędy na krok w Thy1-aSyn w porównaniu z myszami typu dzikiego (Rysunek 1). W tej samej linii myszy wielokrotnie wykrywamy również znaczny spadek wchodzenia kończyn tylnych w cylinder (ryc. 2) 12, 16, 21. W teście usuwania kleju myszy Pitx3-aphakia z głębokim spadkiem neuronów dopaminowych nigrostriatal wykazują znacznie wydłużony czas kontaktu w porównaniu z kontrolami typu dzikiego (ryc. 3).

figure-results-1
Rysunek 1. Błędy w prowokacji w Wildtype (n=13) i Thy1-aSyn (n=4) w wieku 4 miesięcy. A) Błędy na krok, średnia z pięciu prób. B) Średnie błędy dla każdej szerokości belki. ** reprezentuje odpowiednio p<0,01 w porównaniu z myszami typu dzikiego. Test t-Studenta.

figure-results-2
Rysunek 2. Wchodzenie tylnej kończyny do cylindra u myszy typu dzikiego (n = 13) i Thy1-aSyn (n = 4) w wieku 4 miesięcy. * reprezentuje p<0,05 w porównaniu do Wildtype. Test t-Studenta.

figure-results-3
Rysunek 3. Czas kontaktu u myszy typu dzikiego (n = 10) i Pitx3-aphakia (n = 12) w wieku 4 tygodni. ** reprezentuje p<0,01 w porównaniu do Wildtype. Mann-Whitney U.

test Parametry Opcje analizy Wymagająca belka Błędy Szerokości belki (tylko błędy)
Średnia z 5 prób
Próby indywidualne Godzina Kroki Spontaniczna aktywność Kroki kończyn przednich średnia
stosunek kończyn przednich do tylnych Kroki kończyn tylnych Wychowuje znaczyć Czas pielęgnacji znaczyć Usuwanie kleju Czas kontaktu Średnia
Mediana
Najlepszy/Najgorszy wynik
Czas usuwania Wynik czasu kontaktu Czas usuwania

Tabela 1. Bateria testowa funkcji sensomotorycznych: opcje analizy.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu pokazujemy, jak wykonać i przeanalizować trzy przydatne testy funkcji sensomotorycznych u myszy. Należą do nich wymagająca wiązka, spontaniczna aktywność cylindra i reakcja na bodźce sensoryczne (usuwanie kleju). Testy te zostały wybrane z następujących powodów: 1) my i inni stwierdziliśmy, że są one bardzo wrażliwe na różne stopnie nigrostriatalnej dysfunkcji dopaminergicznej w genetycznych modelach myszy14,16-18, 2) wymagany jest tylko krótki trening wiązki i obsługi w zakresie reakcji na testy bodźców sensorycznych, a po przeszkoleniu testy można przeprowadzić w jednej sesji testowej, oraz 3) cena sprzętu potrzebnego do przeprowadzenia testów jest dość niska w porównaniu z zakupem bardziej zautomatyzowanego sprzętu, takiego jak komory Rotarod i Field Room.

Wymagający test wiązki jest nie tylko przydatny w wykrywaniu deficytów zdolności motorycznej i koordynacji w genetycznych mysich modelach PD, ale jest również przydatny w odkrywaniu upośledzeń u myszy leczonych 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyną i 6-hydroksydopaminą oraz myszy z niedoborem noradrenaliny19, 23-25. Ponadto stwierdzamy, że ciężar ciała ma mniejszy wpływ na wymagającą belkę w porównaniu z innymi testami sprawności motorycznej i koordynacji (test rotarodu i tyczki). Jest to szczególnie korzystne podczas pracy ze starszymi samcami myszy, które mogą ważyć do 50+ gramów. Podobnie jak w przypadku wiązki, zmiany w spontanicznej aktywności są wiarygodnie obserwowane u myszy z nokautem parkiny, PQ311X, Thy1-aSyn, Pitx3-aphakia i LRRK214, 16-18, 26. Test usuwania kleju jest również wrażliwy na manipulacje genetyczne, w tym mutacje nokautujące parkinę, parkinę Q311X, Thy1-aSyn i DJ-1 u myszy14,16, 17, 22. U myszy jednostronnie leczonej 6-hydroksydopaminą test usuwania kleju przeprowadza się w sposób podobny do tego, jak zwykle wykonuje się go u szczurów1,2. Etykietę samoprzylepną umieszcza się na każdej przedniej łapie za pomocą kleszcza i rejestruje się czas usunięcia etykiety. Odkryliśmy, że myszy leczone 6-hyrdoksydopaminą usuną etykietę z niedotkniętej kończyny przed usunięciem etykiety z dotkniętej kończyny 19.

