Ocena fenotypów neurodegeneracyjnych w neuronach dopaminergicznych Drosophila za pomocą testów wspinaczkowych i barwienia immunologicznego całego mózgu

Specyfika opisanych tutaj testów opiera się na użyciu linii muchowej Gal4, która wykorzystuje sekwencje regulatorowe genu hydroksylazy tyrozynowej do osiągnięcia specyficznej ekspresji w neuronach dopaminergicznych ³. Hydroksylaza tyrozyny katalizuje pierwszy i ograniczający szybkość etap syntezy dopaminy. Immunoreaktywność TH w mózgu dorosłej muchy pokrywa się z immunoreaktywnością dopaminy, co czyni TH dobrym kandydatem do identyfikacji neuronów DA in vivo (patrz na przykład ⁶). Co więcej, wzorzec ekspresji THGal4 jest bardziej specyficzny niż w przypadku innych linii Gal4, takich jak DdcGal4, który zawiera sekwencje regulatorowe z genu dekarboksylazy dopa i napędza ekspresję transgeniczną nie tylko w neuronach DA, ale także w neuronach serotoninergicznych i podzbiorach komórek glejowych ³.

Feany i Bender (2000) po raz pierwszy zaobserwowali, że panneuronalna ekspresja ludzkiego genu α-synukleiny połączonego z PD przyspiesza postępującą utratę wywołanego przez przerażenie negatywnego zachowania geotaksji u Drosophila. Zaobserwowaliśmy podobne wyniki przy użyciu specyficznej dla neuronu DA linii THGal4 do sterowania ekspresją transgenu α-synukleiny ¹⁰ i wykorzystaliśmy ten funkcjonalny odczyt do zbadania neuroprotekcyjnej roli szlaku Nrf2 w tym modelu Drosophila PD ¹⁴. Opisany tutaj specyficzny test został zaadaptowany z ² i ³.

Mózg Drosophila zawiera ponad 100 neuronów DA, ułożonych w co najmniej 5 różnych klastrów (PPL1, PPL2, PAL, PPM1/2, PPM3), które mogą być uwidocznione w całym mózgu za pomocą mikroskopii konfokalnej (zobacz na przykład ¹¹ i ⁷). Nadal jest kwestią sporną, czy liczba neuronów DA w mózgu Drosophila zmniejsza się w wieku ^{9, 11} lat; jednak neurodegenerację zależną od wieku obserwuje się u muszek, u których geny związane z chorobą Parkinsona zostały zmutowane/nadmiernie eksprymowane w celu modelowania chorób ludzkich ⁵. Ekspresja ludzkiej α-synukleiny w neuronach DA ma taki efekt i dlatego została wykorzystana jako model PD. Tutaj opisujemy test liczby neuronów DA w całym mózgu przy użyciu TH jako markera komórkowego. Ten test został zaadaptowany z ¹³ i ¹⁰.

