Bezpośrednie obrazowanie wapnia ER z ładunkiem barwnika indukowanym przez celowaną esterazy (TED)

Podsumowanie

Ładowanie barwnikiem indukowane przez esterazy celowane (TED) wspiera analizę dynamiki wewnątrzkomórkowego magazynowania wapnia za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda opiera się na ukierunkowaniu rekombinowanej karboksylesterazy na retikulum endoplazmatyczne (ER), gdzie poprawia miejscowe demaskowanie syntetycznych barwników wskaźnikowych Ca²⁺ o niskim powinowactwie w świetle ER.

Streszczenie

Wizualizacja dynamiki wapnia jest ważna dla zrozumienia roli wapnia w fizjologii komórki. Aby zbadać dynamikę wapnia, popularne stały się syntetyczne fluorescencyjne wskaźniki Ca^{2 +}. Tutaj pokazujemy TED (= ładowanie barwnikiem indukowane przez celowaną esterazyzę), metodę poprawy uwalniania barwników wskaźnikowych Ca^{2 +} w świetle ER różnych typów komórek. Do tej pory TED był stosowany w liniach komórkowych, komórkach glejowych i neuronach in vitro. TED opiera się na skutecznym, rekombinowanym kierowaniu wysokiej aktywności karboksyloesterazy do światła ER przy użyciu konstruktów wektorowych eksprymujących karboksylesterazy (CES). Najnowsze wektory TED zawierają rdzeń CES2 połączony z białkiem czerwonej fluorescencji, umożliwiając w ten sposób jednoczesne obrazowanie dwukolorowe. Dynamika wolnego wapnia w ER jest obrazowana w jednym kolorze, podczas gdy odpowiednia struktura ER jest wyświetlana na czerwono. Na początku zabiegu komórki są transdukowane lentiwirusem. Następnie zainfekowane komórki są umieszczane na szkiełkach nakrywkowych, aby ostatecznie umożliwić obrazowanie żywych komórek. Następnie żywe komórki są inkubowane z estrem acetoksymetylowym (ester AM) wskaźników Ca²+ o niskim powinowactwie, na przykład Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM lub Mag-Fura2-AM. Aktywność esterazy w ER odcina hydrofobowe łańcuchy boczne od formy AM wskaźnika Ca^{2 +} i powstaje hydrofilowy kompleks barwnik fluorescencyjny / Ca^{2 +} i jest uwięziony w świetle ER. Po załadowaniu barwnikiem komórki są analizowane w odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. Komórki są w sposób ciągły perfundowane roztworami podobnymi do Ringera, a dynamika wapnia w ER jest bezpośrednio wizualizowana za pomocą obrazowania poklatkowego. Uwalnianie wapnia z ER identyfikuje się jako spadek intensywności fluorescencji w obszarach zainteresowania, podczas gdy ponowne napełnienie magazynu wapnia ER powoduje wzrost intensywności fluorescencji. Wreszcie, zmianę intensywności fluorescencji w czasie określa się za pomocą obliczeń ΔF/F₀.

Wprowadzenie

Aby rozwiązać fizjologiczne reakcje wapniowe ER, opracowaliśmy nową strategię, aby poprawić wychwytywanie syntetycznych barwników wrażliwych na wapń w ER. Metoda ta umożliwia bezpośrednie, niezakłócające monitorowanie w czasie rzeczywistym wolnego wapnia ER w obecności wapnia zewnątrzkomórkowego.

Funkcja i sygnalizacja ER Calcium

Sygnały wapniowe znajdują się w różnych typach komórek, np. komórkach mięśniowych, neuronach i komórkach glejowych, a ich funkcje wahają się od pośredniczenia w skurczu mięśni do udziału w transmisji synaptycznej w uczeniu się i pamięci ^1,2. Zmiany w stężeniu wolnego wapnia są przedmiotem dużego zainteresowania naukowego, ponieważ wapń bierze udział w regulacji transkrypcji genów, proliferacji komórek, pobudliwości neuronów, śmierci komórki i innych zdarzeń sygnalizacji komórkowej ^1-7. Wszystkie te komórkowe sygnały wapniowe są funkcjonalnie połączone i przyczyniają się do wewnątrzkomórkowej dynamiki magazynowania wapnia ^8-10.

Wspólną cechą wszystkich sygnałów wapniowych jest przepływ wapnia między przestrzenią zewnątrzkomórkową, cytozolem i organellami, głównie ER i mitochondriami. Powoduje to dynamiczne zmiany stężenia wapnia w tych organellach, które są wyczuwane przez różne składniki sygnalizacyjne. Ogólnie rzecz biorąc, stężenie wapnia w ER waha się od 100 do 800 μM, w cytozolu stężenie wapnia jest bliskie 100 nM, aw przestrzeni zewnątrzkomórkowej stężenie wynosi około 1-2 mM. W związku z tym istnieje duża chemiczna siła napędowa przepływu wapnia w kierunku cytozolu ^2,9,10.