Ta bateria testowa jest łatwa do wdrożenia w badaniach starzenia się przy użyciu przewlekłych metod leczenia, ale jest również łatwa w użyciu w badaniach farmakologicznych. Gdy zwierzęta zostaną przeszkolone i będą gotowe do testowania, można utworzyć stację testową dla każdego testu. Zwierzęta są następnie uruchamiane w tej samej kolejności w każdym teście. Interesujący lek może być podawany, a po osiągnięciu pożądanego stężenia szczytowego leku każda mysz może być testowana na belce, a następnie przenoszona do cylindra na trzy minuty, a następnie do testu usuwania kleju. Odkryliśmy, że ta strategia działa dobrze podczas testowania różnych agonistów dopaminy u myszy18, 21. Zarówno testy usuwania wiązki, jak i kleju są podatne na wielokrotne testy, jednak wielokrotne testy wpływają na spontaniczną aktywność cylindra, co skutkuje zmniejszoną aktywnością w czasie16. W zależności od tego, jak duży jest deficyt myszy, nadal możesz być w stanie wykryć różnice przy wielokrotnych testach w cylindrze16. Ogólnie rzecz biorąc, habituację i zmniejszoną aktywność obserwuje się już po drugiej ekspozycji na cylinder, jednak okazuje się, że możemy uzyskać wystarczający poziom aktywności, gdy przeprowadzimy test spontanicznej aktywności natychmiast po przejściu wiązki w badaniach farmakologicznych18,21. Liczba spontanicznych sesji testowania aktywności, które należy uwzględnić w badaniu, będzie zależała od szczepu myszy (niektóre są zdecydowanie bardziej aktywne niż inne) i czasu trwania leczenia. W naszych badaniach farmakologicznych na myszach na mieszanym tle C57BL / 6 X DBA mierzyliśmy aktywność od 2 do 4 razy, a sesje testowe były oddzielone od siebie o jeden tydzień21.

Testy wiązki i cylindra wymagają analizy zachowań nagranych na wideo po ich przeprowadzeniu. Dla tego aspektu analizy szczególnie ważne jest, aby oceniający byli ślepi na warunki doświadczalne. Kiedy szkolimy nowych oceniających w laboratorium, mamy do dyspozycji ocenę zachowania danej osoby na taśmach wideo, które zostały wcześniej przeanalizowane przez eksperta oceniającego z laboratorium. Kryteria są wyjaśniane i pokazywane nowemu oceniającemu, a następnie osoba ta zaczyna samodzielnie oceniać wcześniej analizowane taśmy. Wyniki są następnie porównywane z ocenami eksperta. Osoba nie może oceniać nowych danych, dopóki nie osiągną one 95-98% dokładności eksperta. Wszystkie dane są następnie wyrywkowo sprawdzane pod kątem dokładności przez eksperta oceniającego.

