Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

18.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50317

⸱

7 maja 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

W tym artykule

Podsumowanie

Ładowanie barwnikiem indukowane przez esterazy celowane (TED) wspiera analizę dynamiki wewnątrzkomórkowego magazynowania wapnia za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda opiera się na ukierunkowaniu rekombinowanej karboksylesterazy na retikulum endoplazmatyczne (ER), gdzie poprawia miejscowe demaskowanie syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca2+ o niskim powinowactwie w świetle ER.

Streszczenie

Wizualizacja dynamiki wapnia jest ważna dla zrozumienia roli wapnia w fizjologii komórki. Aby zbadać dynamikę wapnia, popularne stały się syntetyczne fluorescencyjne wskaźniki Ca2 +. Tutaj pokazujemy TED (= ładowanie barwnikiem indukowane przez celowaną esterazyzę), metodę poprawy uwalniania barwników wskaźnikowych Ca2 + w świetle ER różnych typów komórek. Do tej pory TED był stosowany w liniach komórkowych, komórkach glejowych i neuronach in vitro. TED opiera się na skutecznym, rekombinowanym kierowaniu wysokiej aktywności karboksyloesterazy do światła ER przy użyciu konstruktów wektorowych eksprymujących karboksylesterazy (CES). Najnowsze wektory TED zawierają rdzeń CES2 połączony z białkiem czerwonej fluorescencji, umożliwiając w ten sposób jednoczesne obrazowanie dwukolorowe. Dynamika wolnego wapnia w ER jest obrazowana w jednym kolorze, podczas gdy odpowiednia struktura ER jest wyświetlana na czerwono. Na początku zabiegu komórki są transdukowane lentiwirusem. Następnie zainfekowane komórki są umieszczane na szkiełkach nakrywkowych, aby ostatecznie umożliwić obrazowanie żywych komórek. Następnie żywe komórki są inkubowane z estrem acetoksymetylowym (ester AM) wskaźników Ca2+ o niskim powinowactwie, na przykład Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM lub Mag-Fura2-AM. Aktywność esterazy w ER odcina hydrofobowe łańcuchy boczne od formy AM wskaźnika Ca2 + i powstaje hydrofilowy kompleks barwnik fluorescencyjny / Ca2 + i jest uwięziony w świetle ER. Po załadowaniu barwnikiem komórki są analizowane w odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Komórki są w sposób ciągły perfundowane roztworami podobnymi do Ringera, a dynamika wapnia w ER jest bezpośrednio wizualizowana za pomocą obrazowania poklatkowego. Uwalnianie wapnia z ER identyfikuje się jako spadek intensywności fluorescencji w obszarach zainteresowania, podczas gdy ponowne napełnienie magazynu wapnia ER powoduje wzrost intensywności fluorescencji. Wreszcie, zmianę intensywności fluorescencji w czasie określa się za pomocą obliczeń ΔF/F0.

Wprowadzenie

Aby rozwiązać fizjologiczne reakcje wapniowe ER, opracowaliśmy nową strategię, aby poprawić wychwytywanie syntetycznych barwników wrażliwych na wapń w ER. Metoda ta umożliwia bezpośrednie, niezakłócające monitorowanie w czasie rzeczywistym wolnego wapnia ER w obecności wapnia zewnątrzkomórkowego.

Funkcja i sygnalizacja ER Calcium

Sygnały wapniowe znajdują się w różnych typach komórek, np. komórkach mięśniowych, neuronach i komórkach glejowych, a ich funkcje wahają się od pośredniczenia w skurczu mięśni do udziału w transmisji synaptycznej w uczeniu się i pamięci 1,2. Zmiany w stężeniu wolnego wapnia są przedmiotem dużego zainteresowania naukowego, ponieważ wapń bierze udział w regulacji transkrypcji genów, proliferacji komórek, pobudliwości neuronów, śmierci komórki i innych zdarzeń sygnalizacji komórkowej 1-7. Wszystkie te komórkowe sygnały wapniowe są funkcjonalnie połączone i przyczyniają się do wewnątrzkomórkowej dynamiki magazynowania wapnia 8-10.

Wspólną cechą wszystkich sygnałów wapniowych jest przepływ wapnia między przestrzenią zewnątrzkomórkową, cytozolem i organellami, głównie ER i mitochondriami. Powoduje to dynamiczne zmiany stężenia wapnia w tych organellach, które są wyczuwane przez różne składniki sygnalizacyjne. Ogólnie rzecz biorąc, stężenie wapnia w ER waha się od 100 do 800 μM, w cytozolu stężenie wapnia jest bliskie 100 nM, aw przestrzeni zewnątrzkomórkowej stężenie wynosi około 1-2 mM. W związku z tym istnieje duża chemiczna siła napędowa przepływu wapnia w kierunku cytozolu 2,9,10.

Najczęściej badane sygnały wapniowe pochodzące z ER zależą od stymulacji receptorów sprzężonych z białkiem G (GpcR), które następnie aktywują fosfolipazę C (PLC). PLC z kolei wytwarza 1,4,5-trifosforan inozytolu (IP3) 1. Po związaniu IP3 z jego receptorem (IP3-Rec, ryc. 1) w błonie ER, jony wapnia są uwalniane ze światła ER. Historycznie rzecz biorąc, uwalnianie wapnia z ER za pośrednictwem IP3 zostało po raz pierwszy - choć pośrednio - zmierzone w zrazikowanych komórkach trzustki przez Streba i wsp. w 1983 r. 11. Publikacja ta po raz pierwszy zasugerowała kaskadę sygnalizacyjną obejmującą acetylocholinę, fosfolipazę C i IP3. Ten sposób uwalniania wapnia jest ogólnie określany jako uwalnianie wapnia indukowane przez IP3 (IiCR) (ryc. 1). Zależna od kinazy aktywacja fosfolipazy Cγ przez receptorowe kinazy tyrozynowe łączy działanie czynników wzrostu i czynników neurotroficznych z sygnalizacją wapnia ER po podniesieniu IP3 12. Oprócz IiCR, w podwyższeniu stężenia wapnia może pośredniczyć jonotropowe wnikanie wapnia, na przykład przez kanały wapniowe bramkowane napięciem (CaV), a następnie indukowane wapniem uwalnianie wapnia (CiCR) przez receptory ryanodyny (RyR). IiCR i CiCR są fizjologicznie związane z wprowadzaniem wapnia przez magazyn (SOCE). SOCE obejmuje działanie STIM (cząsteczki oddziałującej ze zrębem), która jest czujnikiem uwalniania wapnia przez ER. Wykazano, że STIM stymuluje zewnątrzkomórkowe wnikanie wapnia przez przejściowe kanały potencjału receptora (Trp) 13, kanały wapniowe Orai 14, a nawet kanały wapniowe bramkowane napięciem 15 (ryc. 1). Utrata wapnia ER jest dynamicznie ratowana przez działanie ATPazy wapniowej retikulum sarko-endoplazmatycznego (SERCA), która aktywnie pompuje wapń z powrotem do ER. Zablokowanie SERCA za pomocą leków, takich jak thapsigargina, ujawnia ciągłą utratę wapnia ER do kompartmentu cytozolowego. Ten "wyciek" wapnia ER jest spowodowany przez wewnątrzbłonowe kompleksy porowe ER, takie jak kompleks białkowy Sec61 16,17 (ryc. 1).