Najczęściej badane sygnały wapniowe pochodzące z ER zależą od stymulacji receptorów sprzężonych z białkiem G (GpcR), które następnie aktywują fosfolipazę C (PLC). PLC z kolei wytwarza 1,4,5-trifosforan inozytolu (IP₃) ¹. Po związaniu IP₃ z jego receptorem (IP_3-Rec, ryc. 1) w błonie ER, jony wapnia są uwalniane ze światła ER. Historycznie rzecz biorąc, uwalnianie wapnia z ER za pośrednictwem IP₃ zostało po raz pierwszy - choć pośrednio - zmierzone w zrazikowanych komórkach trzustki przez Streba i wsp. w 1983 r. ¹¹. Publikacja ta po raz pierwszy zasugerowała kaskadę sygnalizacyjną obejmującą acetylocholinę, fosfolipazę C i IP₃. Ten sposób uwalniania wapnia jest ogólnie określany jako uwalnianie wapnia indukowane przez IP₃ (IiCR) (ryc. 1). Zależna od kinazy aktywacja fosfolipazy Cγ przez receptorowe kinazy tyrozynowe łączy działanie czynników wzrostu i czynników neurotroficznych z sygnalizacją wapnia ER po podniesieniu IP₃ ¹². Oprócz IiCR, w podwyższeniu stężenia wapnia może pośredniczyć jonotropowe wnikanie wapnia, na przykład przez kanały wapniowe bramkowane napięciem (Ca_V), a następnie indukowane wapniem uwalnianie wapnia (CiCR) przez receptory ryanodyny (RyR). IiCR i CiCR są fizjologicznie związane z wprowadzaniem wapnia przez magazyn (SOCE). SOCE obejmuje działanie STIM (cząsteczki oddziałującej ze zrębem), która jest czujnikiem uwalniania wapnia przez ER. Wykazano, że STIM stymuluje zewnątrzkomórkowe wnikanie wapnia przez przejściowe kanały potencjału receptora (Trp) ¹³, kanały wapniowe Orai ¹⁴, a nawet kanały wapniowe bramkowane napięciem ¹⁵ (ryc. 1). Utrata wapnia ER jest dynamicznie ratowana przez działanie ATPazy wapniowej retikulum sarko-endoplazmatycznego (SERCA), która aktywnie pompuje wapń z powrotem do ER. Zablokowanie SERCA za pomocą leków, takich jak thapsigargina, ujawnia ciągłą utratę wapnia ER do kompartmentu cytozolowego. Ten "wyciek" wapnia ER jest spowodowany przez wewnątrzbłonowe kompleksy porowe ER, takie jak kompleks białkowy Sec61 ^16,17 (ryc. 1).

W 1998 roku Berridge opublikował model "neuron w modelu neuronu", który sugeruje zasadniczą fizjologiczną rolę ER w integracji neuronalnego wapnia ⁵. Model ten uwzględnia istnienie ciągłego systemu błon ER tworzącego wewnątrzkomórkowy "obraz" błony plazmatycznej neuronów ⁵. Twierdzono, że ten binarny system błon eukariotycznych jest podstawowym warunkiem wstępnym czasowej i przestrzennej integracji szybkich i wolnych sygnałów wapniowych w neuronach. Sygnały wapniowe, które występują jednocześnie lub później w różnych kolcach lub dendrytach tego samego neuronu, są przekazywane do somy lub jądra komórki za pośrednictwem ER, gdzie są sumowane ^5,18. Wówczas ich suma może mieć wpływ na pobudliwość neuronu, regulację transkrypcji genów czy integrację kaskad sygnałowych. W ten sposób ER wspiera integrację sygnałów wapniowych. Jednym z warunków wstępnych tej koncepcji jest ciągłość ER w pojedynczej komórce, co zostało stwierdzone w kilku badaniach i które zostało udowodnione przynajmniej dla obszarów somato-dendrytycznych i krótkodystansowych projekcji aksonalnych ^19-21. To, czy istnieje ciągłość ER w długich projekcjach aksonalnych, jest kwestią dyskusyjną.

Strategie pomiaru przepływu wolnego wapnia przez błonę ER

Sygnały wapniowe są najczęściej monitorowane w cytozolu ^22,23. Dlatego nie można łatwo odróżnić, czy Ca²⁺ wpływa do cytozolu z zapasów zewnątrzkomórkowych czy wewnątrzkomórkowych ^6,24. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano strategie metodologiczne bezpośredniego obrazowania wapnia ER. Podsumowując, stosowane są następujące strategie: (1) Genetycznie modyfikowane wskaźniki białkowe ^{ukierunkowane na ER 25-27}. Oparte na białku wskaźniki Ca^{2 +} o niskim powinowactwie wykorzystują bioluminescencyjne białko aequorin lub GFP w połączeniu z białkiem wykrywającym wapń. Te genetycznie zmodyfikowane wskaźniki Ca^{2 +} (GECI) mogą być kierowane do ER za pomocą peptydu sygnałowego i są aktywnie utrzymywane w ER za pomocą motywu retencji i odzyskiwania. Wspólne wskaźniki ER Ca²⁺ opierają się na zasadzie Cameleon i są to Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon podzielił YC7.3ER ²⁹ i Cameleon D1 ³⁰. (2) Bezpośrednie obciążenie barwnikiem na bazie esterazy wskaźników Ca 2+ o niskim powinowactwie estru AM ^31,32. Pochodne AM barwników wskaźnikowych (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM lub Fluo5N-AM) przechodzą przez błony biologiczne w stanie lipofilowym, niewrażliwym na wapń. Następnie w cytozolu, a także w ER, endogenne esterazy rozszczepiają grupę estrów AM i uwalniają wskaźnik Ca²⁺, pozostawiając pewną ilość aktywnego barwnika w cytozolu i ER. Dlatego podejście to jest przydatne w warunkach wysokiego stężenia wapnia w ER, o ile stężenie wapnia w cytozolu pozostaje znacznie poniżej granicy wykrywalności wskaźników niskiego powinowactwa, szczególnie podczas charakterystycznych sygnałów wapniowych (np. nM do niskiego μM). (3) Obciążenie estrem AM w połączeniu z przepuszczalnością błony plazmatycznej ³². Pozostały cytozolowy wskaźnik Ca²⁺ jest usuwany przez przenikanie błony plazmatycznej niewielkimi ilościami "łagodnego" detergentu (np. saponiny) w sztucznym buforze wewnątrzkomórkowym. W ten sposób błony wewnątrzkomórkowe mogą być stymulowane np. IP₃ w buforze wewnątrzkomórkowym, bezpośrednio przez "pory" w błonie komórkowej. (4) Dializa cytozolu w konfiguracji całokomórkowej i jednoczesne pomiary Ca²⁺ w świetle ER i cytozolu ^32,33. Komórka jest najpierw ładowana wskaźnikiem Ca²⁺ o niskim powinowactwie (np. Mag-Fura2-AM, ratiometryczny, światło UV). Następnie, za pomocą pipety punktowej, wszelkie pozostałe cytozolowe wskaźniki Ca²⁺ o niskim powinowactwie są dializowane z cytozolu za pomocą buforu zawierającego wskaźnik Ca²⁺ o wysokim powinowactwie (np. Fluo-3, światło widzialne). Strategia ta umożliwia jednoczesne rejestrowanie sygnałów pochodzących z cytozolu i ER. (5) Obciążenie barwnikiem wywołane celowaną esterazą ^8,34. Karboksylesterazy (CES) jest ukierunkowana na światło ER i zapewnia wysoką aktywność esterazy w celu skutecznego wychwytywania formy estru AM wskaźników Ca^{2 +} o niskim powinowactwie.