1. Negatywny test geotaksji wywołany przez Niespodziankę

1. Wybierz muchy o pożądanym genotypie, rozdziel je według płci, losowo pogrupuj w kohorty po 20-30 zwierząt i wrzucaj do nowych fiolek z pokarmem co 2-3 dni; testuj każdy zestaw much (tj. kohorty dopasowane wiekowo, jedna kohorta/genotyp) co najmniej raz w tygodniu.
2. Trzydzieści minut przed ujemnym wynikiem testu geotaksji znieczulij muszki CO₂ i umieść je we wstępnie oznakowanych przezroczystych plastikowych rurkach wykonanych z dwóch pustych fiolek z jedzeniem (patrz Tabela Materiałów) połączonych w ich otworach przezroczystą taśmą (wymiary komory: 19 cm x 2,85 cm). W naszych testach zazwyczaj używamy 25 much/tubę.
   nuta. Czas rekonwalescencji po znieczuleniu może być różny od kilku minut do kilku godzin (np. O/N) i powinien być zoptymalizowany dla konkretnych badanych genotypów.
3. Zaznacz różne wysokości (od 1 do 20 cm) na kartce bibuły i przyklej papier do pionowej powierzchni, prostopadle do ławki.
4. Umieść rurki przed papierem: wszystkie rurki powinny być wyrównane i jak najbliżej papieru, aby umożliwić dokładny pomiar wysokości.
5. Umieść aparat cyfrowy (patrz Tabela "Wyposażenie Specjalne") przed probówkami, w odległości 20-30 cm od papieru, na podstawce (np. pudełku z końcówkami do pipet), wybierz opcję "film" i rozpocznij nagrywanie; w tym czasie należy również uruchomić stoper, aby śledzić czas między kolejnymi próbami.
6. Pozwól muchom zebrać się na dnie rurki, stukając w rurkę przez kilka sekund (np. 10 sekund). Ten krok powinien być wykonywany konsekwentnie (tj. ten sam czas trwania, ta sama siła, ten sam operator) przez cały czas trwania eksperymentu.
7. Rejestruj ruchy much aparatem cyfrowym przez 10 sekund.
8. Powtórz kroki 1,5-1,7 czternaście razy w odstępach jednominutowych.
9. Analizowanie danych:
   1. Policz liczbę much, które znajdują się powyżej znaku 2 cm po 10 sekundach, dokonując oględzin nagranych filmów.
      nuta: W naszych warunkach testowych negatywne zachowanie geotaksji muszek nie trwało dłużej niż pierwsze 10 sekund po spłoszeniu (tj. muchy zaczęły poruszać się we wszystkich kierunkach 10 sekund po ich spłoszeniu). Minimalna odległość, jaką pokonały muchy kontrolne (tj. 1-tygodniowe muchy wyrażające czynnik THGal4, patrz legenda na rysunku 1) w tym oknie czasowym wynosiła 2 cm. W związku z tym użyliśmy znaku 2 cm jako odniesienia do analizy aktywności wspinaczkowej much w różnym wieku i o różnych genotypach 10 sekund po zainicjowaniu zachowania. Parametry te mogą wymagać dostosowania w celu uwzględnienia różnic w zachowaniu badanych muszek (na przykład ze względu na różne podłoże genetyczne lub warunki laboratoryjne). Zauważ, że w naszych warunkach testowych wszystkie badane genotypy zachowywały się gorzej lub podobnie do much z genotypu kontrolnego.
   2. Weźmy średnią wyników z piętnastu prób.
   3. Średnia wyrażona jako procent całkowitej liczby much w rurze (= % aktywności wspinaczkowej); liczba powtórzeń (N) jest określona liczbą niezależnych kohort badanych dla każdego genotypu
   4. Oceń istotność statystyczną między różnymi genotypami w czasie. Można to osiągnąć za pomocą testu t Studenta (podczas porównywania dwóch genotypów) lub dwuczynnikowej analizy ANOVA, a następnie testu post-hoc Bonferroniego (podczas wykonywania wielokrotnych porównań) przy użyciu komercyjnego oprogramowania, takiego jak GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA).

Uwaga

Wykonujemy wszystkie nasze testy o tej samej porze dnia, w RT i w tych samych warunkach oświetleniowych. Zaleca się trzymanie much w 12-godzinnym środowisku cyklu światła/ciemności w celu kontrolowania wpływu rytmów okołodobowych na zachowanie lokomotoryczne much.

2. Test immunofluorescencji hydroksylazy tyrozyny na całym mózgu

Roztwory i

Roztwór utrwalający: 4% Paraformaldehyd (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)

Bufor do mycia: 0,1% Triton X-100 w PBS

Bufor blokujący: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 i 0,5% BSA

Nośnik montażowy: Mowiol-Dabco (zobacz protokół opisany w Harlow E, Lane D., Antibodies- A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988))

