Bezpośrednie dokomorowe dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Podsumowanie

Opisujemy metodę kierowania leków do ośrodkowego układu nerwowego poprzez wszczepienie cewnika lub wykonanie wstrzyknięcia bolusa do prawej bocznej komory u myszy. Skupiamy się w szczególności na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych. Technika ta można łatwo dostosować do innych leków i szczurów.

Streszczenie

Ze względu na niemożność przekroczenia bariery krew-mózg, niektóre leki muszą być bezpośrednio dostarczane do ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Nasze laboratorium koncentruje się w szczególności na oligonukleotydach antysensownych (ASO), chociaż techniki pokazane na filmie mogą być również wykorzystywane do dostarczania wielu innych leków do OUN. Oligonukleotydy antysensowne (ASO) mają zdolność do powalania celów specyficznych dla sekwencji ¹, a także do zmiany proporcji izoform określonych genów ². Aby osiągnąć powszechne knockdown lub splicing genów w OUN myszy, ASO mogą być dostarczane do mózgu za pomocą dwóch oddzielnych dróg podawania, z których obie pokazujemy na filmie.

Pierwszy używa pomp osmotycznych Alzet, połączonych z cewnikiem, który jest chirurgicznie wszczepiany do bocznej komory. Pozwala to na ciągłe podawanie ASO do OUN przez określony czas. Drugi polega na pojedynczym wstrzyknięciu w bolusie wysokiego stężenia ASO do prawej komory bocznej. Obie metody wykorzystują układ komorowy mózgu myszy do dostarczania ASO do całego mózgu i rdzenia kręgowego, chociaż w zależności od potrzeb badania, jedna metoda może być preferowana nad drugą.

Wprowadzenie

Niektóre leki nie są w stanie przekroczyć bariery krew-mózg (BBB), co wymaga bezpośredniego dostarczenia do ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Aby obejść barierę krew-mózg, leki mogą być dostarczane bezpośrednio do mózgu przy użyciu opisanych metod. Podczas gdy nasze laboratorium i artykuł opisany w niniejszym dokumencie koncentrują się na oligonukleotydach antysensownych (ASO), inne leki, takie jak małe cząsteczki, przeciwciała, wektory terapii genowej itp., mogą być również dostarczane za pomocą dokładnie tego samego podejścia.

Niektóre białka odgrywają zasadniczą rolę w patogenezie chorób neurodegeneracyjnych. Takie białka często tworzą toksyczne gatunki i gromadzą się w agregaty, prowadząc do ostatecznej śmierci neuronów i późniejszej choroby neurologicznej ^3-4. W celu spowolnienia lub nawet zatrzymania postępu tych chorób, jedną z opcji terapeutycznych może być bezpośrednie ukierunkowanie i zmniejszenie białka wywołującego. Jednak białka te często znajdują się wszędzie w OUN, co utrudnia skuteczne ich zwalczanie w skali globalnej.

Aby celować w geny w całym OUN, podajemy ASO do płynu mózgowo-rdzeniowego myszy (CSF) przez boczną komorę, aby ominąć barierę krew-mózg. Ta specyficzna metoda wykorzystuje układ komorowy myszy, który obmywa cały mózg i rdzeń kręgowy, umożliwiając szeroką dystrybucję ASO. Używamy ASO, które są 18-20 cząsteczkami podobnymi do merów RNA, które bezpośrednio wiążą docelową sekwencję mRNA i, w zależności od modyfikacji chemicznych ASO, albo A) rekrutują RNazę-H do degradacji mRNA prowadzącą do knockdownu, albo B) przesuwają alternatywny splicing ^1,2,16,17. Należy zauważyć, że istnieje wiele cząsteczek do powalania określonego białka in vivo, w tym shRNA. Ponieważ te cząsteczki nie są przedmiotem tego artykułu, kierujemy czytelnika do przejrzenia artykułów, które lepiej opisują mechanizmy działania knockdown oraz zalety/wady każdej z ^nich.

W poprzednich pracach używaliśmy ASO do celowania w białkową dysmutazę ponadtlenkową 1 (SOD1) w transgenicznym szczurzym modelu stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) ⁷ (Rysunek 4). Mutacje w SOD1 występują w około 2% wszystkich przypadków ALS ⁸, chociaż ostatnio wysunięto hipotezę, że SOD1 może również odgrywać ważną rolę w sporadycznym ALS ^9-10. Poprzez zmniejszenie całkowitego poziomu SOD1 u transgenicznego szczura z ALS, przeżycie po wystąpieniu choroby znacznie się zwiększyło ⁷. Te ważne dane były pierwszymi, które pokazały, że leczenie ASO w OUN może mieć głęboki pozytywny wpływ na model choroby neurologicznej. Od tego czasu ASO ukierunkowane na SOD1 u ludzi weszły w fazę I badania klinicznego na ludziach z minimalnymi skutkami ubocznymi (Clnicaltrails.gov NCT01041222), jak zaprezentowano na 64. dorocznej konferencji American Academy of Neurology w 2012 r. Obecnie trwają prace nad przejściem ASO do fazy II badań.