Ładowanie barwnikiem wywołane przez celowaną esterazę (TED)

Aby poprawić ukierunkowanie wskaźników Ca²⁺ o niskim powinowactwie do światła ER, stworzono TED. TED wymaga nadekspresji mysiej karboksyloesterazy ukierunkowanej na ER (CES2) (Figura 2), którą osiąga się za pomocą konstruktów ekspresji. Komórki wyrażające rekombinowany konstrukt CES inkubuje się z formą estru AM barwnika wskaźnikowego wapnia (Fluo5N-AM, ryc. 2). Następnie, w ER, barwnik jest przekształcany w wrażliwy na^Ca2+, nieprzepuszczalny dla błony kompleks wskaźnikowy Ca²⁺ (Fluo5N / Ca²⁺) przez wysoką aktywność esterazy, zatrzymując w ten sposób barwnik w wysokim stężeniu w świetle ER ^8,34. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania uwalniania wapnia przez szlaki IiCR, na przykład przez receptory metabotropowe, purynergiczne lub glutaminianu ^8,34 oraz do wizualizacji ubytku wapnia w ER bezpośrednio przez "kanały przeciekowe", na przykład po blokadzie SERCA ^17,34. Z naszego doświadczenia wynika, że wskaźnik Ca²⁺ o niskim powinowactwie Fluo5N-AM jest obecnie najlepszym dostępnym wskaźnikiem do stosowania w strategii ładowania barwnikiem TED. Fluo5N-AM ma niskie powinowactwo do Ca²⁺ (stała dysocjacji K_D ~ 90 μM, ryc. 2), jest prawie niefluorescencyjny w swojej postaci AM, ale zapewnia wysoką emisję fluorescencji po związaniu wapnia ^8,34. Kompleks Fluo5N/Ca²⁺ może być wzbudzany standardowym źródłem światła o długości fali ~490 nm, co odpowiada standardowym barwnikom, takim jak FITC, Alexa 488 lub eGFP. Cytozolowe sygnały wapniowe ledwo osiągają stężenie w niskim zakresie μM i dlatego są ledwo wykrywane przez Fluo5N w cytozolu ³⁵.

Aby poprawić wydajność TED, opracowano kilka rekombinowanych konstrukcji wektorowych (Rysunek 3). Pierwotnie, wektory TED oparte na sekwencji kodowania CES2 (numer dostępu Refseq NM_145603, CES2c) i najlepsze wyniki TED są obserwowane przy stabilnej ekspresji konstrukcji CES. Nowe wektory TED wyrażają podstawowy element CES2 połączony z białkiem czerwonej fluorescencji TagRFP-T2 ³⁶. Wektory te mają tę zaletę, że mogą być wykorzystywane do identyfikacji transdukowanych komórek i do wykorzystania czerwonej fluorescencji jako wewnętrznej kontroli normalizacji zmian we fluorescencji Fluo5N / Ca^{2 +}. Czerwona fluorescencja daje również możliwość wizualizacji strukturalnego rozkładu ER i zmian dynamiki ER w warunkach stymulacji.

Protokół

Ten protokół wprowadza TED stosowany do linii komórkowych, neuronów hipokampa i komórek glejowych kory mózgowej. Wydajność TED jest najlepsza, gdy wektory TED są stabilnie wyrażane, na przykład przez wektory lentiwirusowe. Schematyczny przegląd metody TED przedstawiono na rysunku 4.

1. Przygotowanie roztworów

Następujące rozwiązania powinny być przygotowane przed rozpoczęciem i mogą być przechowywane zgodnie ze wskazaniami. Zwykle używamy sterylizowanego szkła i tworzywa sztucznego oraz wody autoklawowanej.

