Nowatorska technika obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości do badania dynamicznej odpowiedzi struktur wewnątrzczaszkowych na wzrost guza i terapie

Podsumowanie

Opisujemy nowatorską technikę obrazowania in vivo, która łączy fluorescencyjne chimeryczne myszy z oknami wewnątrzczaszkowymi i mikroskopią 2-fotonową o wysokiej rozdzielczości. Ta platforma obrazowania wspomaga badania dynamicznych zmian w tkance mózgowej i mikrokrążeniu na poziomie pojedynczej komórki, po patologicznych urazach i jest przystosowana do oceny wewnątrzczaszkowego dostarczania i dystrybucji leków.

Streszczenie

Udało nam się zintegrować wcześniej opracowaną technologię okna wewnątrzczaszkowego (ICW) ^1-4 z przyżyciowym 2-fotonowym mikroskopem konfokalnym, aby opracować nową platformę, która pozwala na bezpośrednią, długoterminową wizualizację zmian struktury tkanki wewnątrzczaszkowej. Obrazowanie w rozdzielczości pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym dostarcza dodatkowych informacji dynamicznych wykraczających poza standardowe analizy histologiczne punktu końcowego, które dotyczą wyłącznie przekrojów poprzecznych tkanki typu "snap-shot".

Ustanawiając tę technikę obrazowania przyżyciowego u fluorescencyjnych myszy chimerycznych, jesteśmy w stanie obrazować jednocześnie cztery kanały fluorescencyjne. Poprzez włączenie komórek znakowanych fluorescencyjnie, takich jak szpik kostny GFP+, możliwe jest śledzenie losów tych komórek, badając ich długoterminową migrację, integrację i różnicowanie w tkance. Dalsza integracja wtórnej komórki reporterowej, takiej jak linia nowotworowa glejaka mCherry, pozwala na scharakteryzowanie interakcji komórka-komórka. Zmiany strukturalne w mikrośrodowisku tkanek można uwypuklić poprzez dodanie barwników i przeciwciał przyżyciowych, na przykład przeciwciał znakowanych CD31 i cząsteczek dekstranu.

Ponadto, opisujemy połączenie naszego modelu obrazowania ICW z małym mikro-promiennikiem zwierzęcym, który zapewnia stereotaktyczne napromieniowanie, tworząc platformę, za pomocą której można ocenić dynamiczne zmiany tkankowe, które zachodzą po podaniu promieniowania jonizującego.

Obecne ograniczenia naszego modelu obejmują penetrację mikroskopu, która jest ograniczona do głębokości do 900 μm od powierzchni podkorowej, ograniczając obrazowanie do grzbietowej osi mózgu. Obecność kości czaszki sprawia, że ICW jest bardziej wymagającą procedurą techniczną w porównaniu z bardziej uznanymi i wykorzystywanymi modelami komorowymi stosowanymi obecnie do badania tkanki sutkowej i poduszek tłuszczowych ^5-7. Ponadto ICW stwarza wiele wyzwań związanych z optymalizacją obrazowania.

Wprowadzenie

Lepsze zrozumienie zmian strukturalnych i biologicznych, które zachodzą w mózgu w odpowiedzi na różne patologie i interwencje terapeutyczne, jest kluczowe dla poprawy strategii leczenia. Jednak jednym z obecnych wyzwań w badaniu tych zmian strukturalnych i biologicznych, szczególnie w odniesieniu do patologii wewnątrzczaszkowych, jest niedostępność tkanki i niemożność badania ewolucji czasowej i dynamicznego postępu zmian w warunkach in vivo. Opracowanie technologii "okienkowej" okazało się wcześniej skuteczne w badaniu zmian w tkankach miękkich w procesie rozwoju guza ^5-7. Opracowanie modeli ICW okazuje się być trudniejsze technicznie ze względu na konieczność usunięcia kości czaszki bez uszkodzenia w wyniku wywołania infekcji w leżącej poniżej tkance mózgowej. W poprzednich pracach próbowano rozrzedzić czaszkę w celu uwidocznienia tkanki ^8-10, jednak aby uzyskać wyraźne obrazy o wysokiej rozdzielczości, wymagane jest pełne usunięcie kości czaszki ¹¹. Powtarzanie obrazowania długoterminowego (30 dni+) dopiero niedawno stało się wykonalną opcją poprzez obrazowanie ^1,11, wcześniej badano krótsze ramy czasowe ⁵.