Podczas gdy celowanie w SOD1 było pierwszym dowodem użycia ASO do leczenia chorób neurologicznych, od tego czasu przeprowadzono kilka innych badań, które dotyczyły różnych chorób i ich odpowiednich celów białkowych. W 2010 i 2011 roku ASO, które przesuwają splicing przeżycia białka neuronu ruchowego 2 (SMN2), zastosowano w transgenicznych mysich modelach rdzeniowego zaniku mięśni (SMA) i spowodowały znaczną poprawę fenotypów choroby ^11,12. Te splicing ASO są obecnie w fazie I badań klinicznych u dzieci z SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Dodatkowo, niedawno wykazano, że przejściowe podawanie ASO ukierunkowanych przeciwko genowi huntingtyny było w stanie radykalnie uratować mysi model Huntingtona, nawet po tym, jak poziom białka huntingtyny powrócił do wartości wyjściowej ¹³.

We wszystkich tych badaniach, ASO były dostarczane do bocznej komory, aby zmniejszyć całkowity poziom genów lub zmienić splicing genów przez cały OUN. Zarówno pompy osmotyczne, jak i pojedyncze wstrzyknięcie bolusa mogą być używane do dostarczania ASO do płynu mózgowo-rdzeniowego. Pompy pozwalają na powolne, ciągłe podawanie, podczas gdy bolus domózgowo-komorowy (ICV) to szybkie, jednorazowe wstrzyknięcie. Z powodzeniem zastosowaliśmy obie te metody, chociaż nie odnotowaliśmy bezpośredniego porównania między pompą a bolusem w jednej linii transgenicznej.

Używanie ASO w CNS to skuteczny sposób na zmniejszenie całkowitego poziomu białka i/lub zmianę splicingu kilku białek. Chociaż używamy ASO wyłącznie w leczeniu zaburzeń neurologicznych, zdajemy sobie sprawę, że inne dziedziny również mogą skorzystać z tej techniki. Tak długo, jak białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji w OUN, a ostatecznym celem jest osiągnięcie zmian w ekspresji genów w całym OUN, zastosowanie ASO w zademonstrowanych technikach może być bardzo przydatne.

Protokół

Poniższy protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Waszyngtońskim w St Louis i jest zgodny z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych. Jeśli po raz pierwszy wykonujesz operacje, zalecamy zapoznanie się z artykułem JoVE na temat operacji na gryzoniach jako wprowadzeniem przed rozpoczęciem ¹⁴ roku.

ASO mogą być dostarczane do ośrodkowego układu nerwowego myszy zarówno poprzez infuzję pompy osmotycznej, jak i pojedyncze wstrzyknięcie bolusa ICV. Z tego powodu procedura opisana poniżej jest podzielona na dwa segmenty. Plusy i minusy każdej metody zostaną omówione w sekcji Dyskusja. Współrzędne używane w protokołach dotyczą dorosłych myszy C57BL6 i B6C3. Odpowiednie współrzędne szczura można znaleźć w tabeli 1.

POMPA OSMOTYCZNA ALZET

1. Przygotowanie pomp osmotycznych Alzet

1. Połóż sterylną serwetę i ostrożnie upuść na nią następujące przedmioty, uważając, aby niczego bezpośrednio nie dotknąć, aby zachować sterylność: pompę osmotyczną (pompy), modulator (modulatory) przepływu, sterylną strzykawkę (strzykawki) o pojemności 1 ml, ostrze skalpela i odcinki rurki (1 sztuka rurki = 5 pompek). W przypadku myszy istnieją trzy opcje pomp: 14 dni, 28 dni i 42 dni (rysunek 2A).
2. Odkręć i napełnij sterylne probówki stożkowe o pojemności 50 ml 15-20 ml roztworem soli fizjologicznej. Do jednej stożkowej rury można dodać do 6 zmontowanych pomp.
3. Napełnij szalkę Petriego p60 100% etanolem. Dodać odpowiednią liczbę cewników do etanolu. W przypadku myszy długość cewnika wynosi 2,5 mm.
4. Przefiltruj każdy ASO do tylu probówek Eppendorf o pojemności 1,5 ml, ile potrzeba. Dołącz probówkę Eppendorf wypełnioną sterylnym 0,9% soli fizjologicznej, aby napełnić rurkę.
5. Gdy wszystko jest już przygotowane, załóż sterylne rękawiczki. Upewnij się, że nie dotykasz niczego, co nie jest sterylne. W razie potrzeby zmień rękawice.
6. Dla każdego ASO, które ma być użyte, napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml i pompki, umieszczając igłę w górnym otworze i powoli napełniaj, aż nadmiar wycieknie. Kontynuuj, aż wszystkie pompy zostaną napełnione.
7. Odkręć modulatory przepływu i włóż je do pomp. Wsunąć modulator przepływu prawie do końca, pozostawiając odstęp 3-5 mm.
8. Za pomocą ostrza skalpela pokrój każdy kawałek rurki na 5 równych segmentów. Weź jeden kawałek rurki, napełnij sterylną solą fizjologiczną za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i włóż górną część modulatora przepływu do jednego końca rurki. Następnie wyjmij kaniulę z etanolu i podłącz ją do drugiego końca rurki. Pompa jest teraz w pełni zmontowana.
9. Umieść w pełni zmontowaną pompę w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml z solą fizjologiczną w celu zalania. Zalewanie pozwala pompom wchłonąć płyn, aby zainicjować dostarczanie leku, a także osiągnąć odpowiednią temperaturę. Czas zalewania: 14 pomp dniowych: 4-6 godzin, 28 pomp dniowych: 40 godzin, 42 pomp dniowych: 60 godzin. Po zakończeniu montażu pomp zakryj stożkowe rurki i umieść w czystej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do czasu zabiegu.