1. Przygotować HEPES-Ringer (w mM): 125 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO_{4,7H 2}O, 2 CaCl₂, 1,25 NaH₂PO₄. H₂O, 10 glukozy. H₂O. Bezwapniowy HEPES-Ringer składa się z (w mM): 127 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO, 4,7H2 O, 1,25 NaH₂PO₄. H₂O, 10 glukozy. H₂O i 0,1 EGTA. Bez glukozy roztwory do obrazowania mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C. Wymagana ilość D-glukozy jest świeżo dodawana przed użyciem.
2. Do analizy TED w neuronach hipokampa zaleca się sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF). ACSF składa się z (w mM): 127 NaCl, 23 NaHCO₃, 3 KCl, 2,5 NaHPO₄. H₂O, 25 D-glukoza.H₂O, 2 CaCl₂, 2 MgCl_2,7 H₂0 w ddH₂0.
3. Przygotować Fluo5N-AM do stężenia 5 mM. Aby wspomóc solubilizację, dodaj 8,9 μl 20% Pluronic F-127 (w DMSO, przechowywany w temperaturze pokojowej, chroniony przed wilgocią i światłem) do 50 μg liofilizowanego Fluo5N-AM. Następnie rozpuszczaj Fluo5N-AM za pomocą sonikatora w łaźni wodnej przez co najmniej 2 minuty. Przechowywać porcje po 0,5 μl w temperaturze -20 °C, chronić przed światłem i wilgocią.
4. W razie potrzeby przygotuj zapasy antagonistów i agonistów. Na przykład: a) 10 mM ATP lub ADP (w_H2O, metabotropowa aktywacja receptorów purynergicznych), b) 10 mM karbachol w_H2O(agonista receptora muskarynowego acetylocholiny), c) 30 mM kwas cyklopiazonowy (CPA) w DMSO (bloker SERCA), d) 50mM DHPG w PBS (agonista metabotropowego receptora glutaminianu dla mGluR_I i mGluR₅), e) 10 mM glutaminianu w_H2O, f) 1 mM jonomycyny w DMSO (jonofor), g) 5 mM tapsygarginy w DMSO (bloker o wysokim powinowactwie SERCA). Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
5. Wektory lentiwirusowe: Protokół ten obejmuje wykorzystanie lentiwirusowych cząstek wektora ekspresyjnego TED. Ich produkcja i przechowywanie nie jest częścią tego protokołu. Używamy wektorów lentiwirusowych drugiej generacji do transferu rekombinowanych karboksylesterazy do linii komórkowych, komórek glejowych i neuronów. Nasz układ lentiwirusowy opiera się na wektorze ekspresyjnym FUGW ³⁷ i plazmidach pakujących pCMVΔR8.91 lub psPAX2 i plazmidzie pseudotypowym pMD2.G ^38,39. ostrożność: Należy wziąć pod uwagę, że praca z rekombinowanymi, samoinaktywującymi wektorami lentiwirusowymi wymaga starannego rozważenia wytycznych dotyczących bezpieczeństwa biologicznego. W wielu krajach wektory te są klasyfikowane jako grupa ryzyka zagrożenia biologicznego 2. Aby uzyskać więcej informacji, zapoznaj się z http://www.addgene.org/lentiviral/.

2. Przygotowanie i infekcja wirusowa neuronów hipokampa myszy

1. Myć szklane szkiełka nakrywkowe na szklanej szalce Petriego o średnicy 20 cm (100 szkiełek nakrywkowych na naczynie) 1x w 70% etanolu przez około 30 minut. Na koniec dodaj 100% etanolu (rocznie) przez 2 minuty. Usuń resztki etanolu i wysusz szkiełka nakrywkowe pod sterylnym kapturem.
2. Przygotuj dwa różne rodzaje pożywki do hodowli neuronów hipokampa: (a) podłoże neurobazalne z witaminą B27 1:50; (b) pełne podłoże: podłoże neurobazalne z witaminą B27 1:50, Glutamax 1:100 i suplementem N2 w stosunku 1:100. Sterylne przefiltrować pożywkę i przechowywać ją w inkubatorze komórkowym do czasu użycia.
3. Na jeden dzień przed sekcją szkiełka nakrywkowe przygotowuje się, umieszczając najpierw jedno sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 mm w każdym dołku 4-dołkowego naczynia do hodowli komórkowych. Następnie ostrożnie pokryj każde szkiełko nakrywkowe 80-100 μl 0,1% poli-L-lizyny i przechowuj naczynia w inkubatorze przez noc.
4. W dniu preparacji i hodowli komórkowej należy rozpocząć od trzykrotnego przemycia szkiełek nakrywkowych 100 μl HBSS i przenieść 100 μl podłoża neurobazalnego do każdego szkiełka nakrywkowego. Umieść szalki w inkubatorze w celu zrównoważenia (np. podczas sekcji myszy).

Sekcja

Przeprowadzamy nasze eksperymenty na myszach zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej, zatwierdzonymi przez nasz instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.

5. Usuń cały mózg i rozkrój hipokamp obustronnie.
6. Ostrożnie usunąć wszelkie opony mózgowe i tkanki inne niż hipokamp i umieścić po jednym hipokampie w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 450 μl HBSS. Przechowywać tkankę na lodzie do momentu wyizolowania wystarczającej liczby hipokampów.