W ciągu ostatniej dekady głównym celem było wyjaśnienie pochodzenia neo-waskulacji po bodźcach patologicznych, w szczególności w odpowiedzi na powstawanie i progresję guza, aby dostarczyć nowych celów terapeutycznych do leczenia nowotworów. Wiele kontrowersji pozostaje wokół źródła nowego unaczynienia w mózgu podczas rozwoju guza lub po promieniowaniu. Tradycyjnie uważa się, że unaczynienie zachodzi poprzez angiogenezę, proces, w którym nowe naczynia tworzą się z kiełkowania wcześniej istniejących naczyń ¹². Nowsze badania sugerują jednak, że wcześniej zakładany embrionalny proces waskulogenezy może odgrywać bardziej znaczącą rolę w tworzeniu patologicznej naczyniowości. Waskulogeneza polega na rekrutacji dorosłych odpowiedników angioblastów ze szpiku kostnego, które z kolei są następnie bezpośrednio zaangażowane w tworzenie nowego śródbłonka naczynia ^12-14. Coraz więcej dowodów wskazuje, że śródbłonkowe komórki prekursorowe są mobilizowane ze szpiku kostnego w celu zainicjowania tworzenia naczyń de novo w odpowiedzi na mediatory onkogenne ^15-17. Jednak badania te dostarczają sprzecznych dowodów na bezpośredni udział tych komórek pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC) w śródbłonku naczynia, przy czym procentowy udział różni się w zależności od rodzaju bodźca patologicznego i odpowiedzi na leczenie ^18-21.

Dlatego nieocenione jest ustanowienie powtarzalnych metod eksperymentalnych, które pozwalają na obrazowanie przyżyciowe w wysokiej rozdzielczości dla powtarzających się długoterminowych badań procesu integracji BMDC z naczyniami krwionośnymi guza i w odpowiedzi na terapię. Standardowe techniki histologiczne nie dostarczają dynamicznych informacji wymaganych do określenia długoterminowego przeżycia, różnicowania i integracji komórek, które powodują neowaskulatura, a zatem nie mogą ostatecznie wykazać mechanizmów interakcji komórkowych.

Wykazaliśmy za pomocą naszego eksperymentalnego podejścia, że istnieje różny stopień rekrutacji BMDC zarówno po wewnątrzczaszkowym promieniowaniu jonizującym, jak i po wzroście guza, rekrutacja, która jest jednak specyficzna dla miejsca patologii, a nie inwazja całej tkanki wewnątrzczaszkowej ^11,22. Wykazaliśmy, że rekrutacja przebiega zgodnie z wrażliwym na czas wzorcem, co wykazano w wielokrotnym obrazowaniu pojedynczego zwierzęcia ^11,22. Podobnie, obrazowanie in vivo może również dostarczyć nieocenionych informacji na temat mimikry komórek nowotworowych, dzięki której fluorescencyjnie znakowane komórki nowotworowe mogą być obrazowane i śledzone za pomocą przeciwciała CD31 dożylnego dla komórek śródbłonka, aby podkreślić możliwość transdyferencjacji komórek nowotworowych w celu bezpośredniego utworzenia własnego śródbłonka.

Wszechstronność modelu jest zwiększona dzięki możliwości obrazowania 4 kanałów fluorescencyjnych, co zapewnia wyczerpującą liczbę kombinacji do badania różnych procesów komórkowych i biologicznych. Jesteśmy w stanie obrazować dożywotnie CFP (niebieski), GFP (zielony), Cherry/RFP (czerwony) i Alexa647/APC (dalekiej czerwieni), jednocześnie w jednym polu wielokrotnie w czasie. Naukowcy mogą genetycznie modyfikować komórki w celu ekspresji fluorochromów dla każdego z kanałów, a także kupować barwniki i przeciwciała, aby podkreślić zmiany strukturalne o szczególnym znaczeniu. Do tej pory barwniki i przeciwciała powszechnie stosowane w badaniach obejmują CD31 i dekstran, które podkreślają mikrokrążenie i jego zmiany w tkance ^1,11,23,24, chociaż wykorzystaliśmy w tym celu kanał dalekiej czerwieni, oba są dostępne do stosowania w innych wymienionych kanałach. Podobnie inne barwniki, w tym Sytox Orange, który podkreśli obszary apoptozy, oraz markery, takie jak te firmy Visen, zostały specjalnie zaprojektowane do stosowania in vivo. Oprócz wymienionych czterech powszechnie stosowanych kanałów fluorescencyjnych, można dodać kanał generacji drugiej harmonicznej (SHG) i zoptymalizować go w celu zobrazowania endogennych włókien kolagenowych modelu ⁷, wizualizując błonę podstawną otaczającą naczynia krwionośne.