2. Zabieg przedoperacyjny

1. Przetrzyj wszystko 70% etanolem, aby wysterylizować obszar i połóż sterylne zasłony na blacie stołu i stereotax, aby stworzyć sterylne pole. Ważne jest, aby pamiętać o sterylnym polu podczas całego zabiegu. Włącz następujące elementy: sterylizator kulkowy, poduszkę grzewczą, światło, odczyt cyfrowy i system tlenu/izofluranu (rysunek 1).
2. W przypadku wykonywania pojedynczej operacji lub całej serii operacji, jak to zwykle robimy, wymagane będą następujące elementy: 1 para kleszczy, 1 zakrzywiony hemostat, 1 para małych nożyczek, 1 para małych zakrzywionych nożyczek, 1 obcinak do kości szczura, 1 hemostat prosty, 5-0 szwy nylonowe, 1 stożkowe rurki z 70% etanolem, 1 stożkowa tubka z 95% etanolem, 1 stożkowa rurka z jodem, 1 stożkowa rurka z nadtlenkiem wodoru, opakowanie sterylnych wacików bawełnianych, 1 butelka super kleju, 1 tubka maści antybiotykowej, 1 tubka lubrykantu do oczu i 1 golarka elektryczna.
3. Umieść końcówki obu par nożyczek, kleszczyków i zakrzywionego hemostatu w sterylizatorze perełkowym na 15 sekund. Wyjmij i umieść w 70% etanolu. W przypadku wykonywania więcej niż jednej operacji należy ponownie wysterylizować końcówki narzędzi między zwierzętami.
4. Obrócić izofluran do 4% i O₂ do 0,4 l/min i skierować przepływ gazu do komory. Nasz system izofluranowo-tlenowy jest kalibrowany co najmniej raz w roku, aby upewnić się, że podajemy odpowiednią ilość znieczulenia. Umieść mysz w komorze i poczekaj, aż oddech znacznie spowolni. Wyjmij mysz i uszczypnij palec u nogi, aby upewnić się, że mysz jest całkowicie nieprzytomna.
5. Ogol włosy od czubka ramienia do przestrzeni między oczami. Jeśli mysz zacznie się budzić, umieść ją z powrotem w komorze, aż mysz znów będzie całkowicie nieprzytomna, potwierdzając uszczypnięciem palca u nogi. Umieść znieczuloną mysz na stereotakcie i wsuń stożek nosowy na nos. Bądź delikatny, ponieważ zęby i kości są kruche.
6. Skieruj przepływ gazu do stereotax, aby utrzymać mysz w stanie znieczulenia. Ważne jest, aby od czasu do czasu sprawdzać, czy mysz jest całkowicie nieprzytomna z uszczypnięciem palca u nogi podczas całej operacji. Zabezpiecz głowę za pomocą nauszników. Preferujemy wypoziomowanie nauszników, chociaż aby celować w komorę boczną, idealnie wypoziomowana czaszka nie jest konieczna ze względu na duży rozmiar komory.
7. Zmniejsz poziom izofluranu do 2,0% w celu konserwacji. Nanieś maść na oko na każde oko. Jak widać na filmie, połóż sterylną zasłonę na myszy tak, aby odsłonięta była tylko podstawa szyi i głowy. Następnie zdezynfekuj obszar operacyjny, wycierając czubek głowy i szyję okrężnymi ruchami, zaczynając od środka ogolonego obszaru i przesuwając się najpierw na zewnątrz bawełnianym wacikiem zamoczonym w 95% etanolu, a następnie bawełnianym wacikiem zamoczonym w jodzie.
8. Zalecamy stosowanie systemu ogrzewania z kontrolowaną temperaturą sprzężenia zwrotnego sondy doodbytniczej, który zapewnia, że temperatura myszy pozostaje na stabilnym poziomie 37 °C. Jeśli temperatura myszy spadnie podczas operacji, rekonwalescencja po operacji może potrwać dłużej, a wynikająca z tego hipotermia może prowadzić do nieprawidłowej aktywności białka, w tym hiperfosforylacji białka związanego z mikrotubulami Tau¹⁵. Po skonfigurowaniu systemu grzewczego jesteś teraz gotowy do rozpoczęcia zabiegu.