Hodowla komórkowa

7. Do każdej probówki dodać 50 μl 1% trypsyny (Worthington) i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Od czasu do czasu wstrząsaj probówkami. Aby zatrzymać reakcję trawienia, dodaj 50 μl 1% inhibitora trypsyny do każdej probówki i kilkakrotnie odwróć probówkę.
8. Przenieś wszystkie tkanki z maksymalnie 5 hipokampów do jednej 15 ml probówki sokoła, unikając przenoszenia płynu. Dodać pożywkę B27 (a) do końcowej objętości 5 ml.
9. Rozetrzeć tkankę za pomocą wypolerowanej ogniowo szklanej pipety Pasteura, ostrożnie pipetując w górę iw dół. ostrożność: Unikaj pęcherzyków powietrza!
10. Wirować z 400 x g przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki B27 (a).
11. Ponownie rozwarstwić tkankę szklaną pipetą, a następnie dwukrotnie za pomocą plastikowej końcówki filtrującej o pojemności 1 000 μl. Wykonaj tę czynność zgodnie z opisem w krokach 2.9 i 2.10.
12. Po ostatnim odwirowaniu ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pełnej pożywki (b) i rozcierać komórki za pomocą plastikowej końcówki filtrującej o pojemności 200 μl. Aby oddzielić pozostałe grudki komórek od zawiesiny jednokomórkowej, pozwól grudkom komórek osiąść na 1-2 minuty.
13. Policz komórki i oblicz całkowitą liczbę komórek potrzebnych do infekcji wirusowej. Do obrazowania TED należy użyć 25 000 komórek na 10 mm szkiełka nakrywkowego.
14. W tym momencie zaleca się posiewanie dodatkowych 25 000 nietransdukowanych komórek jako kontroli.

Infekcja wirusowa

15. Przenieść zawiesinę komórkową do infekcji wirusowej do świeżej probówki sokoła o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty przy 400 x g.
16. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce o objętości 300 μl (b)
17. Dodać odpowiednią ilość zakaźnych cząstek lentiwirusowego wektora ekspresji TED i pozostawić probówkę Falcon w temperaturze pokojowej na 10 minut.
18. Napełnić probówkę pełnym podłożem (b) do końcowej objętości potrzebnej do posiewu (100 μl na każde 10 mm szkiełko nakrywkowe), odessać pożywkę z szkiełka nakrywkowego i natychmiast umieścić 100 μl zawiesiny komórek na każdym szkiełku nakrywkowym.
19. Umieścić naczynia w inkubatorze, aż wszystkie komórki się uspokoją (ok. 2 godziny) i ostrożnie napełnić szalki, aż będą zawierały 2 ml pożywki (b).
20. Pozwól neuronom rosnąć przez co najmniej tydzień. Wymieniaj 50% podłoża co tydzień.

3. Hodowla i infekcja wirusowa komórek glejowych kory myszy

Przygotowanie

1. Zacznij od przygotowania podstawowej pożywki glejowej (mieszanina 1:1 DMEM/F12 z 10% FCS, 5% HS, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,45% glukozy) i pokrycia kolby do hodowli komórek T75 4 ml bromowodorku poli-DL-ornityny 0,5 ng / ml (PORN) (rozcieńczonego w 150 mM roztworze kwasu borowego, pH 8,35). Po inkubacji w temperaturze 37 °C przez 2 godziny lub przez noc, przemyć kolbę hodowli komórkowej trzykrotnie HBSS i dodać 18 ml podstawowej pożywki glejowej zawierającej B27 w stosunku 1:50 i 10 ng/ml EGF. Wyrównać kolbę do hodowli komórkowej w inkubatorze (do 3 godzin).

Sekcja

1. Nasze eksperymenty na myszach przeprowadzamy zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej, zatwierdzonymi przez naszą instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania.
2. Przeprowadź sekcję mózgu jednej myszy P5-P7 i usuń hipokamp i opony mózgowe z obu półkul, jak opisano w 2.5.
3. Wypreparuj korę czołową, pokrój ją na kilka małych kawałków i zbierz je do 1,5 ml probówki zawierającej HBSS. Przechowuj probówkę na lodzie i przejdź do części dotyczącej hodowli komórkowych.

Hodowla komórkowa

4. Przenieś całą tkankę z probówki do probówki Falcon o pojemności 15 ml za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo.
5. Dodać podłoże podstawowe do końcowej objętości 5 ml i rozcierać tkankę, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo. Po odwirowaniu przy 300 x g przez 3 minuty, odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml podłoża podstawowego.
6. Powtórz krok 3.5 dwa razy.
7. Po trzecim odwirowaniu zawiesić osad komórkowy w 2 ml podstawowej pożywki glejowej zawierającej B27 (1:50) i 10 ng/ml EGF.
8. Ponownie miareczkować i przenieść zawiesinę komórkową do przygotowanej kolby do hodowli komórek T75 i pozwolić komórkom rosnąć przez 3-4 dni.

Mycie komórek glejowych (po 3-4 dniach w hodowli):

9. Umyć komórki raz 10 ml PBS i energicznie postukać lub delikatnie uderzyć kilka razy w kolbę ręką, trzymając ją mocno w drugiej ręce. Na tym etapie resztki komórek i skupiska komórek są usuwane z hodowli.
10. Odessać PBS i dodać świeżą bazalną pożywkę glejową zawierającą B27 (1:50) i 10 ng/ml EGF. Dalej uprawiaj kulturę przez 5-7 dni, aż komórki osiągną 80% zbieżności.