Procedura

1. Umieść muchy w naczyniu preparacyjnym wypełnionym 70% EtOH na około 1 minutę, aby usunąć wosk z naskórka.
2. Przenieś muchy do innego naczynia preparacyjnego wypełnionego lodowatym PBS.
3. Przeanalizuj mózg:
   1. Ułóż muchę brzuszną stroną do góry (opcjonalnie: usuń skrzydła i nogi).
   2. Odciągnij głowę od ciała: użyj jednego zestawu kleszczy, aby przytrzymać ciało, a drugiego, aby przytrzymać naskórek pod okiem, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu
   3. Usuń trąbkę.
   4. Przytrzymaj naskórek głowy po przeciwnych stronach szczeliny pozostawionej otwartej po usunięciu trąbki i pociągnij w przeciwnych kierunkach, aż mózg zostanie usunięty z torebki głowy.
   5. Usuń cały naskórek z mózgu.
   6. Usuń całą wypełnioną powietrzem tkankę tchawicy, co zapobiegnie unoszeniu się mózgu podczas kolejnych etapów inkubacji.
4. Odciąć kilka milimetrów od końcówki końcówki pipety P-200 i zrównoważyć ją 0,1% roztworem Triton X-100/PBS
5. Za pomocą przygotowanej końcówki pipety P-200 przenieś mózgi do 0,5 ml probówki Eppendorf wypełnionej 0,5 ml 4% PFA/PBS i trzymaj na lodzie do momentu zakończenia sekcji.
6. Ustaw mózgi w pozycji RT przez 20 minut: delikatnie obróć, umieszczając rurki Eppendorfa na stojaku i umieszczając stojak na nutatorze.
7. Usunąć utrwalacz za pomocą mikropipety P-1000, dodać 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS, wymieszać przez odwrócenie i pozostawić do inkubacji na 1 minutę; powtórzyć ten etap mycia jeden raz.
8. Usunąć bufor z drugiego płukania, dodać 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20 minut; powtórzyć ten krok dwukrotnie.
9. Usunąć bufor płuczący i pozwolić mózgom inkubować w buforze blokującym (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 i 0,5% BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
10. Inkubować mózgi z przeciwciałem anty-TH w stosunku 1:100 (patrz "Tabela specyficznych odczynników") w roztworze blokującym, przez dwa dni, w temperaturze 4 °C, z delikatnym obracaniem (patrz krok 2.6).
11. Powtórzyć kroki prania 2.7 i 2.8.
12. Zrównoważyć mózgi rozcieńczeniem 1:200 drugorzędowego roztworu blokującego przeciwciała, przez dwa dni, w temperaturze 4 °C, z delikatnym obrotem.
13. Powtórzyć kroki prania 2.7 i 2.8.
14. Przygotuj prowadnice montażowe, jak pokazano na rysunku 2A:
    1. Dodać 2 x 25 μl kropli podłoża montażowego do szkła nakrywkowego (24 x 60 mm, nr 1.5).
    2. Umieść dwie szkiełka nakrywkowe (rozmiar 18 x 18 mm, nr 2) na nośniku montażowym, pozostawiając szczelinę na środku szkiełka i pozostaw do wyschnięcia.
    nuta. Sprawdź uchwyt na próbkę na stoliku mikroskopu konfokalnego. Możesz sprawić, że szkło nakrywkowe będzie miało ten sam rozmiar co szkiełko o wymiarach 25 x 75 mm, przymocowując szkło nakrywkowe 22 x 22 mm 1,5 do jednego z końców (użyj lakieru do paznokci i taśmy).
15. Usunąć bufor do płukania, dodać 50 μl pożywki montażowej i pozwolić mózgom zrównoważyć się z nim poprzez pipetowanie w górę i w dół.
16. Za pomocą przeciętej końcówki pipety P-200 (patrz krok 2.4) przenieś mózgi na szkiełko podstawowe w przestrzeni między dwoma szkiełkami nakrywkowymi i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym nr 1.5 (patrz Rysunek 2A; aby zorientować mózgi na szkiełku, patrz ⁷).
    Uwaga: próbki są umieszczane między dwoma szkłami nakrywkowymi, aby umożliwić wizualizację zarówno przedniej, jak i tylnej strony mózgu.
17. Wypełnij całą przestrzeń między szkłami nakrywkowymi środkami montażowymi; odpipetuj z jednego rogu, aby usunąć całe powietrze; pozostaw do wyschnięcia i uszczelnij lakierem do paznokci.
18. Aby ocenić liczbę neuronów dopaminergicznych w określonym klastrze, należy pobrać serię odcinków optycznych wzdłuż osi z krokiem 1,0 μm za pomocą mikroskopu konfokalnego (w celu anatomicznej identyfikacji klastrów dopaminergicznych w dorosłym mózgu Drosophila patrz ⁷).