W 1998 roku Berridge opublikował model "neuron w modelu neuronu", który sugeruje zasadniczą fizjologiczną rolę ER w integracji neuronalnego wapnia 5. Model ten uwzględnia istnienie ciągłego systemu błon ER tworzącego wewnątrzkomórkowy "obraz" błony plazmatycznej neuronów 5. Twierdzono, że ten binarny system błon eukariotycznych jest podstawowym warunkiem wstępnym czasowej i przestrzennej integracji szybkich i wolnych sygnałów wapniowych w neuronach. Sygnały wapniowe, które występują jednocześnie lub później w różnych kolcach lub dendrytach tego samego neuronu, są przekazywane do somy lub jądra komórki za pośrednictwem ER, gdzie są sumowane 5,18. Wówczas ich suma może mieć wpływ na pobudliwość neuronu, regulację transkrypcji genów czy integrację kaskad sygnałowych. W ten sposób ER wspiera integrację sygnałów wapniowych. Jednym z warunków wstępnych tej koncepcji jest ciągłość ER w pojedynczej komórce, co zostało stwierdzone w kilku badaniach i które zostało udowodnione przynajmniej dla obszarów somato-dendrytycznych i krótkodystansowych projekcji aksonalnych 19-21. To, czy istnieje ciągłość ER w długich projekcjach aksonalnych, jest kwestią dyskusyjną.

Strategie pomiaru przepływu wolnego wapnia przez błonę ER

Sygnały wapniowe są najczęściej monitorowane w cytozolu 22,23. Dlatego nie można łatwo odróżnić, czy Ca2+ wpływa do cytozolu z zapasów zewnątrzkomórkowych czy wewnątrzkomórkowych 6,24. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano strategie metodologiczne bezpośredniego obrazowania wapnia ER. Podsumowując, stosowane są następujące strategie: (1) Genetycznie modyfikowane wskaźniki białkowe ukierunkowane na ER 25-27. Oparte na białku wskaźniki Ca2 + o niskim powinowactwie wykorzystują bioluminescencyjne białko aequorin lub GFP w połączeniu z białkiem wykrywającym wapń. Te genetycznie zmodyfikowane wskaźniki Ca2 + (GECI) mogą być kierowane do ER za pomocą peptydu sygnałowego i są aktywnie utrzymywane w ER za pomocą motywu retencji i odzyskiwania. Wspólne wskaźniki ER Ca2+ opierają się na zasadzie Cameleon i są to Cameleon YC4.3 26,28; Cameleon podzielił YC7.3ER 29 i Cameleon D1 30. (2) Bezpośrednie obciążenie barwnikiem na bazie esterazy wskaźników Ca 2+ o niskim powinowactwie estru AM 31,32. Pochodne AM barwników wskaźnikowych (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM lub Fluo5N-AM) przechodzą przez błony biologiczne w stanie lipofilowym, niewrażliwym na wapń. Następnie w cytozolu, a także w ER, endogenne esterazy rozszczepiają grupę estrów AM i uwalniają wskaźnik Ca2+, pozostawiając pewną ilość aktywnego barwnika w cytozolu i ER. Dlatego podejście to jest przydatne w warunkach wysokiego stężenia wapnia w ER, o ile stężenie wapnia w cytozolu pozostaje znacznie poniżej granicy wykrywalności wskaźników niskiego powinowactwa, szczególnie podczas charakterystycznych sygnałów wapniowych (np. nM do niskiego μM). (3) Obciążenie estrem AM w połączeniu z przepuszczalnością błony plazmatycznej 32. Pozostały cytozolowy wskaźnik Ca2+ jest usuwany przez przenikanie błony plazmatycznej niewielkimi ilościami "łagodnego" detergentu (np. saponiny) w sztucznym buforze wewnątrzkomórkowym. W ten sposób błony wewnątrzkomórkowe mogą być stymulowane np. IP3 w buforze wewnątrzkomórkowym, bezpośrednio przez "pory" w błonie komórkowej. (4) Dializa cytozolu w konfiguracji całokomórkowej i jednoczesne pomiary Ca2+ w świetle ER i cytozolu 32,33. Komórka jest najpierw ładowana wskaźnikiem Ca2+ o niskim powinowactwie (np. Mag-Fura2-AM, ratiometryczny, światło UV). Następnie, za pomocą pipety punktowej, wszelkie pozostałe cytozolowe wskaźniki Ca2+ o niskim powinowactwie są dializowane z cytozolu za pomocą buforu zawierającego wskaźnik Ca2+ o wysokim powinowactwie (np. Fluo-3, światło widzialne). Strategia ta umożliwia jednoczesne rejestrowanie sygnałów pochodzących z cytozolu i ER. (5) Obciążenie barwnikiem wywołane celowaną esterazą 8,34. Karboksylesterazy (CES) jest ukierunkowana na światło ER i zapewnia wysoką aktywność esterazy w celu skutecznego wychwytywania formy estru AM wskaźników Ca2 + o niskim powinowactwie.