Podział, transdukcja i końcowe wysiewanie komórek glejowych:

11. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 10 mm pokryć 100 μl poli-D-lizyny (roztwór podstawowy: 0,1%, rozcieńczony w stosunku 1/50 do 20 μg/ml w PBS lub HBSS) i inkubować je w inkubatorze przez noc. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie HBSS i dodaj 100 μl bazalnego podłoża glejowego. Zrównoważyć szkiełka nakrywkowe w inkubatorze (3 godziny).
12. Przemyć komórki glejowe dwukrotnie 10 ml PBS, odessać PBS i dodać 3 ml trypsyny (TrypLE, nierozcieńczona). Trypsynizuj komórki do 1 minuty. UWAGA: Unikaj nadmiernej trypsynizacji. Zwykle ponad 80% wszystkich komórek odłącza się po 1 minucie, co wystarcza do posiadania kilku milionów zdrowych komórek.
13. Zatrzymać reakcję, dodając 10 ml podstawowej pożywki glejowej, przenieść zawiesinę komórkową do 15 ml probówki sokoła, odwirować przy 300 x g przez 3 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml podstawowej pożywki glejowej.
14. Ponownie odwirować i odessać zgodnie z opisem w kroku 3.15, a następnie ponownie zawiesić komórki w 5 ml podstawowej pożywki glejowej.
15. Przenieść wymaganą liczbę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Na jedno szkiełko nakrywkowe o średnicy 10 mm wystarczy 10^komórek glejowych 4-2x10. Zwykle objętość zawiesiny do transdukcji komórek dla jednej płytki 4-dołkowej jest mniejsza niż 200 μl. Dodać odpowiednią ilość cząstek lentiwirusowego wektora ekspresji TED do komórek i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie napełnić zawiesinę podstawowym podłożem glejowym do objętości wysiewu (100 μl na szkiełko nakrywkowe).
16. Wysiewać 100 μl zakażonych komórek na szkiełko nakrywkowe i inkubować przez około 2 godziny, a następnie dodać podstawową pożywkę glejową zawierającą B27 1:50 i 10 ng/ml EGF do końcowej objętości 2 ml.
17. Aby uzyskać idealne warunki hodowli, należy użyć komórek do eksperymentów w 3-7 dniu po posiewie.

4. Generacja i hodowla linii komórkowej reporterowej

Linie komórkowe reporterów TED zostały stworzone na podstawie HeLa, BHK21, Hek293 i SH-SY5Y. Tutaj podajemy protokół dla komórek HeLa, ale protokół może być również przeniesiony do dowolnej innej linii komórkowej.

Generacja stabilnej linii komórkowej HeLa

1. Podziel linię komórkową HeLa typu dzikiego i przenieś 100 000 komórek w objętości 200 μl do probówki o pojemności 1,5 ml.
2. Dodać odpowiednią ilość cząstek lentiwirusowego wektora ekspresji TED do probówki i inkubować zawiesinę wirusa komórkowego przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wysiewać komórki w łącznej objętości 2 ml pożywki (DMEM, 10% FCS, 1% penicyliny/streptomycyny) w naczyniu o średnicy 30 mm i inkubować przez 3 dni.
3. Po jednokrotnym umyciu PBS odessać pożywkę i dodać 500 μl trypsyny (TrypLE, 2:3 w PBS). Inkubować przez ok. 3 min, a następnie zatrzymać reakcję poprzez dodanie 3 ml pożywki. Przenieść zawiesinę do probówki sokoła o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 3 minuty.
4. Zawiesić osad komórkowy w podłożu o objętości 200 μl i ponownie zainfekować komórki cząstkami lentiwirusa, jak opisano w ppkt 4.2. Następnie komórki nasienne w kolbie do hodowli komórek T25 w pożywce o pojemności 10 ml.
5. Hoduj komórki, aż do osiągnięcia konfluencji 60-80%. Następnie podziel kulturę.

Linie komórkowe reportera TED

6. Linie komórkowe reporterowe TED mogą być utrzymywane w dowolnym standardowym pożywce, np. stosuje się DMEM zawierający 5% lub 10% FCS i 1% penicyliny/streptomycyny.
7. Umieścić odpowiednią liczbę komórek w 4-dołkowym naczyniu zawierającym sterylne szkiełka nakrywkowe o średnicy 10 mm (patrz wyżej), np. od 10 000 do 20 000 komórek na szkiełko nakrywkowe.
8. Hoduj komórki przez co najmniej dwa dni przed użyciem ich do obrazowania TED.

5. Przygotowanie do procedury obrazowania na żywo pod mikroskopem odwróconym

1. 1. Rozgrzej HEPES-Ringer do temperatury pokojowej i dodaj D-glukozę.
   2. Rozgrzej ACSF (bez Ca²⁺ i Mg²⁺⁾ do temperatury pokojowej i dodaj D-glukozę. Napowietrzaj ACSF karbogenem przez 5 minut. Następnie dodać 1 M roztwory podstawowe CaCl₂ i MgCl₂ do końcowych stężeń 2 mM każdy.
2. Uruchom mikroskopy obrazowania na żywo i wszystkie programy komputerowe.
3. Rozpocznij perfuzję w "atrapie" komory obrazowania i zrównoważ system probówek.
4. Podgrzej podgrzewacz roztworu w linii produkcyjnej i komorę obrazowania na stoliku mikroskopowym. Zamocuj komorę obrazowania we wkładzie grzewczym.
5. Wyrównaj system do 32-37 °C przed rozpoczęciem procedury ładowania barwnika. ostrożność: Aby uniknąć przypadkowego przepływu roztworu perfuzyjnego do systemu mikroskopowego, używamy gumek do włosów wokół obiektywów i elastomerowych arkuszy silikonowych (1 mm) w celu ochrony stolika mikroskopu.

