Tu opisujemy dwa testy, które zostały opracowane w celu badania związanej z wiekiem neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych (DA) w Drosophila: test ujemnej geotaksji indukowanej wspinaczkami/skurczem, który pozwala badać efekty funkcjonalne zwyrodnienia neuronów DA oraz immunobarwienie na hydroksylazę tyrozyny, które jest używane do identyfikacji i liczenia neuronów DA w całych preparatach mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena fenotypow neurodegeneracyjnych w Drosophila neuronach dopaminergicznych poprzez testy wspinaczkowe i immunobarwienie całego mózgu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Drosophila melanogaster jest cenny organizmem modelowym do badania starzenia się i patologicznych procesów zwyrodnieniowych w układzie nerwowym. Zalety muchy jako systemu eksperymentalnego obejmują jej genetyczną dostępność, krótki okres życia oraz możliwość obserwacji i ilościowej analizy złożonych zachowań. Ekspresja genów związanych z chorobami w określonych populacjach neuronów mózgu Drosophila może być wykorzystana do modelowania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych takich jak choroba Parkinsona i Alzheimera 5.
Neurony dopaminergiczne (DA) należą do najbardziej podatnych populacji neuronów w starzejącym się ludzkim mózgu. W chorobie Parkinsona (PD), najczęstszym neurodegeneracyjnym zaburzeniu ruchowym, przyspieszona utrata neuronów DA prowadzi do progresywnego i nieodwracalnego spadku funkcji ruchowych. Oprócz wieku i narażenia na toksyny środowiskowe, utrata neuronów DA jest nasilona przez specyficzne mutacje w regionach kodujących lub promotorowych kilku genów. Identyfikacja takich alleli związanych z PD dostarcza podstawy eksperymentalnej dla użycia Drosophila jako modelu do badania neurodegeneracji neuronów DA in vivo. Na przykład ekspresja ludzkiego genu α-synucleiny związanego z PD w neuronach DA Drosophila odwzorowuje niektóre cechy ludzkiej choroby, np. progresywną utratę neuronów DA i pogorszenie funkcji ruchowych 2. W związku z tym model ten został pomyślnie wykorzystany do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych w PD 8.
Opisujemy tu dwa testy, które są powszechnie stosowane do badania wieku-zależnej neurodegeneracji neuronów DA w Drosophila: test wspinania oparty na reakcji ujemnej geotaksji wywołanej bodźcem oraz immunobarwienie tyrozyny hydroksylazy w całych preparatach mózgu dorosłych w celu monitorowania liczby neuronów DA w różnym wieku. W obu przypadkach, in vivo ekspresja transgenów UAS specyficznie w neuronach DA może zostać osiągnięta poprzez użycie linii promotorowej tyrozyny hydroksylazy (TH) - Gal4 3, 10.
Wprowadzenie
Sprecyficzność opisywanych tu metod opiera się na wykorzystaniu linii muchy Gal4, która wykorzystuje sekwencje regulacyjne genu hydroksylazy tyrozyny do osiągnięcia specyficznego ekspresji w neuronach dopaminergicznych 3. Hydroksylazyna tyrozyny katalizuje pierwszy i ograniczający szybkość krok w syntezie dopaminy. Immunoreaktywność TH w mózgu dorosłej muchy nakłada się na immunoreaktywność dopaminy, co czyni TH dobrym kandydatem do identyfikacji neuronów DA in vivo (patrz na przykład 6). Ponadto, wzór ekspresji THGal4 jest bardziej specyficzny niż wzór innych linii Gal4, takich jak DdcGal4, która zawiera sekwencje regulacyjne z genu dopa dekarboksylazy i napędza ekspresję transgeniczną nie tylko w neuronach DA, ale także w neuronach serotoninergicznych i podzbiorach komórek glialnych 3.
Feany i Bender (2000) jako pierwsi zaobserwowali, że ogólnoukładowa ekspresja ludzkiego genu α-synucleiny związanego z PD przyspiesza postępującą utratę zachowania ujemnej geotaksji indukowanej stresem w Drosophila. Zaobserwowaliśmy podobne wyniki używając linii THGal4 specyficznej dla neuronów DA do napędzania ekspresji transgenu α-synucleiny 10 i użyliśmy tego funkcjonalnego odczytu do badania roli neuroprotekcyjnej szlaku Nrf2 w tym modelu PD Drosophila 14. Opisany tu specyficzny test jest przystosowany z 2 i 3.