Ładowanie barwnikiem wywołane przez celowaną esterazę (TED)

Aby poprawić ukierunkowanie wskaźników Ca2+ o niskim powinowactwie do światła ER, stworzono TED. TED wymaga nadekspresji mysiej karboksyloesterazy ukierunkowanej na ER (CES2) (Figura 2), którą osiąga się za pomocą konstruktów ekspresji. Komórki wyrażające rekombinowany konstrukt CES inkubuje się z formą estru AM barwnika wskaźnikowego wapnia (Fluo5N-AM, ryc. 2). Następnie, w ER, barwnik jest przekształcany w wrażliwy naCa2+, nieprzepuszczalny dla błony kompleks wskaźnikowy Ca2+ (Fluo5N / Ca2+) przez wysoką aktywność esterazy, zatrzymując w ten sposób barwnik w wysokim stężeniu w świetle ER 8,34. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania uwalniania wapnia przez szlaki IiCR, na przykład przez receptory metabotropowe, purynergiczne lub glutaminianu 8,34 oraz do wizualizacji ubytku wapnia w ER bezpośrednio przez "kanały przeciekowe", na przykład po blokadzie SERCA 17,34. Z naszego doświadczenia wynika, że wskaźnik Ca2+ o niskim powinowactwie Fluo5N-AM jest obecnie najlepszym dostępnym wskaźnikiem do stosowania w strategii ładowania barwnikiem TED. Fluo5N-AM ma niskie powinowactwo do Ca2+ (stała dysocjacji KD ~ 90 μM, ryc. 2), jest prawie niefluorescencyjny w swojej postaci AM, ale zapewnia wysoką emisję fluorescencji po związaniu wapnia 8,34. Kompleks Fluo5N/Ca2+ może być wzbudzany standardowym źródłem światła o długości fali ~490 nm, co odpowiada standardowym barwnikom, takim jak FITC, Alexa 488 lub eGFP. Cytozolowe sygnały wapniowe ledwo osiągają stężenie w niskim zakresie μM i dlatego są ledwo wykrywane przez Fluo5N w cytozolu 35.

Aby poprawić wydajność TED, opracowano kilka rekombinowanych konstrukcji wektorowych (Rysunek 3). Pierwotnie, wektory TED oparte na sekwencji kodowania CES2 (numer dostępu Refseq NM_145603, CES2c) i najlepsze wyniki TED są obserwowane przy stabilnej ekspresji konstrukcji CES. Nowe wektory TED wyrażają podstawowy element CES2 połączony z białkiem czerwonej fluorescencji TagRFP-T2 36. Wektory te mają tę zaletę, że mogą być wykorzystywane do identyfikacji transdukowanych komórek i do wykorzystania czerwonej fluorescencji jako wewnętrznej kontroli normalizacji zmian we fluorescencji Fluo5N / Ca2 +. Czerwona fluorescencja daje również możliwość wizualizacji strukturalnego rozkładu ER i zmian dynamiki ER w warunkach stymulacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół przedstawia zastosowanie TED w liniach komórkowych, neuronach hipokampa oraz komórkach glejowych kory. Metoda TED wykazuje najwyższą skuteczność, gdy wektory TED są stabilnie ekspresowane, na przykład za pomocą wektorów lentiwirusowych. Schematyczny przegląd metody TED przedstawiono na Rysunku 4.

1. Przygotowanie roztworów

Poniższe roztwory należy przygotować przed rozpoczęciem pracy; można je przechowywać zgodnie z podanymi wskazówkami. Zazwyczaj stosujemy sterylizowane szkło i tworzywa sztuczne oraz wodę autoklawowaną.

  1. Przygotować roztwór HEPES-Ringer (w mM): 125 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO4.7H2O, 2 CaCl2, 1,25 NaH2PO4.H2O, 10 glucose.H2O. Roztwór HEPES-Ringer bez wapnia składa się z (w mM): 127 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO4.7H2O, 1,25 NaH2PO4.H2O, 10 glucose.H2O oraz 0,1 EGTA. Bez glukozy roztwory do obrazowania można przechowywać w temperaturze 4 °C. Wymaganą ilość D-glukozy dodaje się bezpośrednio przed użyciem.
  2. Do analizy TED w neuronach hipokampa zaleca się stosowanie sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF). ACSF składa się z (w mM): 127 NaCl, 23 NaHCO3, 3 KCl, 2,5 NaHPO4.H2O, 25 D-glucose.H2O, 2 CaCl2, 2 MgCl2.7 H20 w ddH2O.
  3. Przygotować roztwór Fluo5N-AM o stężeniu 5 mM. Aby ułatwić solubilizację, dodać 8,9 μl 20% Pluronic F-127 (w DMSO, przechowywanego w temperaturze pokojowej, chronionego przed wilgocią i światłem) do 50 μg liofilizowanego Fluo5N-AM. Następnie przeprowadzić solubilizację Fluo5N-AM za pomocą sonikatora kąpielowego przez co najmniej 2 min. Alikwoty po 0,5 μl przechowywać w temperaturze -20 °C, chroniąc przed światłem i wilgocią.
  4. Przygotować zapasy antagonistów i agonistów zgodnie z potrzebami. Na przykład: a) 10 mM ATP lub ADP (w H2O, aktywacja metabotropowa receptorów purynergicznych), b) 10 mM karbacholu w H2O (agonista muskarynowego receptora acetylocholiny), c) 30 mM kwasu cyklopiazonowego (CPA) w DMSO (bloker pompy SERCA), d) 50 mM DHPG w PBS (agonista metabotropowego receptora glutaminianu dla mGluRI i mGluR5), e) 10 mM glutaminianu w H2O, f) 1 mM jonomycyny w DMSO (ionofor), g) 5 mM tapsygarginy w DMSO (wysokoafinitywny bloker pompy SERCA). Alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Wektory lentiwirusowe: Niniejszy protokół obejmuje użycie cząsteczek lentiwirusowego wektora ekspresyjnego TED. Ich produkcja i przechowywanie nie stanowią części tego protokołu. Do transferu rekombinowanych karboksylesteraz do linii komórkowych, komórek glejowych i neuronów stosujemy lentiwirusowe wektory drugiej generacji. Nasz system lentiwirusowy opiera się na wektorze ekspresyjnym FUGW 37, plazmidach pakujących pCMVΔR8.91 lub psPAX2 oraz plazmidzie pseudotypującym pMD2.G 38,39. UWAGA: Należy pamiętać, że praca z rekombinowanymi samoinaktywującymi się wektorami lentiwirusowymi wymaga ścisłego przestrzegania wytycznych dotyczących bezpieczeństwa biologicznego. W wielu krajach wektory te są klasyfikowane jako grupa ryzyka biologicznego 2. Więcej informacji znajduje się na stronie http://www.addgene.org/lentiviral/.