Bateria testów opisanych w tym badaniu ma na celu ocenę funkcji sensomotorycznych u myszy. Jednak za każdym razem, gdy charakteryzowany jest nowy mysi model choroby, zawsze ważne jest, aby przeprowadzić również podstawowe badanie zwierzęcia. Masa ciała i temperatura powinny być monitorowane podczas testów i należy odnotować wszelkie nietypowe zachowania, takie jak usuwanie wibrysów lub zaciskanie tylnych kończyn po podniesieniu przez ogon. Podstawowe oceny neurologiczne są szczegółowo opisane w innym miejscu27-29.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest finansowana przez NIH/NINDS NS07722-01 oraz Gardner Family Center for Parkinson's Disease and Movement Disorders.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Wymagający aparatbelkowy Starks PlasticsSegment 1= 3,5 cm
Segment 2= 2,5 cm
Segment 3= 1,5 cm
Segment 4= 0,5 cm		Informacje kontaktowe:
11276 Sebring Dr.
Forest Park, OH 45240 USA
Ph +1 (513) 541-4591
Faks +1 (513) 541-6773
CylinderStarks Plasticso średnicy 15,5 cm
12,7 cm wysokości		Informacje kontaktowe:
11276 Sebring Dr.
Forest Park, OH 45240 USA
Ph +1 (513) 541-4591
Faks +1 (513) 541-6773
Siatka siatkowaOkablowanie Ace Hardware1 cm2
Klatki na myszyAncare19 x 29 x 12,7 cm
GlassAce Hardware19 cm2
MirrorAce Hardware18 x Kamera 13 cm
Sony HDR-HC9
MiniDV TaśmySony DVC premium90 min długiego odtwarzania
EtykietyAveryColor Coding Etykietyśrednicy 6,35 mm (1/4" okrągłe)
o