3. Implantacja pompy osmotycznej Alzet

1. Przed przystąpieniem do zabiegu należy założyć nową parę sterylnych rękawiczek. Następnie, za pomocą kleszczy i małej pary nożyczek, wykonaj nacięcie w skórze od podstawy szyi nad czaszką zwierzęcia do góry między oczami
2. Weź nożyczki z krzywizną skierowaną do góry i wsuń się pod skórę u podstawy szyi z powrotem w kierunku lewej kończyny tylnej. Nie powinno być żadnego oporu. Jeśli tak, wyjmij nożyczki i spróbuj ponownie. Tworzy to kieszeń podskórną dla pompy osmotycznej.
3. Wytrzyj czaszkę do czysta sterylnymi bawełnianymi wacikami, a następnie bawełnianym wacikiem zamoczonym w nadtlenku wodoru, aby wzmocnić bregma.
4. Wytrzyj stożkowe probówki o pojemności 50 ml, w których znajdują się pompki, aby zachować ich sterylność. Ostrożnie wyjmij pompkę z rurki stożkowej za pomocą zakrzywionego hemostatu, zwracając szczególną uwagę, aby pompa nie dotykała boków rurki stożkowej. Przytrzymaj podstawę pompy za pomocą kleszczy i popchnij modulator przepływu do końca za pomocą zakrzywionego hemostatu.
5. Trzymaj pompę w miejscu, w którym modulator przepływu i rurka stykają się z zakrzywionym hemostatem. Włóż pompkę pod skórę u podstawy szyi i popchnij ją z powrotem w kierunku lewej kończyny tylnej tak daleko, jak to możliwe, bez oporu. Uważaj, aby cewnik niczego nie dotykał.
6. Za pomocą zakrzywionego hemostatu chwyć kaniulę w rowku, w którym górna część styka się z cokołem. Przesuń sterownik kaniuli na miejsce i zabezpiecz na miejscu.
7. Umieść pojedynczą kroplę super kleju na podstawie kaniuli. Wciśnij górną część kaniuli do sterownika i ustaw tak, aby rurka była skierowana prosto do tyłu.
8. Dotknij końcówki cewnika do bregma i wyzeruj współrzędne na wyświetlaczu cyfrowym. Podnieś cewnik i przesuń go o 1,1 mm w bok w prawo i 0,5 mm do tyłu (ryc. 2B). Trzymaj skórę z dala od drogi za pomocą zakrzywionego hemostatu.
9. Przeprowadź cienki metalowy cewnik przez czaszkę, aż plastikowa podstawa kaniuli zostanie bezpiecznie dociśnięta do górnej części czaszki. Metalowy cewnik może być wprowadzany bezpośrednio przez czaszkę u myszy ze względu na stosunkowo cienką czaszkę. Jeśli używasz szczurów, wywierć otwór w czaszce przed opuszczeniem cewnika.
10. Odciągnij skórę, na której znajduje się klej, od czaszki. Gdy sterownik kaniuli przytrzymuje kaniulę/cewnik na miejscu, odczekaj 1-2 minuty, aż klej całkowicie wyschnie.
11. Podczas ćwiczeń, aby ocenić umiejscowienie cewnika, wstrzyknij 20-40 μl 2,5% barwnika FastGreen Dye przez rurkę (ryc. 2C). Odczekaj 2-3 minuty, przelej mysz 1X PBS 0,03% heparyny i usuń mózg. Przeciąć koronowo w miejscu cewnika. Jeśli cewnik został umieszczony w komorze, barwnik zostanie ukrwiony w całym układzie komorowym myszy (ryc. 2D).
12. Przytrzymaj cewnik na miejscu z zakrzywionym hemostatem, jednocześnie podnosząc sterownik. Powoli zwolnij hemostat, aby upewnić się, że kaniula jest prawidłowo przymocowana do czaszki.
13. Za pomocą bawełnianego wacika dociśnij górną część kaniuli. Dopasuj maszynkę do strzyżenia kości szczura do rowka między górną a dolną częścią kaniuli. Odetnij górną część kaniuli, nadal dociskając bawełnianym wacikiem. Staraj się trzymać maszynkę do strzyżenia poziomo, aby nie odczepić kaniuli od czaszki. Jeśli kaniula zostanie odklejona, szybko przyklej ją ponownie i dociśnij bawełnianym wacikiem przez dodatkowe 2 minuty.
14. Używając nici do szwów 5-0, zwykłego hemostatu i kleszczy, zszyj wzdłuż pełnego otworu, zwracając szczególną uwagę tuż nad kaniulą. Używamy poziomego szwu materacowego do biegania (patrz ryc. 5) ze względu na większe nacięcie nad czaszką.
15. Nałóż odrobinę maści z antybiotykiem na głowę i szyję. Odkręć nauszniki i poluzuj stożek nosowy. Wyjmij mysz ze stereotaxa i umieść ją na podkładce rozgrzewającej w celu odzyskania. Uważnie monitoruj myszy przez cały czas rekonwalescencji, zwykle od 10 do 30 minut. Sprawdzaj co 2-3 minuty, aż mysz zacznie chodzić i pielęgnować się.