Mózg Drosophila zawiera ponad 100 neuronów DA, ułożonych w co najmniej 5 różnych skupieniach (PPL1, PPL2, PAL, PPM1/2, PPM3), które można wizualizować w całości w preparatach mózgu za pomocą mikroskopii konfokalnej (patrz na przykład 11 i 7). Nadal istnieje kontrowersja, czy liczba neuronów DA w mózgu Drosophila maleje wraz z wiekiem 9, 11; jednakże, neurodegneracja zależna od wieku obserwuje się u much, w których geny związane z PD zostały zmutowane/nadmiernie ekspresowane w celu stworzenia modelu chorób ludzkich 5. Ekspresja ludzkiej α-synucleiny w neuronach DA ma taki efekt i dlatego była używana jako model PD. Tutaj opisujemy test liczenia neuronów DA w całości preparatów mózgu z wykorzystaniem TH jako markera komórkowego. Ten test został przystosowany z 13 i 10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Startle-induced Negative Geotaxis Assay
- Wybierz muchy o pożądanym genotypie, oddziel je według płci, losowo zgrupuj je w grupy po 20-30 zwierząt i przenieś do nowych flaszek co 2-3 dni; sprawdź każdą grupę much ( tj. grupy dopasowane wiekowo, jedna grupa/genotyp) co najmniej raz w tygodniu.
- Trzydzieści minut przed testem ujemnej geotaksji znieczulić muchy CO2 i umieścić je w wstępnie oznaczonych przezroczystych plastikowych probówkach wykonanych z dwóch pustych flaszek (patrz Tabela Materiałów) połączonych w ich otworach przezroczystą taśmą (wymiary komory: 19 cm x 2.85 cm). W naszych testach zazwyczaj używamy 25 much/probówka.
Uwaga. Czas powrotu do przytomności po znieczuleniu może być różny od kilku minut do kilku godzin ( np. O/N) i powinien być zoptymalizowany dla konkretnych genotypów. - Zaznacz różne wysokości (od 1 do 20 cm) na kartce papieru bibuletkowego i przyklej kartkę na pionowej powierzchni, prostopadle do blatu.
- Umieść probówki przed papierem: probówki powinny być wszystkie wyrównane i tak blisko papieru, jak to możliwe, aby zapewnić dokładne pomiary wysokości.
- Umieść kamerę cyfrową (patrz "Tabela sprzętu specjalnego") przed probówkami, w odległości 20-30 cm od papieru, na stojaku ( np. pudełku na końcówki pipet), wybierz opcję "film" i rozpocznij nagrywanie; w tym momencie powinieneś również uruchomić timer, aby śledzić czas między kolejnymi próbami.
- Pozwól muchom zebrać się na dnie probówki, stukając w nią przez kilka sekund ( np. 10 sekund). Ten krok powinien być wykonywany konsekwentnie ( tj. ta sama moc, ten sam operator) przez cały eksperyment.
- Nagraj ruchy much z kamerą cyfrową przez 10 sekund.
- Powtórz kroki 1.5-1.7 czternaście razy w odstępach jednominutowych.
- Analizuj dane:
- Przez wizualne przeglądanie nagranych filmów policz liczbę much, które znajdują się powyżej znaczka 2 cm po 10 sekundach.
Uwaga: W naszych warunkach testu zachowanie ujemnej geotaksji much nie trwało dłużej niż pierwsze 10 sekund po zaskoczeniu ( tj. muchy zaczęły się poruszać we wszystkich kierunkach 10 sekund po ich zaskoczeniu). Minimalna odległość przebyta przez muchy kontrolne ( tj. 1-tygodniowe muchy wyrażające sterowniczy THGal4, patrz legenda do Figury 1) w tym oknie czasowym wynosiła 2 cm. Dlatego użyliśmy znaczka 2 cm jako referencji do analizy aktywności wspinaczki much o różnym wieku i genotypach 10 sekund po rozpoczęciu zachowania. Te parametry mogą wymagać dostosowania, aby uwzględnić różnice w zachowaniu testowanych much (na przykład ze względu na różne tła genetyczne lub warunki laboratoryjne). Zauważ, że w naszych warunkach testu wszystkie testowane genotypy wykazywały gorsze lub podobne wyniki w porównaniu z muchami genotypu kontrolnego. - Oblicz średnią wyników z piętnastu prób.