Użyliśmy opisanych tutaj testów do zbadania roli szlaku Nrf2 chroniącego przed stresem w modelu PD 14 u Drosophila. Model ten opiera się na ekspresji ludzkiego genu α-synukleiny w neuronach DA przy użyciu sterownika TH Gal4 2, 10.

Rysunek 1 pokazuje reprezentatywny wynik wywołanego przez zaskoczenie negatywnego testu geotaksji (wspinaczki) u samców muszek wykazujących ekspresję różnych transgenów pod kontrolą kierowcy TH Gal4. Wszystkie badane genotypy wykazują spadek aktywności lokomotorycznej w czasie; jednak muchy wykazujące ekspresję ludzkiego transgenu α-synukleiny sprzężonego z PD wykazują przyspieszony spadek w porównaniu z muszkami kontrolnymi dopasowanymi do wieku (sam sterownik TH Gal4) lub muchami współeksprymującymi partnera wiążącego DNA Nrf2 Maf-S. Podobne wyniki zaobserwowano u samic much.

Rysunek 2 ilustruje reprezentatywny wynik dla liczby neuronów DA opartej na immunofluorescencji TH. Wpływ różnych środowisk genetycznych na liczbę neuronów PPL1 w mózgach 4-tygodniowych samców much jest określony ilościowo, jak opisano w legendzie ryciny. Zwróć uwagę na niewielką, ale znaczącą utratę neuronów PPL1 w mózgach przez muchy wyrażające α-synukleinę.

Rysunek 1. Ujemny test geotaksji wywołany przez przestraszenie. Kohorty muszek o dopasowanych wiekowo o wskazanych genotypach badano pod kątem aktywności lokomotorycznej w odstępach tygodniowych. Aktywność wspinaczkową obliczono, licząc liczbę much powyżej znaku 2 cm po 10 sekundach od stuknięcia w fiolkę i wyrażając tę wartość jako procent całkowitej liczby much zawartych w fiolce. Dane pokazują, że ± s.e.m. pięciu niezależnych kohort po 20-30 much. Istotność oceniono za pomocą dwuczynnikowej ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego (P<0,05). Różnica między TH,α-Synflies a muchami pozostałych trzech badanych genotypów była istotna po 4 i 5 tygodniach.

Rysunek 2. Wykrywanie i liczenie neuronów DA przez immunofluorescencję TH. ZA. Diagram przepływu ilustrujący protokół przygotowania preparatów mózgowych. Bardziej szczegółowy opis każdego kroku znajduje się w tekście. Ur. Reprezentatywna mikrofotografia całego wierzchowca mózgu (prawe półmózgowie, widok tylny) wybarwionego immunologicznie w kierunku TH. Zestaw obrazów konfokalnych z serii Z został uzyskany za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica SP2, obiektywu olejowego 40X (N/A 1,25), średnia klatek 2, rozmiar kroku 1 μm, w formacie 1,024 x 1,024 i skompilowany jako projekcja maksymalna (pokazana). Położenie klastra neuronów PPL1 DA jest podświetlone. C. Reprezentatywne wyniki dla liczby neuronów DA uzyskane przy użyciu barwienia immunologicznego TH. Liczbę neuronów w klastrze PPL1 oceniono, sprawdzając indywidualne obrazy każdej konfokalnej serii z. N oznacza liczbę niezależnych próbek analizowanych dla każdego genotypu. Dane są środkami ± s.e.m. Istotność oceniano za pomocą testu t Studenta (*P<0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Genotypy: 'con', THGal4/+; THGal4/+; 'UAS-Syn', THGal4, UAS
-αsynukleina/+; THGal4,UAS -αsynukleina/+; 'UAS-MAF-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4/+; 'UAS-αSyn/UAS-Maf-S', THGal4, UAS-αSynuclein/UASMaf-S; THGal4, UAS-αsynukleina/+; 'keap1EY5',THGal4/+; THGal4/keap1EY5; 'UAS-αSyn/keap1EY5', THGal4, UAS-αSynuclein/+; THGal4, UAS-αSynukleina/keap1EY5.

[Reprodukowane z Barone et al. 2011) zgodnie z polityką "Otwartego dostępu" "Modele i mechanizmy chorób".]

Oświadczamy, że nie mamy konkurencyjnych interesów finansowych.