4. Opieka pooperacyjna

1. Monitoruj myszy codziennie po operacji przez pierwszy tydzień.
2. Jeśli mysz wydaje się odczuwać ból lub niepokój, zalecamy podanie jej podskórnego zastrzyku 5 mg/kg karprofenu raz na 24 godziny przez okres do 5 dni w celu złagodzenia bólu.
3. Jeśli wydaje się, że występuje infekcja, codziennie obficie nakładaj maść z antybiotykiem na obszar i skonsultuj się z lekarzem weterynarii, aby upewnić się, że rana prawidłowo się goi.
4. Usuń nylonowy szew 5-0 7-10 dni po zabiegu, aby zapobiec podrażnieniu nici szwu.

5. Wymiana lub demontaż pompy osmotycznej Alzet

Po zakończeniu aktywnego napełniania ASO, pompa może zostać zmieniona lub całkowicie usunięta.

1. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą przedoperacyjną, co powyżej, z następującymi zmianami: 1) nie będziesz potrzebować zakrzywionych nożyczek, zakrzywionych hemostatów, obcinaczy kości szczurów ani wyświetlacza cyfrowego, oraz 2) zamiast przygotowywać głowę myszy, ogol i zdezynfekuj tył myszy na styku pompy i rurki.
2. Wykonaj 1,5 cm nacięcie z tyłu myszy, prostopadle do złącza pompa/rurka, za pomocą kleszczy i nożyczek. Ostrożnie wyciągnij pompę z nacięcia, nie ciągnąc znacząco/nie naciskając na rurkę, ponieważ może to spowodować uszkodzenie cewnika.
3. Aby wyjąć pompę, przypnij rurkę około 0.5 cm nad modulatorem przepływu i przyłóż klej do rurki, aby ją uszczelnić. Odczekaj 1-2 minuty, aż klej wyschnie. Umieść rurkę z powrotem w nacięciu i zamknij szew. Nanieś maść z antybiotykiem na zszytą skórę i umieść mysz na podgrzewanej podkładce regeneracyjnej.
4. Aby wymienić pompę, przygotuj świeżo przygotowane pompy wraz z 10 cm naczyniem wypełnionym 95% etanolem. W przypadku nowych pomp cewniki nie są potrzebne.
5. Chwyć nową pompę za pomocą kleszczy. Zanurz palce w etanolu, chwyć pompę i wyrzuć modulator przepływu. Następnie ostrożnie i powoli zdejmij starą pompę z modulatora przepływu podłączonego do rurki i kaniuli. Jak tylko zostanie wyłączony, powoli wsuń nową pompę, upewniając się, że modulator przepływu nigdy nie dotyka zewnętrznej części myszy.
6. Ponownie włóż nową pompę przez nacięcie z powrotem do opakowania podskórnego i zszyj skórę. Nałóż maść z antybiotykiem na ranę i umieść mysz na podkładce regeneracyjnej.
7. Podobnie jak w przypadku implantacji pompy, należy codziennie monitorować myszy po operacji, aby sprawdzić, czy nie ma bólu/dyskomfortu i infekcji. Leczenie karprofenem i antybiotykami, jeśli uzna się to za konieczne.

bolus ICV

6. Zabieg przedoperacyjny

1. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą przedoperacyjną, jak w sekcji 2 powyżej, z następującymi zmianami: 1) nie będziesz potrzebować zakrzywionych nożyczek, zakrzywionych hemostatów ani obcinaczy kości szczurów; 2) wyczyść strzykawkę i igłę Hamiltona o pojemności 10 μl wysterylizowaną wodą i załaduj ASO; oraz 3) podłączyć strzykawkę i igłę do aparatu stereotaktycznego, w którym znajdował się sterownik kaniuli.