6. Ładowanie barwnika dowolnego typu komórki

1. Zawiesić 1 porcję Fluo5N-AM (patrz 1.3) w 100 μl wstępnie ogrzanego roztworu do obrazowania (HEPES-Ringer lub ACSF).
2. Rozpuszczać Fluo5N-AM w roztworze do obrazowania (HEPES-Ringer lub ACSF) w sonikatorze w kąpieli wodnej przez 90 sekund.
3. Użyj świeżej płytki 4- lub 24-dołkowej i przenieś 400 μl wstępnie podgrzanego roztworu do obrazowania do jednego dołka. Dodać roztwór barwnika do tego samego dołka, aby uzyskać 500 μl roztworu o stężeniu 5 μM.
4. Ostrożnie umieścić szkiełko nakrywkowe z komórkami (np. o średnicy 10-18 mm) w studzience, komórkami skierowanymi do góry.
5. Inkubować przez odpowiedni okres czasu w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C (w międzyczasie przygotować warunki obrazowania na etapie mikroskopu). Typowe czasy ładowania barwnikiem wynoszą dla neuronów i komórek glejowych 7-15 minut, a dla linii komórkowych 10-20 minut.

KLUCZOWE: Czas ładowania barwnika i stężenie barwnika zależą od typu komórki, gęstości komórek i potrzeb specyficznych dla eksperymentu! Długi czas inkubacji w obecności barwnika może uszkodzić komórki, zwłaszcza neurony pierwotne i pierwotne komórki glejowe, co ma kluczowe znaczenie dla reakcji na bodźce fizjologiczne. Długie czasy inkubacji (np. 30 minut) będą przydatne tylko w eksperymentach z lokalizacją wapnia w ER w celu zbadania dystrybucji wapnia ER w małych strukturach subkomórkowych, np. drobnych neurytach lub kolcach. W niektórych eksperymentach mieszanina 1/3 pożywki wzrostowej z roztworem do obrazowania może pomóc w ochronie komórek podczas ładowania Fluo5N-AM.

6. Natychmiast przenieś szkiełko nakrywkowe do innej studzienki do hodowli komórkowych zawierającej roztwór do obrazowania (HEPES-Ringer lub ACSF) i rozpocznij montaż komórek w komorze obrazowania.

7. Obrazowanie żywych komórek ER-wapnia za pomocą odwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego

1. Użyj pędzla, aby nałożyć smar o wysokiej próżni na komorę obrazowania. Smar jest potrzebny do zamocowania szkiełka nakrywkowego na dnie komory perfuzyjnej. Używamy samodzielnie wykonanych komór obrazowania do szkiełek nakrywkowych o średnicy 10-12 mm i małej objętości, co pozwala na uzyskanie wysokich prędkości perfuzji do 15-krotnej wymiany buforu na minutę. Dostępną na rynku komorę perfuzyjną do szkiełek nakrywkowych 18 mm można zakupić w firmie Warner instruments (RC-49FS). Komora ta umożliwia również stymulację polową neuronów.
2. Weź szkiełko nakrywkowe z komórkami załadowanymi Fluo5N i dodaj niewielką kroplę roztworu do obrazowania (50-100 μl) na komórki, aby komórki były pokryte roztworem do obrazowania. Odwróć szkiełko nakrywkowe do góry nogami i zamontuj komórki w komorze obrazowania. Aby wcisnąć szkiełko nakrywkowe w klej silikonowy, użyj wacika (np. patyczków higienicznych).
3. Zetrzyj resztki buforu z dna szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą patyczków kosmetycznych. ostrożność: Ostrożnie zetrzyj resztki wilgoci podczas korzystania z obiektywu olejowego z dużą aperturą numeryczną do obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Resztki soli najlepiej usunąć wodą. Przypadkową plamę smaru można usunąć acetonem lub czystym etanolem.
4. Zamień "atrapę" komory obrazowania na eksperymentalną komorę obrazowania. Myj komórki przez 5-10 minut przez ciągłą perfuzję.
5. Myj komórki przez 5 - 10 minut przez ciągłą perfuzję.
6. Do wyboru komórek użyj minimalnego oświetlenia laserowego, wysokiej częstotliwości skanowania (2-4 Hz), małego rozmiaru obrazu i wysokiego wzmocnienia.
7. UWAGA: Do wyboru komórek znakowanych Fluo5N nie należy używać nadmiaru światła ani bezpośredniego oświetlenia światłem epifluorescencyjnym. Jasne oświetlenie kompleksów Fluo5N / Ca²⁺ powoduje całkowitą utratę fluorescencji specyficznej dla ER w ciągu 2-4 sekund (ryc. 5).
8. Ustaw mikroskop zgodnie z planowanym eksperymentem. Dla orientacji reprezentatywne ustawienia dla obrazowania z różnymi wektorami TED podano w tabeli 1. Do odwróconej skaningowej mikroskopii konfokalnej używamy mikroskopu Olympus IX81 połączonego z systemem konfokalnym Fluoview 1000, który jest wyposażony w lasery diodowe (473 nm, 15 mW; 559 nm, 20 mW) oraz system detektorów spektralnych.
9. Na początku eksperymentu udokumentuj interesujące komórki za pomocą stosów obrazów x,y-z o wysokiej rozdzielczości.
10. Wykonaj obrazowanie x,y-t, aby monitorować dynamikę wapnia ER w określonych warunkach eksperymentalnych. Typowe ustawienia dla naszego systemu są wymienione w Tabeli 2.
11. Monitoruj zmiany wapnia ER pod wpływem ciągłej perfuzji za pomocą roztworu do obrazowania. Typowe kursy wymiany buforu to przykładowo: (a) mycie komórek i wyczerpywanie się zapasów przez blok SERCA: 1,5 ml/min; b) stymulacja ATP/DHPG: 3 ml/min.
12. Preferencyjnie pozyskuj obrazy cyfrowe w trybie 12-bitowym (4096 wartości szarości). W przypadku równoległego obrazowania Fluo5N/Ca²⁺ i RFP, 8-bitowe obrazy (256 wartości szarości) mogą uratować system przed przepełnieniem danych.
13. Przechowuj obrazy szeregów czasowych na żywo w komórkach (x,y-t) lub stosy obrazów 3D (x,y-z) (do dystrybucji komórkowej kompleksów Fluo5N/Ca²⁺) w formacie zgodnym z ImageJ (np. tiff).