2. Przygotowanie i infekcja wirusowa neuronów hipokampa myszy

  1. Szklane szkiełka nakrywkowe myje się w szklanej szalce Petriego o średnicy 20 cm (100 szkiełek na szalkę) jednokrotnie w 70% etanolu przez około 30 min. Na koniec dodaje się 100% etanol (p.a.) na 2 min. Pozostałości etanolu usuwa się, a szkiełka suszy pod sterylnym dygestorium.
  2. Przygotowuje się dwa rodzaje pożywek do kultur neuronów hipokampa: (a) pożywkę Neurobasal z B27 1:50; (b) pożywkę kompletną: pożywkę Neurobasal z B27 1:50, Glutamax 1:100 oraz suplementem N2 1:100. Pożywki poddaje się sterylnej filtracji i przechowuje w inkubatorze do momentu użycia.
  3. Na dzień przed sekcją przygotowuje się szkiełka nakrywkowe, umieszczając jedno sterylne szkiełko 10 mm w każdym dołku 4-dołkowej płytki do hodowli komórek. Następnie każde szkiełko ostrożnie powleka się 80-100 μl 0,1% poli-L-lizyny i przechowuje płytki w inkubatorze przez noc.
  4. W dniu sekcji i hodowli komórek rozpoczyna się od trzykrotnego przemycia szkiełek nakrywkowych 100 μl HBSS, a następnie nanosi się 100 μl pożywki Neurobasal na każde szkiełko. Płytki umieszcza się w inkubatorze w celu ekwilibracji (np. podczas sekcji myszy).

Sekcja

Eksperymenty przeprowadzamy na myszach zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej, po uzyskaniu zgody instytucjonalnej komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt.

  1. Wyjąć cały mózg i obustronnie wypreparować hipokampy.
  2. Ostrożnie usunąć oponi mózgowe oraz wszelkie tkanki inne niż hipokamp, a następnie umieścić każdy hipokamp w osobnej probówce 1,5 ml zawierającej 450 μl HBSS. Przechowywać tkankę w lodzie do momentu wyizolowania odpowiedniej liczby hipokampów.

Hodowla komórek

  1. Do każdej probówki dodać 50 μl 1% trypsyny (Worthington) i inkubować je w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 min. Co jakiś czas potrząsnąć probówkami. Aby zatrzymać reakcję trawienia, dodać do każdej probówki 50 μl 1% inhibitora trypsyny i kilka razy odwrócić probówkę.
  2. Przenieść całą tkankę z maksymalnie 5 hipokampów do jednej probówki typu falcon o pojemności 15 ml, unikając przenoszenia cieczy. Dodać medium B27 (a) do uzyskania objętości końcowej 5 ml.
  3. Roztrzaskać tkankę za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura, ostrożnie pipetując ciecz w górę i w dół. UWAGA: Unikać tworzenia pęcherzyków powietrza!
  4. Wirować z prędkością 400 x g przez 3 min, odessać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 5 ml medium B27 (a).
  5. Ponownie roztrzaskać tkankę szklaną pipetą, a następnie dwukrotnie za pomocą plastikowego końcówki z filtrem o pojemności 1 000 μl. Wykonać tę czynność zgodnie z opisem w krokach 2.9 i 2.10.
  6. Po ostatnim wirowaniu resuspender osad komórkowy w 2 ml pełnego medium (b) i roztrzaskać komórki za pomocą plastikowej końcówki z filtrem o pojemności 200 μl. Aby oddzielić pozostałe skupiska komórek od zawiesiny pojedynczych komórek, pozostawić skupiska do osadzenia na 1-2 min.
  7. Policzyć komórki i obliczyć całkowitą liczbę komórek potrzebną do infekcji wirusowej. Do obrazowania TED użyć 25 000 komórek na szkiełko podstawowe 10 mm.
  8. Na tym etapie zaleca się wysianie dodatkowych 25 000 nietransdukowanych komórek w celu zastosowania jako kontrola.

Infekcja wirusowa

  1. Przenieś zawiesinę komórkową przeznaczoną do infekcji wirusowej do nowej probówki typu falcon o pojemności 15 ml i wiruj przez 3 min przy 400 x g.
  2. Odsącz nadosad i resuspenduj komórki w 300 μl pożywki (b).
  3. Dodaj odpowiednią ilość zakaźnych cząsteczek lentiwirusowego wektora ekspresyjnego TED i pozostaw probówkę typu falcon w temperaturze pokojowej na 10 min.
  4. Uzupełnij objętość w probówce pełną pożywką (b) do końcowej objętości niezbędnej do wysiewu (100 μl na każde szkiełko nakrywkowe 10 mm), odessać pożywkę ze szkiełek nakrywkowych i niezwłocznie nanieść 100 μl zawiesiny komórkowej na każde szkiełko.
  5. Umieść szalki w inkubatorze do czasu osiadania wszystkich komórek (ok. 2 h), a następnie ostrożnie dopełnij szalki pożywką (b) do objętości 2 ml.
  6. Pozostaw neurony do wzrostu na co najmniej jeden tydzień. Wymieniaj 50% pożywki co tydzień.

3. Hodowla i zakażanie wirusowe komórek glejowych kory mózgu myszy

Przygotowanie

  1. Należy rozpocząć od przygotowania podstawowego medium dla gleju (mieszanina DMEM/F12 w stosunku 1:1 z 10% FCS, 5% HS, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,45% glukozy) oraz pokrycia kolby hodowlanej T75 4 ml 0,5 ng/ml hydrobromku poli-DL-ornityny (PORN) (rozcieńczonego w 150 mM roztworze kwasu borowego, pH 8,35). Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 2 h lub przez noc, kolbę hodowlaną należy przemyć trzykrotnie HBSS i dodać 18 ml podstawowego medium dla gleju zawierającego B27 1:50 oraz 10 ng/ml EGF. Kolbę hodowlaną należy pozostawić w inkubatorze do wyrównania parametrów (do 3 h).

Sekcja

  1. Eksperymenty przeprowadzamy na myszach zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej, po uzyskaniu zatwierdzenia przez instytucjonalną komisję ds. opieki i wykorzystania zwierząt.
  2. Wypreparować mózg jednej myszy w wieku P5-P7, a następnie usunąć hipokamp i opony mózgowo-rdzeniowe z obu półkul, zgodnie z opisem w punkcie 2.5.
  3. Wypreparować korę przedczołową, pociąć ją na kilka małych fragmentów i umieścić je w probówce 1,5 ml zawierającej HBSS. Przechowywać probówkę w lodzie i przejść do etapu hodowli komórkowej.