7. Wstrzyknięcie bolusa ASO

1. Za pomocą kleszczy i małej pary nożyczek wykonaj nacięcie od podstawy szyi do między oczami.
2. Wytrzyj czaszkę do czysta sterylnymi bawełnianymi wacikami, a następnie bawełnianym wacikiem zamoczonym w nadtlenku wodoru, aby wzmocnić bregma.
3. Przesunąć strzykawkę/igłę na miejsce i zabezpieczyć. Upewnij się, że ścięta część igły jest skierowana do tyłu. Opuścić igłę, aż dotknie bregmy. Wyzeruj wszystkie współrzędne. Przesunąć igłę w bok w prawo na 1,0 mm i do przodu na 0,3 mm (Rysunek 3A).
4. Powoli wbijaj igłę w czaszkę, aż otwór na igłę zrówna się z górną częścią czaszki. Ponownie, można to zrobić ze względu na cienką czaszkę myszy. Wyzeruj współrzędną Z i opuść wskazówkę do -3,0 mm z prędkością 1 mm/s (Rysunek 3B). Odczekaj 2-3 minuty, aż mózg uszczelni się wokół igły.
5. Dostarcz pełne 10 μl ASO w tempie 1 μl na sekundę. Odczekaj 2-3 min. W przypadku ASO do komory stosuje się dawkę 1 μl, chociaż szybkość ta może się różnić w zależności od leku. Podczas ćwiczeń sprawdź, czy igła jest prawidłowo umieszczona, podając 10-20 μl 2,5% barwnika FastGreen. Perfuzję myszy z 1X PBS 0,03% heparyny wkrótce po infuzji barwnika i wykonanie sekcji koronalnych mózgu, aby sprawdzić, czy barwnik znajduje się w układzie komorowym (ryc. 3C).
6. Przyłóż bawełniany wacik do czaszki u podstawy igły. Podnosić igłę z szybkością 1 mm na sekundę. Gdy tylko igła znajdzie się poza czaszką, przetocz bawełniany wacik po otworze igły i przytrzymaj przez 1 minutę, aby zapobiec wyciekowi ASO.
7. Zszyj skórę szczelnie, nałóż maść z antybiotykiem i umieść mysz na podgrzanej podkładce regeneracyjnej. W zależności od stężenia ASO, pełne odzyskanie sprawności może zająć od 20 minut do kilku godzin.
8. Podobnie jak w przypadku implantacji pompy, należy codziennie monitorować myszy po operacji, aby sprawdzić, czy nie ma bólu/dyskomfortu i infekcji. Leczenie karprofenem i antybiotykami, jeśli uzna się to za konieczne.

Wyniki

Po infuzji z pompy lub w wyznaczonym czasie po wstrzyknięciu bolusa do komór mózgu (ICV) (rutynowo stosujemy okres czterech tygodni), ważne jest przetestowanie skuteczności ASO. Zalecamy pobranie różnych obszarów mózgu i rdzenia kręgowego w celu pomiaru poziomów/izoform genu docelowego, zarówno na poziomie mRNA przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, jak i na poziomie białka przy użyciu Western Blot lub testu ELISA (Rysunek 4 jako opublikowany przykład). Pomoże to określić skuteczność ASO w różnych obszarach OUN. Jeśli okres półtrwania docelowego białka jest długi, zalecamy dłuższy czas oczekiwania po infuzji ASO, aby ocenić maksymalne wyciszenie białka lub splicing.

Ważne jest również przetestowanie rozkładu oligonukleotydów. Infuzje za pomocą pompy prowadzą do rozprzestrzenienia się substancji w obu półkulach, ipsilateralnej i kontralateralnej, choć wyższe stężenie ASO często obserwuje się w obszarach położonych bliżej układu komorowego ¹⁶. Iniekcje bolusowe do komór mózgu (ICV) zapewniają bardziej jednolity rozkład oligonukleotydów w całym OUN ¹⁶, choć ich efekty mogą być krótsze. W celu zapoznania się z bezpośrednim porównaniem rozkładu oligonukleotydów przy zastosowaniu pompy i metody bolusowej odsyłamy czytelnika do pracy Southwell et al. ¹⁶.

Zalecamy również testowanie wielu dawek, a także czasu działania ASO, ponieważ każde ASO będzie zachowywać się nieco inaczej in vivo. ASO zazwyczaj charakteryzują się stosunkowo długim czasem działania, przy czym wyciszenie docelowego genu lub zmiana splicingu utrzymują się przez kilka miesięcy po podaniu ASO. Ponadto niektóre ASO będą działać lepiej niż inne, a niektóre geny docelowe będą łatwiejsze do wyciszenia. Z tego powodu, podczas przesiewania ASO w celu wyłonienia głównego kandydata, zalecamy w pierwszym etapie przetestowanie co najmniej 3-5 ASO in vivo, z grupą n = 4-6 dorosłych myszy na każde ASO.

W przypadku stosowania leku innego niż ASO, istotne będzie również przeprowadzenie badań pilotażowych w celu ustalenia optymalnego stężenia leku, czasu jego działania oraz rozkładu leku w OUN dla konkretnego związku.

Tabela 1. Współrzędne chirurgiczne. Współrzędne wykorzystywane do trafienia w prawą komorę boczną u myszy i szczurów podczas implantacji pomp osmotycznych, a także przy podawaniu bolusa dopracerebrowentrykularnego (ICV). Oba zestawy współrzędnych, zarówno dla pomp, jak i dla bolusa ICV, celują w prawą komorę boczną. Stosujemy dwa różne zestawy, ponieważ posiadamy z nimi największe doświadczenie i wiemy, że zapewniają one doskonałą dystrybucję ASO.

Figura 1. Układ stereotaktyczny. (A) Niezbędny sprzęt stereotaktyczny do zabiegów wszczepienia pompy Alzet oraz iniekcji bolusa. i) Sterylizator szklanych kulek. ii) Cyfrowy wyświetlacz odczytu. iii) Podstawa stereotaktyczna z ruchomymi ramionami. iv) Podgrzewacz z kontrolą temperatury. v) System izofluran/tlen. vi) Komora izofluranowa. (B) Zbliżenie na stożek nosowy i pręty uszne. (C) Dwa wymagane akcesoria. Lewo: uchwyt strzykawki/igły do wewnątrzkomorowych (ICV) iniekcji bolusa. Prawo: prowadnica kaniuli do implantacji pompy osmotycznej.