Aby zademonstrować zdolność adaptacyjną naszego modelu, jak również wspomniane wyżej interakcje komórka-komórka, udało nam się zbadać interakcje lek-komórka. Przyjrzeliśmy się inhibitorom leków, takim jak AMD3100, inhibitor SDF-1, i jego roli w sieciach sygnalizacyjnych zaangażowanych w rekrutację BMDC ¹¹. W podobny sposób przeprowadziliśmy genetycznie modyfikowane komórki ksenoprzeszczepów glejaka U87 w celu ekspresji VEGFTrap, inhibitora VEGF ²⁵, w połączeniu przez IRES z cząsteczką GFP. Korzystając z RFP+ BM, jesteśmy w stanie zbadać rolę, jaką VEGF odgrywa w rekrutacji BMDC do układu krwionośnego. Ostatnio wykorzystaliśmy ten model do badania kinetyki leków, przyglądając się mechanizmowi stojącemu za lekiem Fluoresceina ²⁶ na poziomie komórkowym, który wyznacza nowotwór. Dzięki zastosowaniu specjalnie zbudowanego w domu promiennika dla małych zwierząt byliśmy w stanie zintegrować stereotaktyczne promieniowanie dostarczane w celu oceny odpowiedzi zarówno guza, jak i BMDC na leczenie.

Dzięki zastosowaniu naszej nowatorskiej metody obrazowania przyżyciowego, badacze uzyskają wgląd w zmiany zachodzące w czasie rzeczywistym w pojedynczych komórkach, które zachodzą w różnych patologiach i systemach, pomagając w wyjaśnieniu wielu funkcjonalnych i biologicznych cech zmian w tkankach.

Protokół

CAŁA PRACA ZE ZWIERZĘTAMI ZOSTAŁA WYKONANA ZGODNIE Z ZATWIERDZONYM PROTOKOŁEM KOMITETU OPIEKI I UŻYTKOWANIA ZWIERZĄT I WYKONANA ZGODNIE ZE WSZYSTKIMI ODPOWIEDNIMI WYTYCZNYMI, PRZEPISAMI I AGENCJAMI REGULACYJNYMI.

Aby rozwiązać problem, zapoznaj się z Tabelą 2.

1. Rekonstytucja szpiku kostnego (opcjonalnie) Rysunek 1 (30 min przygotowania, 5 min na mysz)

Wszystkie operacje powinny być wykonywane przy użyciu ścisłej techniki aseptycznej, z autoklawowanym sterylnym sprzętem.

Jedna mysz dawcy odtworzy trzy myszy gospodarzy.

1. Znieczulenie biorcy myszy NODscid i umieszczenie, z ołowiem osłaniającym głowę, wewnątrz środka promiennika "exactor" Gammacell 40.
2. Napromienij myszy NODscid napromieniowaniem całkowitego ciała 2,5 Gy (TBI).

KRYTYCZNY KROK: Optymalizacja TBI może być potrzebna ze względu na różnice w dawce wymaganej do wystarczającego wyczerpania komórek odpornościowych gospodarza w różnych szczepach myszy.

Punkt pauzy: Myszy gospodarzy mogą być napromieniowane wcześniej, ale powinny być użyte w ciągu 24 godzin od napromieniowania.

3. Eutanazja myszy dawców zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego komitetu ds. opieki nad zwierzętami. Oczyść kończyny tylne i usuń kość piszczelową i udową z obu, usuwając nadmiar tkanki z kości (ryc. 1ai, 1aii).

KRYTYCZNY KROK: Kości strzałkowe nie nadają się do użytku ze względu na bardzo wąskie światło.

4. Usunąć płytki końcowe z obu końców czterech wyciętych kości i wypłukać je za pomocą igły 22 G i 1 ml sterylnego PBS, aż staną się białe (ryc. 1aiii). Tabela referencyjna 2.
5. Dobrze wymieszać wyekstrahowaną zawiesinę szpiku kostnego (BM) i pobrać 300 μl do trzech igieł tuberkulinowych o sile 27 g. Wyekstrahowany BM powinien zawierać około 2 x 10⁷ komórek i wystarczy do rekonstytucji 3 myszy gospodarza. Tabela referencyjna 2.
6. Wstrzyknąć zawiesinę do bocznej żyły ogonowej trzech uprzednio napromieniowanych myszy NODscid z kroku 1.1 (Rysunek 1b). Tabela referencyjna 2.

UWAGA: Aby sprawdzić sterylność wstrzykniętego BM, zalecamy posiewanie pozostałego BM i hodowlę przez 24 godziny w celu sprawdzenia infekcji. Główną przyczyną śmierci w tym momencie jest infekcja u nowo odtworzonych myszy.

2. Generowanie okien wewnątrzczaszkowych - Rysunek 2 (30 minut na mysz)

Wszystkie operacje powinny być wykonywane przy użyciu ścisłej techniki aseptycznej, z autoklawowanym sterylnym sprzętem i pod lampą grzewczą, aby utrzymać zwierzęta w cieple (Rysunek 2A).