Hodowla komórek

  1. Przenieś całą tkankę z probówki do probówki typu Falcon o pojemności 15 ml, używając szklanej pipety wypalanej nad ogniem.
  2. Dodaj pożywkę podstawową do uzyskania końcowej objętości 5 ml i rozdrobnij tkankę poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół szklaną pipetą wypalaną nad ogniem. Po wirowaniu przy 300 x g przez 3 min odessij pożywkę i resuspenduj osad komórkowy w 5 ml pożywki podstawowej.
  3. Powtórz krok 3.5 dwukrotnie.
  4. Po trzecim wirowaniu resuspenduj osad komórkowy w 2 ml podstawowej pożywki dla gleju zawierającej B27 (1:50) oraz 10 ng/ml EGF.
  5. Ponownie rozdrobnij zawiesinę i przenieś ją do przygotowanej kolby hodowlanej T75, a następnie inkubuj komórki przez 3-4 dni.

Przemywanie komórek glejowych (po 3-4 dniach hodowli):

  1. Przemyj komórki raz 10 ml PBS, a następnie energicznie opukaj lub delikatnie uderz dłonią w kolbę kilka razy, trzymając ją mocno w drugiej ręce. Na tym etapie z hodowli usuwane są szczątki komórkowe oraz aglomeraty komórek.
  2. Odsącz PBS i dodaj świeże podstawowe medium do gleju zawierające B27 (1:50) oraz 10 ng/ml EGF. Kontynuuj inkubację hodowli przez 5-7 dni, aż komórki osiągną 80% konfluencji.

Rozdzielanie, transdukcja i końcowe wysiewanie komórek glejowych:

  1. Pokryć szkiełka podstawowe 10 mm 100 μl poli-D-lizyną (roztwór zapasowy: 0,1%, rozcieńczony 1/50 do 20 μg/ml w PBS lub HBSS) i inkubować je w inkubatorze przez noc. Przemyć szkiełka trzy razy HBSS i dodać 100 μl podstawowego pożywki dla gleju. Równoważyć szkiełka w inkubatorze (3 hr).
  2. Przemyć komórki glejowe dwukrotnie 10 ml PBS, odessać PBS i dodać 3 ml trypsyny (TrypLE, nierozcieńczona). Trypsynizować komórki przez maksymalnie 1 min. UWAGA: Należy unikać nadmiernej trypsynizacji. Zazwyczaj po 1 min odłącza się ponad 80% wszystkich komórek, co jest wystarczające do uzyskania kilku milionów zdrowych komórek.
  3. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 10 ml podstawowej pożywki dla gleju, przenieść zawiesinę komórkową do probówki Falcon 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 3 min. Odessać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 5 ml podstawowej pożywki dla gleju.
  4. Ponownie odwirować i odessać zgodnie z opisem w kroku 3.15, a następnie resuspendować komórki w 5 ml podstawowej pożywki dla gleju.
  5. Przenieść wymaganą liczbę komórek do probówki 1,5 ml. 104-2x104 komórek glejowych jest wystarczające na jedno szkiełko podstawowe 10 mm. Zazwyczaj objętość zawiesiny do transdukcji komórek dla jednej płytki 4-dołkowej wynosi mniej niż 200 μl. Dodać do komórek odpowiednią ilość cząsteczek lentiwirusowego wektora ekspresyjnego TED i inkubować w RT przez 10 min. Następnie uzupełnić zawiesinę podstawową pożywką dla gleju do objętości wysiewu (100 μl na szkiełko).
  6. Wysiać 100 μl zainfekowanych komórek na szkiełko i inkubować przez około 2 hr, a następnie dodać podstawową pożywkę dla gleju zawierającą B27 1:50 i 10 ng/ml EGF do końcowej objętości 2 ml.
  7. W celu uzyskania idealnych warunków hodowli należy wykorzystać komórki do eksperymentów w dniach 3-7 po wysianiu.

4. Generowanie i hodowla linii komórkowej reporterowej

Linie komórkowe reporterowe TED zostały opracowane na podstawie linii HeLa, BHK21, Hek293 oraz SH-SY5Y. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół dla komórek HeLa, jednak procedura ta może zostać przeniesiona na każdą inną linię komórkową.

Generowanie stabilnej linii komórkowej HeLa

  1. Przeprowadzić pasaż linii komórkowej HeLa typu dzikiego i przenieść 100 000 komórek w objętości 200 μl do probówki 1,5 ml.
  2. Do probówki dodać odpowiednią ilość cząsteczek lentiwirusem wektora ekspresyjnego TED i inkubować zawiesinę komórkowo-wirusową przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Następnie wysiać komórki w łącznej objętości 2 ml pożywki (DMEM, 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny) do szalki 30 mm i inkubować przez 3 dni.
  3. Po jednokrotnym przemyciu PBS-em odessać pożywkę i dodać 500 μl trypsyny (TrypLE, 2:3 w PBS). Inkubować przez ok. 3 min, a następnie zatrzymać reakcję, dodając 3 ml pożywki. Przenieść zawiesinę do probówki typu Falcon 15 ml i wirować przy 400 x g przez 3 min.
  4. Resuspender osad komórkowy w 200 μl pożywki i ponownie zainfekować komórki cząsteczkami lentiwirusowymi zgodnie z opisem w punkcie 4.2. Następnie wysiać komórki do kolby hodowlanej T25 w 10 ml pożywki.
  5. Hodować komórki do osiągnięcia konfluencji na poziomie 60-80%. Następnie przeprowadzić pasaż kultury.

Linie komórkowe reporterowe TED

  1. Linie komórkowe z reporterem TED można hodować w dowolnym standardowym medium, np. stosuje się DMEM zawierający 5% lub 10% FCS oraz 1% penicyliny/streptomycyny.
  2. Wysiać odpowiednią liczbę komórek do naczynia 4-dołkowego zawierającego sterylne szkiełka nakrywki 10 mm (patrz wyżej), np. od 10 000 do 20 000 komórek na szkiełko.
  3. Hodować komórki przez co najmniej dwa dni przed wykorzystaniem ich do obrazowania TED.

5. Przygotowanie do procedury obrazowania na żywo przy użyciu mikroskopu odwróconego

    1. Podgrzej roztwór HEPES-Ringer do temperatury pokojowej i dodaj D-glukozę.
    2. Podgrzej ACSF (bez Ca2+ i Mg2+) do temperatury pokojowej i dodaj D-glukozę. Napowietrzaj ACSF karbogenem przez 5 minut. Następnie dodaj roztwory stokowe CaCl2 i MgCl2 o stężeniu 1 M do stężeń końcowych 2 mM dla każdego z nich.
  2. Uruchom mikroskopy do obrazowania na żywo oraz wszystkie programy komputerowe.
  3. Rozpocznij perfuzję w „testowej” komorze obrazowania i ustabilizuj system rurek.
  4. Podgrzej przepływowy podgrzewacz roztworów oraz komorę obrazowania w stole mikroskopu. Zamocuj komorę obrazowania w wkładce grzewczej.
  5. Ustabilizuj system w temperaturze 32-37 °C przed rozpoczęciem procedury ładowania barwnika. UWAGA: Aby uniknąć przypadkowego przedostania się roztworu perfuzyjnego do układu mikroskopu, stosujemy frotki wokół obiektywów oraz elastomerowe arkusze silikonowe (1mm) w celu ochrony stołu mikroskopu.