Rysunek 2. Implantacja pompy osmotycznej Alzet. (A) Opcje pomp osmotycznych Alzet dla myszy. Pompy 14-dniowe (0,25 μl/hr), pompy 28-dniowe (0,25 μl/hr), pompy 42-dniowe (0,15 μl/hr). (B) Współrzędne implantacji pompy względem bregmy: -0,5 mm Posterior (tylnie), -1,1 mm Lateral (bocznie, prawa strona) oraz -2,5 mm Ventral (brzusznie, długość cewnika). (C) Po wprowadzeniu cewnika przez czaszkę i przyklejeniu kaniuli, przez cewnik przepływany jest barwnik w celu oceny prawidłowego umiejscowienia cewnika w komorze bocznej. (D) Perfuzowany mózg bezpośrednio po podaniu barwnika, zgodnie z opisem w punkcie (C). Jeśli cewnik został pomyślnie umieszczony w komorze, barwnik rozprowadzi się w całym układzie komorowym myszy.

Rycina 3. Bolusowa iniekcja dokomorowa. (A) Współrzędne dla iniekcji bolusowej względem bregmy: +0.3 mm przednio, -1.0 mm bocznie (prawo) oraz -3.0 mm brzuchowo. (B) Po wprowadzeniu igły przez czaszkę na głębokość -3.0 mm brzuchowo, przez strzykawkę podaje się barwnik, aby ocenić prawidłowe umiejscowienie igły w komorze bocznej. (C) Perfuzjowany mózg krótko po podaniu barwnika zgodnie z opisem w (B). Jeśli igła została prawidłowo umieszczona w komorze, barwnik rozprowadzi się w całym systemie komorowym myszy.

Rycina 4. Oligonukleotydy antysensowne redukują poziom SOD1 u szczurów in vivo (rycina pochodzi bezpośrednio z publikacji Smith et al. ⁷). (A-D) Antysensowne oligonukleotydy SOD1 SOD^r146192 lub SOD^scrambled wprowadzano w ilości 100 μg/dobę przez 28 dni do prawego brzuszka bocznego u prawidłowych szczurów. (A) Poziomy endogennego mRNA SOD1 w mózgu i rdzeniu kręgowym zmierzone za pomocą qRT-PCR. (B) Poziomy białka SOD1 i α-tubuliny po infuzji ASO. (C i D) Ilościowe oznaczenia poziomów białka tubuliny i SOD1 dla różnych obszarów mózgu po infuzji. (E) ASO przeciwko presenilinie 1 lub GSK-3β wprowadzano przez 2 tygodnie do prawego brzuszka bocznego u myszy nietransgenicznych, a poziomy mRNA oceniano w prawej korze czołowej/skroniowej. Powielone za zgodą American Society for Clinical Investigation. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę.

Rycina 5. Ciągły szew poziomy na materac. Nić nylonowa 5-0 jest prowadzona przeplatany przez skórę, zaczynając od strony przedniej i kierując się ku tylnej, z większym zagęszczeniem nad kaniulą. Po dotarciu do najbardziej tylnego punktu, nić jest prowadzona z powrotem w górę i ponownie przeplatana nad kaniulą. Zapewnia to prawidłowe zamknięcie rany i zapobiega przemieszczaniu się kaniuli/rurki przez skórę.

Dyskusja

Zdolność do globalnego dostarczania leków do OUN, jak pokazano na filmie, jest niezwykle potężną techniką, która jest łatwa zarówno do nauczenia, jak i stosowania. Przy odrobinie wprawy implantację pojedynczej pompy lub bolus ICV można wykonać w ciągu 10 minut, co pozwala na jednoczesne leczenie dużych kohort myszy. Jest to szczególnie przydatne w przypadku badań z odczytem behawioralnym, ponieważ większe liczby dotyczące zachowania myszy mają kluczowe znaczenie dla zobaczenia znaczących różnic.

Opierając się na naszych doświadczeniach w dostarczaniu ASO za pomocą pomp i wstrzyknięć w bolusie, zaobserwowaliśmy pewne zalety i wady każdej metody. Należy zauważyć, że są to opinie w naszym laboratorium i mogą nie być prawdziwe dla wszystkich modeli myszy i szczurów.