1. Myszy biorcy NODscid należy znieczulić zatwierdzonym przez IACUC środkiem znieczulającym, wstrzyknięciem Avertin IP w dawce 0,5 mg/g i umieszczeniem, z ołowiem osłaniającym głowę, wewnątrz środka promiennika "exactor" Gammacell 40. Usuń włosy ze skóry głowy. Dodatkowo zastosuj żel łzowy, aby zapobiec odwodnieniu rogówki.
2. Oczyść skórę głowy najpierw roztworem Betadine, a następnie alkoholem, a następnie wykonaj nacięcie od środka uszu do tuż nad oczami. Usuń skórę głowy 3 mm po obu stronach pierwszego nacięcia, odsłaniając czaszkę i punkty orientacyjne na powierzchni czaszki (ryc. 2Bi).
3. Podnieś okostną, wstrzykując 2% roztwór lidokainy: epinefryny i wypreparuj z powierzchni czaszki (ryc. 2Bii).
4. Za pomocą wiertła trepanacyjnego 2,7 mm osłabij okrąg czaszki o średnicy 2,7 mm nad korą prawej półkuli między lambdą a bregmą. NIE WOLNO penetrować kości wiertłem (Rysunek 2Biii). Tabela referencyjna 2.

KRYTYCZNY KROK: jeśli wiertło przejdzie przez czaszkę, powierzchnia mózgu zostanie uszkodzona, co wpłynie na wyniki z dodatkowym urazem. Ponadto wystąpi nadmierne krwawienie, które uniemożliwi wygenerowanie przezroczystego okna.

5. Usuń osłabiony płat kostny za pomocą pęsety preparacyjnej i haczyka dentystycznego oraz celowej, ale kontrolowanej siły (ryc. 2Biii).
6. (Opcjonalnie) Jeśli patrzysz na patologię guza, wstrzyknij wybrane linie komórek nowotworowych (z fluorescencyjnym genem reporterowym) do środka okna wygenerowanego w kroku 2.5.
   1. Załaduj strzykawkę Hamiltona 10 μl 30 G z zawiesiną komórek i załaduj igłę do ramki stereotaktycznej.
      KROK KRYTYCZNY: Liczba komórek będzie musiała zostać zoptymalizowana pod kątem używanych komórek nowotworowych i wymaganego czasu wzrostu. Do hodowli U87 używamy 2 x 10⁵ komórek po 10 μl na mysz.
   2. Załaduj mysz na cyfrową ramkę stereotaktyczną, wyrównaj igłę do środkowego punktu wygenerowanego okna.
   3. Opuść igłę, aż dotknie powierzchni kory mózgowej i zresetuj współrzędne cyfrowe.
   4. Opuścić igłę na głębokość 3,2 mm w głąb tkanki korowej i wstrzyknąć na głębokość 3 mm.
   5. Powoli igłę, a następnie wyjmij mysz z ramki.
      ETAP KRYTYCZNY: Wstrzykiwać roztwór przez 1 minutę i pozostawić igłę na miejscu po wstrzyknięciu, aby zapewnić zmniejszony przepływ wsteczny.
      KROK KRYTYCZNY: W przypadku wystąpienia niewielkiego krwotoku należy przepłukać sterylną solą fizjologiczną przez 1-5 minut, aby zatrzymać powierzchowne krwawienie. Kontynuuj kolejne kroki.
7. Zwilż powierzchnię mózgu kroplą sterylnego PBS, aby utrzymać nawodnienie tkanki mózgowej.
8. Umieść 3 mm szkiełko nakrywkowe na powierzchni mózgu, aby całkowicie uszczelnić wokół wygenerowanego okienka 2,7 mm. Tabela referencyjna 2.
9. Osusz otaczającą kość czaszki, a następnie nałóż vetbond na całą odsłoniętą czaszkę, aby ponownie uszczelnić tkankę skóry głowy do kości czaszki i szkiełka nakrywkowego na miejscu. NIE WOLNO nakładać nadmiaru, ponieważ będzie on przeciekał pod szkłem i zmniejszy potencjał obrazowania.
10. Wymieszaj świeży proszek akrylowy i roztwór, około 30% (w/v) i nałóż na wierzch vetbond. Aby zapewnić szczelne uszczelnienie, lekko nałóż akryl na krawędź szkiełka nakrywkowego (Rysunek 2Biv). Tabela referencyjna 2.

UWAGA: Akryl dentystyczny jest niezwykle niebezpieczny, dlatego zalecamy używanie rękawiczek i maski podczas zabiegów.

KRYTYCZNY KROK: Akryl dentystyczny musi pozostać giętki podczas formowania, aby zapewnić dobre uszczelnienie i zredukować nadmiar. Nagromadzenie akrylu na oknie spowoduje rozmycie obrazów.

11. Pozwól myszom dojść do siebie w ciepłej klatce.

3. Promieniowanie stereotaktyczne (opcjonalnie) - Rysunek 3 (25 minut na mysz)

Różnice będą istniały w różnych używanych promiennikach i w związku z tym konieczna będzie optymalizacja. Użyliśmy specjalnie zaprojektowanego naświetlacza.