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schallert, T., Upchurch, M., et al. Tactile extinction: distinguishing between sensorimotor and motor asymmetries in rats with unilateral nigrostriatal damage. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 16 (3), 455-462 (1982).
  2. Schallert, T., Upchurch, M., Wilcox, R. E., Vaughn, D. M. Posture-independent sensorimotor analysis of inter-hemispheric receptor asymmetries in neostriatum. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 18 (5), 753-759 (1983).
  3. Schallert, T., Norton, D., Jones, T. A. A clinically relevant unilateral rat model of parkinsonian akinesia. Journal of Neural Transplantation and Plasticity. 3 (4), 332-333 (1992).
  4. Schallert, T., Tillerson, J. L. Intervention strategies for degeneration of DA neurons in parkinsonism: Optimizing behavioral assessment of outcome. Central Nervous System Diseases. Emerich, D. F., Dean, R. L. III, Sandberg, P. R. , Humana Press. Totowa, New Jersey, USA. 131-151 (2000).
  5. Whishaw, I. Q., O'Connor, W. T., Dunnett, S. B. The contributions of motor cortex, nigrostriatal dopamine and caudate-putamen to skilled forelimb use in the rat. Brain. 109 (5), 805-843 (1986).
  6. Johnson, A. M., Doll, E. J., Grant, L. M., Ringel, L., Shier, J. N., Ciucci, M. R. Targeted training of ultrasonic vocalizations in aged and Parkinsonian rats. J. Vis. Exp. (54), e2835(2011).
  7. Connor, B., Kozlowski, D. A., Schallert, T., Tillerson, J. L., Davidson, B. L., Bohn, M. C. Differential effects of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the striatum and substantia nigra of the aged Parkinsonian rat. Gene Therapy. 6 (12), 1936-1951 (1999).
  8. Kozlowski, D. A., Connor, B., Tillerson, J. L., Schallert, T., Bohn, M. C. Delivery of a GDNF gene into the substantia nigra after a progressive 6-OHDA lesion maintains functional nigrostriatal connections. Experimental Neurology. 166 (1), 1-15 (2000).
  9. Yang, M., Stull, N. D., Berk, M. A., Snyder, E. Y., Iacovitti, L. Neural stem cells spontaneously express dopaminergic traits after transplantation into the intact or 6-hydroxydopamine-lesioned rat. Experimental Neurology. 177 (1), 50-60 (2002).
  10. Luo, J., Kaplitt, M. G., et al. Subthalamic GAD gene therapy in a Parkinson's disease rat model. Science. 298 (5592), 425-429 (2002).
  11. Yasuhara, T., Matsukawa, N., et al. Transplantation of human neural stem cells exerts neuroprotection in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12497-12511 (2006).
  12. Fleming, S. M., Mulligan, C. K., et al. A pilot trial of the microtubule-interacting peptide (NAP) in mice overexpressing alpha-synuclein shows improvement in motor function and reduction of alpha-synuclein inclusions. Journal of Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (3), 597-606 (2011).
  13. Sedelis, M., Schwarting, R. K. W., Huston, J. P. Behavioral phenotyping of the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 109-125 (2001).
  14. Goldberg, M. S., Fleming, S. M., et al. Parkin-deficient mice exhibit nigrostriatal deficits but not loss of dopaminergic neurons. Journal of Biological Chemistry. 278 (44), 43628-43635 (1074).
  15. Tillerson, J. L., Caudle, W. M., Reveron, M. E., Miller, G. W. Detection of behavioral impairments correlated to neurochemical deficits in mice treated with moderate doses of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Experimental Neurology. 178 (1), 80-90 (2002).
  16. Fleming, S. M., Salcedo, J., et al. Early and progressive sensorimotor abnormalities in mice overexpressing wild-type human alpha-synuclein. Journal of Neuroscience. 24 (42), 9434-9440 (2004).
  17. Lu, X. H., Fleming, S. M., et al. Bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing a truncated mutant parkin exhibit age-dependent hypokinetic motor deficits, dopaminergic neuron degeneration, and accumulation of proteinase K-resistant alpha-synuclein. Journal of Neuroscience. 29 (7), 1962-1976 (2009).
  18. Hwang, D. Y., Fleming, S. M., et al. 3,4-Dihydroxyphenylalanine reverses the motor deficits in Pitx3-deficient aphakia mice: Behavioral characterization of a novel genetic model of Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 25 (8), 2132-2137 (2005).
  19. Glajch, K. E., Fleming, S. M., Surmeier, D. J., Osten, P. Sensorimotor assessment of the unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Behavioural Brain Research. 230 (2), 309-316 (2012).
  20. Rockenstein, E., Mallory, M., et al. Differential neuropathological alterations in transgenic mice expressing a-synuclein from the platelet-derived growth factor and Thy-1 promoters. Journal of Neuroscience Research. 68 (5), 568-578 (2002).
  21. Fleming, S. M., Salcedo, J., et al. Behavioral effects of dopaminergic agonists in transgenic mice overexpressing human wildtype a-synuclein. Neuroscience. 142 (4), 1245-1253 (2006).
  22. Chen, L., Cagniard, B., et al. Age-dependent motor deficits and dopaminergic dysfunction in DJ-1 null mice. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21418-21426 (2005).
  23. Pothakos, K., Kurz, M. J., Lau, Y. S. Restorative effect of endurance exercise on behavioral deficits in the chronic mouse model of Parkinson's disease with severe neurodegeneration. BMC Neuroscience. 10 (6), (2009).
  24. Patki, G., Che, Y., Lau, Y. S. Mitochondrial dysfunction in the striatum of aged chronic mouse model of Parkinson's disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 1 (3), (2009).
  25. Rommelfanger, K. S., Edwards, G. L., Freeman, K. G., Liles, L. C., Miller, G. W., Weinshenker, D. Norepinephrine loss produces more profound motor deficits than MPTP treatment in mice. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America. 104 (34), 13804-13809 (2007).
  26. Li, Y., Liu, W., et al. Mutant LRRK2(R1441G) BAC transgenic mice recapitulate cardinal features of Parkinson's disease. Nature Neuroscience. 12 (7), 826-828 (2009).
  27. Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley & Sons, Inc. New York, New York, USA. (2000).
  28. Crawley, J. N., Paylor, R. A proposed test battery and constellations of specific behavioral paradigms to investigate the behavioral phenotypes of transgenic and knockout mice. Hormones and Behavior. 31 (3), 197-211 (1997).
  29. Fernagut, P. O., Chalon, S., Diguet, E., Guilloteau, D., Tison, F., Jaber, M. Motor behaviour deficits and their histopathological and functional correlates in the nigrostriatal system of dopamine transporter knockout mice. Neuroscience. 116 (4), 1123-1130 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sensorimotor FunctionMouse ModelsParkinson s DiseaseBeam Traversal TestSpontaneous Activity TestAdhesive Removal TestCylinder TestChallenging BeamAlpha Synuclein MicePITX3 Mice

Related Articles