Uważamy, że zaletą stosowania pomp jest ich zdolność do dostarczania dużej ilości ASO, ponieważ ASO jest rozprowadzane przez znacznie dłuższy okres czasu. Zwykle jest to równoznaczne z dłuższym długotrwałym knockdownem lub splicingiem po aktywnej infuzji ASO, chociaż nie zawsze tak jest. Pompy pozwalają również na dokładne ramy czasowe dostarczania ASO (14 dni, 28 dni lub 42 dni), a pompy można wymienić raz, aby umożliwić jeszcze dłuższy aktywny wlew ASO. Zauważyliśmy jednak, że wielokrotna zmiana pomp zwiększa zmienność ze względu na tworzenie się włóknistych kieszeni wokół pompy, które uniemożliwiają pompie prawidłowe wchłanianie płynu. Wadą pomp jest to, że niektóre myszy nie tolerują pompy tak dobrze, jak inne. Jeśli linia transgeniczna, z którą pracujesz, jest bardziej delikatna, pompa może być zbyt uciążliwa. Pompy należy również usunąć po ostatnim wlewie, poddając myszy kolejnej operacji i dodanemu znieczuleniu. Jeśli wykonujesz pracę behawioralną, szczególnie ważne jest, aby usunąć pompę i pozwolić na co najmniej 1-2 tygodnie rekonwalescencji, ponieważ obecność pompy wpłynie na niektóre zachowania u myszy.

W przypadku wstrzyknięć w bolusie ICV jedną z zalet jest koszt. Zakup strzykawek i igieł wiąże się z początkową inwestycją, ale z biegiem czasu zastrzyki w bolusie są bardziej opłacalne, ponieważ nie trzeba kupować pomp/rurek/cewników. Ogólnie rzecz biorąc, wstrzyknięcia bolusa ICV są mniej kosztowne ze względu na brak kaniul i pomp. Odkryliśmy również, że bolus ICV może być używany do dostarczania ASO młodszym i/lub bardziej delikatnym myszom. Wadą bolusa ICV jest to, że jest to pojedyncze wstrzyknięcie. Tą drogą nie można dostarczyć tak dużej ogólnej ilości ASO, a jeśli czas działania używanego ASO jest krótki, efekty knockdown/splicing również będą krótkotrwałe.

Zarówno pompy osmotyczne, jak i bolus ICV mają zdolność dostarczania ASO, które mogą niszczyć białka lub zmieniać splicing genów w całym OUN gryzoni, technika ta ma szerokie zastosowanie w wielu dziedzinach związanych z neurobiologią. Sugerujemy pilotaż obu metod podawania, jeśli nie masz pewności, która droga podania jest najbardziej odpowiednia dla Twojego konkretnego badania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PRZYGOTOWANIE POMP OSMOTYCZNYCH ALZET
Pompa osmotyczna Alzet 14 dni Pompa osmotyczna	DURECT	Model 1002
Alzet 28 dni	DURECT	Model 2004
Pompa osmotyczna Alzet 42 dni	DURECT	Model 2006
Cewniki 2,5 mm	PlasticsOne	3280PM/SPC	Niestandardowe zamówienie do długości cewnika 2,5 mm
Rurka do cewnika winylowego	DURECT	7760	ID: 0,027 ", OD: 0,045"
0,9% Chlorek sodu, Nawadnianie, USP	Baxter	2F7124	NIE do stosowania w pompach lub rurkach
0,9% chlorek sodu, do wstrzykiwań, USP	Hospira	NDC 0409-4888-10
p60 szalka Petriego (sterylizowana)	TRP	93060
Ostrza chirurgiczne (sterylne)	Butler Schein	#007319
Lateksowe rękawice chirurgiczne (sterylne)	Micro-Touch		CatNie zależy to od rozmiaru potrzebnych rękawic
Sterylna serweta na ręczniki	Dynarex	4410.2um
PALL		4192
ml Strzykawka (sterylna)	BD	309625
50 ml Probówki
100% etanolu
PUMP & PROTOKOŁY CHIRURGICZNE BOLUSA
Zakrzywione kleszcze	Narzędzia naukowe	11001-12
Zakrzywione	narzędzia Hemostat Fine Science	13009-12
Cienkie, ostre nożyczki	Fine Science Tools	14060-09
Zakrzywione nożyczki	Fine Science Tools	14029-10
Obcinacz do kości	Fine Science Tools	16104-14
Proste narzędzia do	hemostatu	12002-12
Strzykawka	Hamilton	7653-01	10 μ l gazoszczelny z wyjmowanymi igłami
Igły	Hamilton	7758-04	26 gauge, Point Style: 2
5-0 Nylonowa nić do szwów	Covidient	SN-871
Wkładki alkoholowe	Select	#521
Waciki bawełniane (sterylne)	Puritan	REF 806-WC
Super Glue	Loctite		Butelki z długą szyjką
UWAGA: FastGreen Dye	Sigma	F7252-5G	Noś osłony oczu i rękawice podczas pracy z tym produktem
Antybiotyk w kremie
Maść
pod oczy Golarka
70% etanol
10% Provadone jod
3% Nadtlenek
Podkładka rozgrzewająca
Sterylizator kulek	SouthPointe Chirurgiczny	GRM5-1450
Małe zwierzę Stereotaktyczny		Kopf Model 940
Stożek nosowy	Kopf	Model 923-B
Listwy nauszne	Kopf	Model 921	Ten model jest opcjonalny
Sterownik kaniuli	Kopf	Model 1966
Uchwyt strzykawki	Kopf	Model 1972
System kontroli temperatury	Kopf	Model TCAT-2LV	Opcjonalny
system

Filtry strzykawkowe 1 stożkoweelektryczna Hydogenu tlenu / izofluranu