1. Znieczulenie myszy za pomocą izofluranu w dawce 4% do indukcji, a następnie 1,5-2% przez cały zabieg w ilości 0,5-1 litra O₂ na minutę i umieszczenie na niestandardowym ograniczniku głowy wewnątrz promiennika stereotaktycznego (ryc. 3Ai).
2. Uzyskaj skan CT wiązką stożkową 360° z lampą rentgenowską pracującą z napięciem 40 kVp i 0,05 mA przez filtr aluminiowy 2 mm. Użyj obrazu, aby pokierować ruchem sceny, kierując izocentrum promieniowania na prawą półkulę, upewniając się, że znajduje się ono centralnie w kierunku grzbietowo-brzusznym.
3. Włóż kolimator półkulowy, blok 8 mm x 11 mm.

KRYTYCZNY KROK: Kolimatory mogą być zaprojektowane dla wielu różnych konfiguracji, a więc mogą być ulepszone tak, aby włączały i wykluczały różne części mózgu. 8 mm x 11 mm określa półkulowy obszar mózgu.

4. Uzyskaj pojedyncze ortogonalne obrazy CT zarówno od góry (AP), jak i od dołu (PA) przez kolimator, aby jeszcze bardziej poprawić umiejscowienie mózgu, anatomiczne struktury kostne mogą być wykorzystane do odtwarzalności.
5. Wymień filtr aluminiowy na miedziany filtr zabiegowy o średnicy 0,93 mm i podaj połowę pożądanej dawki promieniowania za pomocą lampy rentgenowskiej pracującej z napięciem 225 kVp i 13 mA od góry w kierunku AP.
6. Przywróć suwnicę do dolnego położenia i ponownie podaj drugą połowę dawki promieniowania za pomocą lampy rentgenowskiej pracującej pod napięciem 225 kVp i 13 mA od dna w kierunku PA.

KRYTYCZNY KROK: Konieczne jest naświetlanie zarówno z góry, jak i z dołu, aby zmniejszyć gradient RT przez tkankę mózgową, pomaga to również w wyrównaniu izocentrum do środka mózgu.

4. Mikroskopia laserowa in vivo z dwoma fotonami - Rysunek 3 (1-3 godziny na sesję)

Różnice będą istniały w różnych używanych mikroskopach i w związku z tym konieczna będzie optymalizacja. Użyliśmy laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Carl Zeiss LSM510 META.

1. Znieczulić myszy środkiem znieczulającym zatwierdzonym przez IACUC, wstrzyknięciem Avertin IP w dawce 0,5 mg/g i oczyść okno za pomocą sprayu nasączonego alkoholem.
2. 1. (Opcjonalnie) Wstrzyknąć oznakowany barwnik naczyniowy 5-10 minut przed obrazowaniem, do żyły ogonowej przed obrazowaniem. Alexa647-Dekstran stosowany w stężeniu 0,35 μg/g lub APC-CD31 stosowany w stężeniu 0,2 μg/g. Patrz tabela 2.
   2. (Opcjonalnie) Wstrzyknąć fluoresceinę przez żyłę ogonową w dawce 7,7 mg/kg, 5 minut przed obrazowaniem, w celu nakreślenia guza. Tabela referencyjna 2.
3. Ustaw kanały w mikroskopie konfokalnym zgodnie z fluorochromem użytym w wygenerowanej myszy chimerycznej. Tabela 1 przedstawia kanały opisane w tym modelu.
4. Odwróć mysz na ruchomym stoliku mikroskopu i ustabilizuj głowę w odpowiedniej pozycji za pomocą plasteliny, którą można formować. (Rysunek 3Aii) Tabela referencyjna 2.

KRYTYCZNY KROK: ICW musi być prostopadły do punktu lasera i jako taki musi być ustawiony poziomo, aby zapewnić optymalne obrazowanie.

5. Włącz laser pierwszego kanału i użyj do ustawienia w środku ICW.
6. Użyj obiektywu 5x i zrób zdjęcie całego okna, aby użyć go jako mapy dla dalszych obrazów w wyższej rozdzielczości.
7. Obrazowanie powinno być wykonywane przy użyciu obiektywów "dalekiego zasięgu" 10X i 20X, aby uzyskać najlepszą jakość obrazu.

KRYTYCZNY KROK: Kanały i cele na 2PLM powinny być ustawione przy użyciu zmodyfikowanych komórek in vitro przed obrazowaniem modeli mysich, aby upewnić się, że wskazują one na prawidłowy fluorochrom.

Fluorochrom Wpryb GFP / Fluoresceina / FITC mCherry / Zapytanie ofertowe / DsRED APC / Alexa647 Autofluorescencja SHG Laser wzbudzający 458 nm 488 nm 543 nm 633 nm Laser kameleon 820 nm Filtr kolekcji 480-520 nm 500-550 nm 565-615 nm 650-710 nm 390-465 nm

Tabela 1. Konfiguracja fluorochromu. Przewodniki dla użytkownika, aby zobaczyć laser wzbudzenia i kolektor widm emisyjnych zastosowany dla każdego z kanałów dostępnych w modelu.