6. Ładowanie barwnika do dowolnego z typów komórek

  1. Resuspenduj 1 alikwot Fluo5N-AM (patrz 1.3) w 100 μl podgrzanego roztworu obrazującego (HEPES-Ringer lub ACSF).
  2. Rozpuść Fluo5N-AM w roztworze obrazującym (HEPES-Ringer lub ACSF) w sonicatorze kąpielowym przez 90 sec.
  3. Użyj nowej płytki 4- lub 24-dołkowej i przenieś 400 μl podgrzanego roztworu obrazującego do jednego dołka. Dodaj roztwór barwnika do tego samego dołka, aby uzyskać 500 μl roztworu o stężeniu 5 μM.
  4. Ostrożnie umieść w dołku szkiełko podstawowe z komórkami (np. o średnicy 10-18 mm), komórkami skierowanymi do góry.
  5. Inkubuj przez odpowiedni czas w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C (w tym czasie przygotuj ustawienia obrazowania na stole mikroskopu). Typowy czas ładowania barwnika wynosi od 7-15 min dla neuronów i komórek glejowych oraz od 10-20 min dla linii komórkowych.

KRYTYCZNE: Czas ładowania barwnika oraz jego stężenie zależą od typu komórek, gęstości komórek i specyficznych potrzeb eksperymentu! Długi czas inkubacji w obecności barwnika może uszkodzić komórki, zwłaszcza pierwotne neurony i pierwotne komórki glejowe, co ma krytyczny wpływ na ich reaktywność na bodźce fizjologiczne. Długie czasy inkubacji (np. 30 min) będą przydatne wyłącznie w eksperymentach dotyczących lokalizacji wapnia w retikulum endoplazmatycznym (ER) w celu zbadania rozkładu wapnia w małych strukturach subkomórkowych, np. cienkich neurytach lub kolcach dendrytycznych. W niektórych eksperymentach zastosowanie mieszaniny 1/3 pożywki wzrostowej z roztworem do obrazowania może pomóc w ochronie komórek podczas ładowania Fluo5N-AM.

  1. Niezwłocznie przenieś szkiełko nakrywkowe do innego dołka hodowli komórkowej zawierającego roztwór do obrazowania (HEPES-Ringer lub ACSF) i rozpocznij montowanie komórek w komorze obrazowania.

7. Obrazowanie wapnia w siateczce śródplazmatycznej w żywych komórkach przy użyciu odwróconego konfokalnego mikroskopu skaningowego

  1. Za pomocą pędzla nanieść smar wysokopróżniowy na komorę obrazowania. Smar jest niezbędny do utrwalenia lamellki na dnie komory perfuzyjnej. Stosujemy wykonane samodzielnie komory obrazowania dla lamellek o rozmiarze 10-12 mm o małej objętości, co pozwala na osiągnięcie wysokich prędkości perfuzji, wynoszących do 15-krotnej wymiany buforu na minutę. Komercyjnie dostępną komorę perfuzyjną dla lamellek 18 mm można nabyć od firmy Warner instruments (RC-49FS). Komora ta umożliwia również stymulację polową neuronów.
  2. Podnieść lamellkę z komórkami obciążonymi Fluo5N i dodać małą kroplę roztworu do obrazowania (50-100 μl) na komórki, aby pozostały one przykryte roztworem. Odwrócić lamellkę do góry nogami i zamontować komórki w komorze obrazowania. Aby docisnąć lamellkę do kleju silikonowego, należy użyć patyczka higienicznego (np. Q-tips).
  3. Usunąć pozostałości buforu z dolnej strony szklanej lamellki za pomocą patyczków higienicznych. UWAGA: Należy starannie usunąć resztki wilgoci w przypadku stosowania obiektywu olejowego o wysokiej aperturze numerycznej do obrazowania o wysokiej rozdzielczości. Pozostałości soli najlepiej usunąć wodą. Przypadkowe rozmazanie smaru można usunąć acetonem lub czystym etanolem.
  4. Zamienić „zastępczą” komorę obrazowania na eksperymentalną komorę obrazowania. Płukać komórki przez 5-10 min poprzez ciągłą perfuzję.
  5. Płukać komórki przez 5-10 min poprzez ciągłą perfuzję.
  6. Do wyboru komórek należy używać minimalnej ilości oświetlenia laserowego, wysokich częstotliwości skanowania (2-4 Hz), małego rozmiaru obrazu oraz wysokiego wzmocnienia.
  7. UWAGA: Do wyboru komórek znakowanych Fluo5N nie należy używać nadmiernej ilości światła ani bezpośredniego oświetlenia światłem epifluorescencyjnym. Intensywne oświetlenie kompleksów Fluo5N/Ca2+ powoduje całkowitą utratę fluorescencji specyficznej dla ER w ciągu 2-4 s (Rysunek 5).
  8. Ustawić mikroskop zgodnie z planowanym eksperymentem. W celu orientacji w Tabeli 1 podano reprezentatywne ustawienia dla obrazowania z różnymi wektorami TED. Do odwróconej konfokalnej mikroskopii skaningowej używamy mikroskopu Olympus IX81 połączonego z systemem konfokalnym Fluoview 1000 wyposażonym w lasery diodowe (473 nm, 15 mW; 559 nm, 20 mW) oraz system detekcji spektralnej.
  9. Na początku eksperymentu udokumentować wybrane komórki za pomocą stosów obrazów x,y-z o wysokiej rozdzielczości.
  10. Przeprowadzić obrazowanie x,y-t w celu monitorowania dynamiki wapnia w ER w określonych warunkach eksperymentalnych. Typowe ustawienia dla naszego systemu wymieniono w Tabeli 2.
  11. Monitorować zmiany poziomu wapnia w ER podczas ciągłej perfuzji roztworem do obrazowania. Przykładowe typowe szybkości wymiany buforu to: (a) płukanie komórek i wyczerpanie zapasów poprzez blokadę SERCA: 1,5 ml/min; (b) stymulacja ATP/DHPG: 3 ml/min.
  12. Obrazy cyfrowe należy pozyskiwać preferencyjnie w formacie 12-bitowym (4096 wartości szarości). W przypadku równoległego obrazowania Fluo5N/Ca2+ oraz RFP, obrazy 8-bitowe (256 wartości szarości) mogą zapobiec przepełnieniu danych w systemie.
  13. Zapisywać serie czasowe obrazów żywych komórek (x,y-t) lub stosy obrazów 3D (x,y-z) (dla rozkładu komórkowego kompleksów Fluo5N/Ca2+) w formacie kompatybilnym z ImageJ (np. tiff).

8. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

  1. Otwórz stos obrazów w programie ImageJ. W przypadku obrazowania wielokolorowego, na prośbę programu ImageJ, rozdziel kanały RGB.
  2. Zidentyfikuj interesujące obszary (ROI), dokładnie analizując stosy obrazów (np. za pomocą wykresu intensywności w funkcji czasu).
  3. Użyj wtyczki Time-Series Analyzer, aby odczytać średnią intensywność pikseli w ROI (Fraw). W zależności od celu, wyznacz ROI obejmujące cały ER lub małe obszary ER, np. ER dendrytów w obwodowych regionach komórki. Wyznacz również 1-3 ROI w obszarach bez komórek w celu odjęcia tła.
  4. Oblicz średnią fluorescencję tła (Fb), wyliczając średnią wartość fluorescencji dla ROI tła, a następnie odejmij wartość tła Fb od wartości Fraw, aby otrzymać wartość Froi.
  5. Oblicz F0, czyli podstawową fluorescencję komórek, wyliczając średnią z dziesięciu do 30 wartości fluorescencji dla każdego ROI w stanie spoczynku.
  6. Oblicz skorygowane o tło względne zmiany fluorescencji ΔF/F0 według wzoru:

Wzór na zmianę sygnału fluorescencji ΔF/F₀, stosowany w analizie obrazowania optycznego.

  1. Przedstaw względne zmiany fluorescencji w formie wykresu zależności ΔF/F0 na osi Y od czasu na osi X.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia nieinwazyjne podejście do bezpośredniego obrazowania wolnego wapnia w siateczce śródplazmatycznej (ER). Syntetyczne wskaźniki Ca2+ o niskim powinowactwie są uwalniane i zatrzymywane w świetle ER dzięki aktywności rekombinowanego enzymu esterazy skierowanego do ER. Poprawione ładowanie barwników wskaźnikowych Ca2+ do światła ER umożliwia bezpośrednie i szybkie obrazowanie dynamiki zapasów wapnia w ER.

Typy komórek do TED

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zalety i wady metody TED zostały obszernie omówione w najnowszych publikacjach 34,35. W porównaniu z innymi metodami opisanymi powyżej, TED omija problem zakłócania i perfuzji komórek. Ponadto należy podkreślić dwa aspekty. Zasada TED do obrazowania wapnia ER wymaga (1.) ukierunkowanej ekspresji aktywnej karboksyloesterazy w świetle ER za pomocą konstruktów wektorowych TED oraz (2.) wydajnego i preferencyjnego uwalniania syntetycznych estrów AM barwników wapniowych o niskim powinowactwie w świetle ER.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantami Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 i Friedrich-Baur-Stiftung. Chcielibyśmy podziękować Rogerowi Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute Laboratories na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego za dostarczenie nam Tag-RFP-T2. Dziękujemy Davidowi Baltimore'owi z California Institute of Technology w Pasadenie i Didierowi Trono z Uniwersytetu Genewskiego w Genewie za dostarczenie nam plazmidów lentiwirusowych FUGW i psPAX2/pMD2.G.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(S)-3,5-DHPG (Dihydroksyfenyloglicyna)Tocris0805
5';-ATP-Na2, hydrat soli disodowej ATPSigmaA26209-1G
B-27, 50xInvitrogen17504-044
Chlorek karbamoylcholiny (Charbachol)SigmaC4382-1g
Kwas cyklopiazonowy (CPA)Ascent scientificAsc-300
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD2650
DMEM z GlutamaxInvitrogen-Gibco31966-047
Dulbecco's PBS bez Ca/Mg 1xPAAH15-002
Surowica cielęca płoduInvitrogen-Gibco10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ gInvitrogenF14204
GlutaminianAscent scientificAsc-049
GlutamaxInvitrogen35050-038
Mieszanka składników odżywczych Ham's F12Invitrogen-Gibco21765-029
Hank's BSS(1x) bez Ca, bez Mg, z czerwienią fenolową, HBSSPAA LaboratoriesH15-010
Surowica dla koniSHD3250YKLinearis
Ionomycyna Sól Ca2+Ascent scientificAsc-116
mysi suplement EGF PreproTech315-09
N2 100xInvitrogen17502-048
Podłoże neurobazalneInvitrogen-Gibco21103-049
Pluronic F127, niska absorbancja UV, 2gInvitrogenP6867
Bromowodorek poli-DL-ornityny PORNSigmaP8638
Bromowodorek poli-D-lizynySigmaP7280
Poli-L-lizynaSigmaP2636
ThapsigarginCalbiochem586005-1mg
TryLE ExpressInvitrogen12605-028
TrypsynaWorthingtonLS-003707
Trypsynininhibitor z Glycine MAX (soja)SigmaT6522
Materials
System konfokalny: odwrócony laserowy mikroskop skaningowy: FV1000 z konfiguracją IX81Olympusdostosowaną do potrzeb użytkownika
System konfokalny: sumator laserowy FV10 i lasery diodowe (405, 473, 559, 635)Olympuskonfiguracja specyficzna dla użytkownika
System konfokalny: głowica skanująca FV10-SPD z wykrywaczem spektralnymKonfiguracja specyficzna dla użytkownikaOlympus
Sterownik grzałki TC-344BWarner Instruments64-0101do sterowania grzałką roztworu w linii
OprogramowanieNIH ImageJWS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Cel: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35OlympusN2709100
Cel: UPLFLN40XOOlympusN1478700
Cel: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15OlympusN1480700
Komora perfuzyjna, odwróconazamówienie
Komora perfuzyjna, RC-49FSWarner InstrumentsW4 64-1709
Rurka perfuzyjna: PT-49Warner Instruments64-1730do perfuzji
Pompa perystaltyczna MiniPlus 3 (4 kanały)Pompa perfuzyjnaGilsonn.a.
Pojedyncza grzałka roztworu liniowego SH-27BWarner Instruments64-0102sterowany sterownikiem grzałki
Rury ssące: ST3RWarner Instruments64-1407do perfuzji
Wkład grzewczy: Tempocontrol 37-2 cyfrowy 2-kanałowyPeconn.a.
suplement na