- Wyraz średnią jako procent całkowitej liczby much w probówce (= % aktywności wspinaczki); liczbę powtórzeń (N) określa liczba niezależnych grup przebadanych dla każdego genotypu
- Oceń istotność statystyczną między różnymi genotypami w czasie. Można to osiągnąć za pomocą testu Studenta (przy porównywaniu dwóch genotypów) lub analizy dwuwarstwowej ANOVA po uprzednim teście post-hoc Bonferroni (przy wykonywaniu wielu porównań) przy użyciu komercyjnych oprogramowań, takich jak GraphPad (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA, USA).
- Przez wizualne przeglądanie nagranych filmów policz liczbę much, które znajdują się powyżej znaczka 2 cm po 10 sekundach.
Uwaga
Przeprowadzamy wszystkie nasze testy o tej samej porze dnia, w temperaturze pokojowej i w tych samych warunkach świetlnych. Zaleca się trzymanie much w środowisku z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność, aby kontrolować wpływ rytmu okołodobowego na zachowanie lokomocyjne much.
2. Test immunofluorescencji hydroksylazy tyrozyny całych preparatów mózgu
Roztwory i bufory
Roztwór utrwalający: 4% paraformaldehyd (PFA) w buforowanym roztworze soli fosforanowej (PBS)
Bufor myjący: 0,1% Triton X-100 w PBS
Bufor blokujący: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 i 0,5% BSA
Środek montujący: Mowiol-Dabco (patrz protokół opisany w Harlow E, Lane D., Antibodies- A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988))
Procedura
- Umieść muszki w naczyniu do sekcjonowania wypełnionym 70% EtOH na około 1 minutę, aby usunąć wosk kutikuli.
- Przenieś muszki do innego naczynia do sekcjonowania wypełnionego zimnym PBS.
- Wykonaj sekcję mózgu:
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystaliśmy opisane tu metody do badania roli ochronnego szlaku Nrf2 w Drosophila modelu PD 14. Ten model opiera się na ekspresji ludzkiego genu α-synukleiny w neuronach dopaminergicznych za pomocą sterownika TH Gal4 2, 10.
Rycina 1 przedstawia reprezentatywny wynik testu ujemnej geotaksji (przez wstrząs) u samców muszek ekspresujących różne transgeny pod kontrolą sterownika TH Gal4. Wszystkie testowane genotypy wykazują spadek aktywności ruc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj metody zapewniają przydatne podejście do badania roli określonych genów, szlaków sygnałowych lub małych związków w utrzymaniu neuronów dopaminergicznych w procesie starzenia się, a także w różnych genetycznych kontekstach związanych z chorobami (przegląd w 5).
Zachowanie ujemnej geotaksji wywołanej strachem u Drosophila było szeroko stosowane jako funkcjonalny wskaźnik sprawności neuronów dopaminergicznych w różnych kontekstach genetycznych, szczególnie w obe...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Oświadczamy, że nie mamy żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy Leo Pallanck za szczepy much, Christine Sommers za pomoc techniczną i Gerasimos P. Sykiotis za pomocne dyskusje. Ta praca była sfinansowana przez grant szkoleniowy NIH T32CA009363 dla M.C.B.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Wyposażenie | |||
| Polistyrowe fiolki | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Aparat cyfrowy | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapikseli 4X Zoom optyczny |
| Okrągłe szkiełka laboratoryjne nr 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Rozmiar: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Okrągłe szkiełka laboratoryjne nr 2 | VWR | 48368-040 | Rozmiar: 18 x 18 mm |
| Naczynia do sekcjonowania | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Rozmiar: 30 mm O.D. |
| Pincety Dumostar nr 5 | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomikroskop | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Mikroskop konfokalny | Leica | SP2 lub SP5 (model) | |
Tabela materiałów. |
Bibliografia
- Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
- Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5(2009).
- Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706(2011).
- Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
- Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205(2010).
- Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