Wyniki

Opcjonalny etap rekonstytucji szpiku kostnego (BM) myszy NODscid powinien skutkować 80% pobraniem fluorescencyjnego szpiku „dawcy” u 100% myszy „gospodarzy” NODscid, jednak w przypadku innych szczepów niebędących immunokompromitowanymi konieczna będzie optymalizacja całkowitego naświetlania organizmu (TBI) w celu poprawy rekonstytucji. W przypadku nieudanej rekonstytucji myszy zachorują i szybko padną po zabiegu; osłabione myszy mogą wymagać dodatkowych źródeł pożywienia i wody.

Gotowe okno ICW powinno wyglądać jak to przedstawione na Rysunku 2Biv. Idealnie jest, aby wokół szklanego szkiełka nakrywki znajdował się wałek z akrylu, ponieważ zapewnia on wytrzymałość połączenia z czaszką. Doskonałe okna są powtarzalne i umożliwiają wielokrotne obrazowanie przez okres do 8 tygodni po ich wykonaniu (Rysunek 2C). Obrazy uzyskane przez te optymalne okna będą wyglądać jak te widoczne na Rysunku 3Bi. Niedoskonałości podczas tworzenia okna spowodują uzyskanie obrazów słabej jakości; na przykład pęcherzyki powietrza pod oknem uniemożliwią obrazowanie całych pól widzenia, a niektóre obszary będą wydawać się ciemne, ponieważ powietrze blokuje obrazowanie laserowe (Rysunek 3Bii). W przypadku nadmiaru kleju i akrylu na szkiełku nakrywce wystąpi wysoki poziom fluorescencji tła oraz obszary zamazane w polu widzenia, jak pokazano na Rysunku 3Biii; podobnie, jeśli na oknie znajduje się zanieczyszczenie, w polu widzenia widoczne będą małe kropki fluorescencji tła (Rysunek 3Biv).

Sukces obrazowania ICW jest zdeterminowany przez poprawność techniki chirurgicznej, jednak nawet optymalne ICW mogą napotkać problemy podczas sesji obrazowania. W związku z tym obrazy generowane charakteryzują się różnym zakresem i stopniem przejrzystości, co przedstawiono na Rysunku 3. Obraz o jakości publikacyjnej pokazany na Rysunku 3C powstaje, gdy wszystkie parametry są optymalne. Chociaż nie jest to możliwe w przypadku wszystkich myszy, można oczekiwać, że 80% generowanych obrazów będzie wyglądać w ten sposób. Jedną z głównych wad obecnej konfiguracji mikroskopowej jest zastosowanie laserów odwróconych. Myszy muszą być ustawione na grzbietach, co skutkuje nadmiernym stresem i dyskomfortem, które mogą prowadzić do trudności w oddychaniu podczas obrazowania. Powoduje to powstanie obrazu „paskowanego”, ponieważ oddychanie zakłóca proces uśredniania zachodzący podczas obrazowania, w którym każdy wiersz pikseli jest obrazowany czterokrotnie, a w końcowym obrazie wyświetlana jest średnia z tych czterech prób. Każdy ruch podczas uśredniania, taki jak ten spowodowany trudnościami w oddychaniu, stworzy artefakt pojawiający się jako linia na obrazie, co widać na Rysunku 3D. Problem ten mogą napotkać również myszy, które nie zostały dostatecznie znieczulone podczas obrazowania. Efekt „paskowania” można zmniejszyć, ograniczając uśrednianie obrazu do jednej próby, jednak zredukuje to jakość obrazu i może nie rozwiązać problemu. Alternatywnie myszy można ponownie ustawić lub powtórzyć próbę, gdy oddychanie wróci do normy. Zastosowanie pionowego 2PLM wyeliminowałoby ten problem, ponieważ myszy mogłyby być obrazowane „w pozycji brzusznej”. Dodatkowym problemem przy obrazowaniu na odwróconym 2PLM jest ograniczona dostępność przy pozycjonowaniu ICW po umieszczeniu myszy na mikroskopie, co prowadzi do powstawania obrazów „segmentowanych”, takich jak te widoczne na Rysunku 3E. W tym przypadku laser i szkiełko nakrywowe nie są ustawione prostopadle względem siebie, w związku z czym obrazowanie odbywa się pod kątem. Skutkuje to generowaniem obrazu „segmentowanego”, w którym boki pola widzenia nie są obrazowane. Problem ten można łatwo rozwiązać poprzez ponowne ustawienie myszy tak, aby upewnić się, że szkiełko nakrywowe jest całkowicie poziome po umieszczeniu na uchwycie głowy, jak pokazano na Rysunku 3Aii.