8. Przetwarzanie obrazów i analiza danych

1. Otwórz stos obrazów w programie ImageJ. W przypadku obrazowania wielokolorowego podziel kanały RGB, gdy zostaniesz o to poproszony przez ImageJ.
2. Zidentyfikuj swój region (regiony) zainteresowania (ROI) poprzez dokładne zbadanie stosów obrazów (np. za pomocą wykresu intensywności w funkcji czasu)
3. Użyj wtyczki Time-Series Analyzer, aby odczytać średnią intensywność pikseli w ROI (_{F raw}). W zależności od celu, narysuj ROI wokół całego ER lub małych regionów ER, np. ER dendrytów obwodowych regionów komórek. Uwzględnij również 1-3 ROI w obszarach bez komórek do odejmowania tła.
4. Oblicz średnią fluorescencję tła (F_b), obliczając średnią wartość fluorescencji ROI tła i odejmij wartość tła F_b od_{wartości F surowych}, aby uzyskać wartość F_roi.
5. Oblicz F₀, czyli podstawową fluorescencję komórek, obliczając średnią wartość od dziesięciu do 30 wartości fluorescencyjnych dla każdego ROI w stanie spoczynku.
6. Obliczyć względne zmiany fluorescencji skorygowane o tło przez ΔF/F₀ według wzoru:

7. Przedstaw względne zmiany fluorescencji jako ślad z ΔF/F₀ dla osi Y i czasem dla osi X.

Wyniki

Ten protokół zapewnia niezakłócające podejście do bezpośredniego obrazowania wolnego wapnia ER. Syntetyczne wskaźniki Ca^{2 +} o niskim powinowactwie są uwalniane i zatrzymywane w świetle ER za pomocą ukierunkowanej na ER, rekombinowanej aktywności enzymu esterazy. Ulepszone ładowanie barwników wskaźnikowych Ca²⁺ do światła ER umożliwia bezpośrednie i szybkie obrazowanie dynamiki magazynowania wapnia w ER.

Typy komórek dla TED

Wykonalność metody zost...

Dyskusja

Zalety i wady metody TED zostały obszernie omówione w najnowszych publikacjach ^34,35. W porównaniu z innymi metodami opisanymi powyżej, TED omija problem zakłócania i perfuzji komórek. Ponadto należy podkreślić dwa aspekty. Zasada TED do obrazowania wapnia ER wymaga (1.) ukierunkowanej ekspresji aktywnej karboksyloesterazy w świetle ER za pomocą konstruktów wektorowych TED oraz (2.) wydajnego i preferencyjnego uwalniania syntetycznych estrów AM barwników wapniowych o niskim powinowactwie w świetle ER.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(S)-3,5-DHPG (Dihydroksyfenyloglicyna)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, hydrat soli disodowej ATP	Sigma	A26209-1G
B-27, 50x	Invitrogen	17504-044
Chlorek karbamoylcholiny (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Kwas cyklopiazonowy (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM z Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco's PBS bez Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Surowica cielęca płodu	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ g	Invitrogen	F14204
Glutaminian	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Mieszanka składników odżywczych Ham's F12	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) bez Ca, bez Mg, z czerwienią fenolową, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Surowica dla koni	SHD3250YK	Linearis
Ionomycyna Sól Ca2+	Ascent scientific	Asc-116
mysi suplement EGF	PreproTech	315-09
N2 100x	Invitrogen	17502-048
Podłoże neurobazalne	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, niska absorbancja UV, 2g	Invitrogen	P6867
Bromowodorek poli-DL-ornityny PORN	Sigma	P8638
Bromowodorek poli-D-lizyny	Sigma	P7280
Poli-L-lizyna	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsyna	Worthington	LS-003707
Trypsynininhibitor z Glycine MAX (soja)	Sigma	T6522
Materials
System konfokalny: odwrócony laserowy mikroskop skaningowy: FV1000 z konfiguracją IX81	Olympus		dostosowaną do potrzeb użytkownika
System konfokalny: sumator laserowy FV10 i lasery diodowe (405, 473, 559, 635)	Olympus		konfiguracja specyficzna dla użytkownika
System konfokalny: głowica skanująca FV10-SPD z wykrywaczem spektralnym	Konfiguracja specyficzna dla użytkownika	Olympus
Sterownik grzałki TC-344B	Warner Instruments	64-0101	do sterowania grzałką roztworu w linii
Oprogramowanie	NIH ImageJWS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Cel: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Cel: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Cel: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Komora perfuzyjna, odwrócona	zamówienie
Komora perfuzyjna, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Rurka perfuzyjna: PT-49	Warner Instruments	64-1730	do perfuzji
Pompa perystaltyczna MiniPlus 3 (4 kanały)	Pompa perfuzyjna	Gilson	n.a.
Pojedyncza grzałka roztworu liniowego SH-27B	Warner Instruments	64-0102	sterowany sterownikiem grzałki
Rury ssące: ST3R	Warner Instruments	64-1407	do perfuzji
Wkład grzewczy: Tempocontrol 37-2 cyfrowy 2-kanałowy	Pecon	n.a.