Bibliografia

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 11-21 (2000).
  3. Agulhon, C., et al. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
  4. Augustine, G. J., Santamaria, F., Tanaka, K. Local calcium signaling in neurons. Neuron. 40, 331-346 (2003).
  5. Berridge, M. J. Neuronal calcium signaling. Neuron. 21, 13-26 (1998).
  6. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73, 862-885 (2012).
  7. Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59, 861-872 (2008).
  8. Jaepel, J., Blum, R. Capturing ER calcium dynamics. European Journal of Cell Biology. 90, 613-619 (2011).
  9. Verkhratsky, A. Physiology and pathophysiology of the calcium store in the endoplasmic reticulum of neurons. Physiological Reviews. 85, 201-279 (2005).
  10. Burdakov, D., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Intraluminal calcium as a primary regulator of endoplasmic reticulum function. Cell Calcium. 38, 303-310 (2005).
  11. Streb, H., Irvine, R. F., Berridge, M. J., Schulz, I. Release of Ca2+ from a nonmitochondrial intracellular store in pancreatic acinar cells by inositol-1,4,5-trisphosphate. Nature. 306, 67-69 (1983).
  12. Choi, J. H., Ryu, S. H., Suh, P. G. On/off-regulation of phospholipase C-gamma 1-mediated signal transduction. Advances in Enzyme Regulation. 47, 104-116 (2007).
  13. Clapham, D. E. TRP channels as cellular sensors. Nature. 426, 517-524 (2003).
  14. Cahalan, M. D. STIMulating store-operated Ca(2+) entry. Nature Cell Biology. 11, 669-677 (2009).
  15. Soboloff, J., Madesh, M., Gill, D. L. Sensing cellular stress through STIM proteins. Nature Chemical Biology. 7, 488-492 (2011).
  16. Erdmann, F., et al. Interaction of calmodulin with Sec61alpha limits Ca2+ leakage from the endoplasmic reticulum. The EMBO Journal. 30, 17-31 (2011).
  17. Schäuble, N., et al. BiP-mediated closing of the Sec61 channel limits Ca(2+) leakage from the ER. The EMBO Journal. , (2012).
  18. Park, M. K., Choi, Y. M., Kang, Y. K., Petersen, O. H. The endoplasmic reticulum as an integrator of multiple dendritic events. The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 14, 68-77 (2008).
  19. Cooney, J. R., Hurlburt, J. L., Selig, D. K., Harris, K. M., Fiala, J. C. Endosomal compartments serve multiple hippocampal dendritic spines from a widespread rather than a local store of recycling membrane. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2215-2224 (2002).
  20. Holbro, N., Grunditz, A., Oertner, T. G. Differential distribution of endoplasmic reticulum controls metabotropic signaling and plasticity at hippocampal synapses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15055-15060 (2009).
  21. Terasaki, M., Slater, N. T., Fein, A., Schmidek, A., Reese, T. S. Continuous network of endoplasmic reticulum in cerebellar Purkinje neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7510-7514 (1994).
  22. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J. Vis. Exp. (23), e1067(2009).
  23. Lang, S., Schäuble, N., Cavalie, A., Zimmermann, R. Live cell calcium imaging combined with siRNA mediated gene silencing identifies Ca(2)(+) leak channels in the ER membrane and their regulatory mechanisms. J. Vis. Exp. (53), e2730(2011).
  24. Rudolf, R., Mongillo, M., Rizzuto, R., Pozzan, T. Looking forward to seeing calcium. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 579-586 (2003).
  25. Mank, M., Griesbeck, O. Genetically encoded calcium indicators. Chemical Reviews. 108, 1550-1564 (2008).
  26. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
  27. Montero, M., et al. Monitoring dynamic changes in free Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum of intact cells. The EMBO Journal. 14, 5467-5475 (1995).
  28. Griesbeck, O., Baird, G. S., Campbell, R. E., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. The Journal of Biological Chemistry. 276, 29188-29194 (2001).
  29. Ishii, K., Hirose, K., Iino, M. Ca2+ shuttling between endoplasmic reticulum and mitochondria underlying Ca2+ oscillations. EMBO Reports. 7, 390-396 (2006).
  30. Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17404-17409 (2004).
  31. Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique for in situ measurement of calcium in intracellular inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores using the fluorescent indicator mag-fura-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2598-2602 (1993).
  32. Solovyova, N., Verkhratsky, A. Monitoring of free calcium in the neuronal endoplasmic reticulum: an overview of modern approaches. Journal of Neuroscience Methods. 122, 1-12 (2002).
  33. Solovyova, N., Veselovsky, N., Toescu, E. C., Verkhratsky, A. Ca(2+) dynamics in the lumen of the endoplasmic reticulum in sensory neurons: direct visualization of Ca(2+)-induced Ca(2+) release triggered by physiological Ca(2+) entry. The EMBO Journal. 21, 622-630 (2002).
  34. Rehberg, M., Lepier, A., Solchenberger, B., Osten, P., Blum, R. A new non-disruptive strategy to target calcium indicator dyes to the endoplasmic reticulum. Cell Calcium. 44, 386-399 (2008).
  35. Blum, R., Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Calcium imaging of intracellular organelles: endoplasmic reticulum. 43, Humana Press. (2010).
  36. Shaner, N. C., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nature Methods. 5, 545-551 (2008).
  37. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
  38. Zufferey, R., et al. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. Journal of Virology. 72, 9873-9880 (1998).
  39. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15, 871-875 (1997).
  40. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21960-21965 (2009).
  41. Blum, R., Petersen, O. H., Verkhratsky, A. Calcium measurement methods. Verkhratsky, A., Petersen, O. H. Vol. Neuromethods 43 (Springer protocols), Humana Press. 147-167 (2010).
  42. Tian, L., et al. Selective esterase-ester pair for targeting small molecules with cellular specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4756-4761 (2012).
  43. Samtleben, S., Blum, R. Improved vectors for direct ER calcium imaging with targeted-estersase induced dye loading. , In preparation (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie wapnia w ERekspresja wektora TEDkarboksylesteraza CES2fluorescencyjne wska niki wapniakonfokalna mikroskopia skaningowaobrazowanie ywych kom rekhomeostaza wapniadynamika retikulum endoplazmatycznegodelta F nad F zero
Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.