Model przedstawiony w niniejszej pracy został wykorzystany specjalnie do zbadania roli BMDC w unaczynieniu tkanki nowotworowej i wykazuje możliwość jednoczesnego użycia trzech różnych kanałów (Cherry, GFP, daleka czerwień - Alexa647 oraz APC), co sprawiło, że CFP i SHG stały się zbędne w tym konkretnym przypadku. Byliśmy w stanie obrazować myszy podłużnie przez maksymalnie 8 tygodni, badając rekrutację i integrację komórek BM z układem naczyniowym na poziomie pojedynczych komórek, bez negatywnych skutków wywołanych przez okno. Model ten demonstruje łatwość gromadzenia dynamicznych informacji o pochodzeniu i formowaniu się naczyń krwionośnych oraz interakcjach między różnymi typami komórek, co wcześniej było niemożliwe do osiągnięcia poprzez końcową analizę histologiczną.

Krok	Problem	Przyczyna	Rozwiązanie
1.4	Rozdrobnienie kości	Tępe narzędzia	Pobrać szpik kostny od świeżej myszy, używając zaostrzonych nożyczek lub nowej ostrza skalpela; fragmenty kości będą utrudniać wstrzyknięcie do żyły ogonowej
1.5	Niska wydajność ekstrakcji (niska lepkość)	Blaszki końcowe kości przecięte zbyt dystalnie; niewłaściwa metoda pobierania	Kości należy przecinać jak najbliżej proksymalnie i pobierać bezpośrednio do probówki, aby zapobiec rozpryskiwaniu Należy poświęcić odpowiednią ilość czasu, aby zmaksymalizować i starannie przeprowadzić ekstrakcję BM W razie potrzeby połączyć materiał od więcej niż jednej myszy w 1 ml
	Wysoka wydajność ekstrakcji (wysoka lepkość)	Zbyt mała ilość buforu do pobierania	Rozcieńczyć roztwór dodatkowym 0,1% BSA i podzielić na trzy myszy biorcze, maksymalnie do 500 μl na mysz
1.6	Niepowodzenie wstrzyknięcia dożylnego	Słaba wazodylatacja i słaba widoczność naczynia	Zwiększyć rozszerzenie naczyń za pomocą lampy grzewczej. Umieścić mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej z wbudowanym źródłem światła, aby ułatwić dostęp
1	Chore myszy	Infekcja	Uśmiercić myszy zgodnie z zasadami instytucji. Upewnić się, że ogony są oczyszczone przed wstrzyknięciem i sprawdzić sterylność wyektrahowanego BM w hodowli
	Śmiertelność myszy	Słabe przyjęcie BM	Sprawdzić % fluorescencyjnego przyjęcia BM przez martwą mysz. Zoptymalizować TBI dla używanej linii myszy Zwiększyć ilość wstrzykiwanego BM (np. użyć jednej myszy dawcy dla dwóch biorców)
2.4	Niewielkie krwawienie	Przerwanie opony twardej podczas wiercenia	Uciskać podkładkami żelowymi i stale płukać sterylnym roztworem soli fizjologicznej
	Silne krwawienie	Uszkodzenie mózgu podczas wiercenia	Uśmiercić mysz zgodnie z wytycznymi instytucji
2.8	Pęcherzyki powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym	Słaby kontakt z powierzchnią kory uniemożliwia prawidłowe ułożenie	Zdjąć szkiełko nakrywkowe i dodać więcej PBS, aby szkiełko „płynęło” na okno, co pozwoli usunąć pęcherzyki
2.10	Przesunięcie szkiełka nakrywkowego podczas klejenia	Masa akrylowa jest ciężka, wywiera nacisk na szkiełko nakrywkowe i przesuwa je	Należy używać pęsety do przytrzymania szkiełka nakrywkowego podczas nakładania vetbondu i akrylu
4.2	Niepowodzenie wstrzyknięcia dożylnego	Słaba wazodylatacja i słaba widoczność naczynia	Zwiększyć rozszerzenie naczyń za pomocą lampy grzewczej. Umieścić mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej z wbudowanym źródłem światła, aby ułatwić dostęp
4.4 Rycina 3C	Obrazy „pasiaste”	Utrudniony lub nieregularny oddech	Wyjąć mysz z ramy i pozwolić jej dojść do siebie Zwiększyć dawkę podawanego środka znieczulającego i skorygować pozycję, aby upewnić się, że szyja nie jest nadmiernie zgięta ani wyprostowana, co mogłoby utrudniać oddychanie
Rycina 3C	Obraz „segmentowany”	Mózg nie jest równoległy do obiektywów	Skorygować pozycję szkiełka nakrywkowego, aby upewnić się, że jest ono płaskie
	Naczynie niewidoczne	Wstrzyknięcie nie jest widoczne wewnątrz naczynia	Powtórzyć wstrzyknięcie do drugiej żyły ogonowej, ogrzać ogon, aby zapewnić dobrą wazodylatację
	Wysokie tło	Zabrudzone szkiełko nakrywkowe, Pęcherzyki powietrza, Akryl	Przetrzeć szkiełko nakrywkowe wilgotną ściereczką z 70% etanolem; nie moczyć, ponieważ płyn może przeniknąć pod akryl i uszkodzić tkankę mózgu

Tabela 2. Rozwiązywanie problemów. Wytyczne dotyczące kroków naprawczych wymaganych w przypadku problematycznych obszarów procedur.

Schemat 1. Diagram przebiegu eksperymentu. Przedstawiono w nim harmonogram zdarzeń w krokach eksperymentalnych 1-4. Modele mysie są przygotowywane w ciągu tygodnia, aby zapewnić prawidłową rekonstytucję BM, i nie są leczone lekiem aż do 7. dnia od powstania guza, aby zapewnić przyjęcie się przeszczepu nowotworowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą figurę.

Rycina 1. Rekonstytucja szpiku kostnego.(A) Procedura ekstrakcji szpiku kostnego i. Disekcja kości kończyny tylnej. ii. Wypreparowane kości udowe i piszczelowe z kończyn tylnych, oczyszczone i przygotowane do ekstrakcji. iii. Kości z usuniętą płytką końcową i przepłukane, wykazujące biały kolor pustych kości. (B) Schematy obrazujące rozmieszczenie żył bocznych w ogonie, wykorzystywanych do iniekcji.

Rysunek 2. Tworzenie ICW. (A) Zalecane ustawienie aseptyczne (B) i. Odsłonięta powierzchnia czaszki ukazuje punkty orientacyjne niezbędne do operacji; ICW powinno być rozmieszczone na prawej półkuli w równej odległości od bregmy i lambdy. ii. Okostna uniesiona roztworem lidokainy, przygotowana do usunięcia. iii. Haczyk stomatologiczny niezbędny do usunięcia fragmentu kości wywierconego wiertłem. iv. Gotowe ICW wykonane z akrylu stomatologicznego. (C) Trzy przykładowe okna demonstrują powtarzalność metody.

Rysunek 3. Przewidywane wyniki 2PLM. Wszystkie obrazy przedstawiają zieloną macierz pozakomórkową (BM), czerwony nowotwór oraz niebieskie (pseudokolor daleka czerwień) naczynia krwionośne. (A) i. Prezentacja ramy głowicy, która utrzymuje przepływ izofluranu wewnątrz irradiatora dla małych zwierząt. Widoczny jest również kolimator 8 x 11 mm poruszający się w obrębie gantry. ii. Mysz w pozycji odwróconej w ramce stabilizującej głowę wymaganej do obrazowania; plastyczna plastelina zapewnia odpowiednie dopasowanie wszystkich okien. (B) Zdjęcia obrazujące wyniki problemów z generowaniem okna z i. optymalnego okna, ii. okno z uwięzionymi pod spodem pęcherzykami powietrza, iii rozlanie akrylu na szkiełko nakrywkowe i iv. zanieczyszczenia na samym oknie. (C) Wskazuje problemy występujące podczas obrazowania po pomyślnym wygenerowaniu ICW i. optymalne obrazowanie ii. artefakty oddechowe powodują powstanie obrazu „prążkowanego” iii. osłonka nieprostopadła do wiązki lasera powoduje powstanie obrazu „segmentowego”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną grafikę.

Rysunek 4. Funkcjonalne zastosowania i adaptacje modelu. (A) Przetwarzanie obrazów CFP po obrazowaniu, w którym obraz GFP jest odejmowany od obrazu CFP, aby uzyskać rzeczywisty obraz CFP, który może zostać nałożony na pozostałe trzy kanały w kolorze białym. Zielony BM, czerwony guz, białe CSC, niebieskie (pseudokolor daleka czerwień) naczynia krwionośne (B) Demonstracja włókien kolagenowych, które mogą być obrazowane za pomocą SHG. Zielony dekstran, czerwony BM, cyjan kolagen (C) i. Komórki VEGFTrap in vitro wykazują sygnał GFP generowany przez VEGFtrap. ii. Obrazowanie in vivo wyraźnie pokazuje komórki VEGFtrap, a dodatkowo podkreśla łatwość przełączania kanałów w celu zademonstrowania analizowanego układu. Zielony VEGFTRap + guz, czerwony BM, niebieskie (pseudokolor daleka czerwień) naczynia krwionośne. (D) Demonstracja gromadzenia się fluoresceiny w zrębie guza, a nie bezpośrednio w komórkach, co potwierdza brak nałożenia zielonego sygnału na czerwony guz. Zielona fluoresceina, czerwony guz. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek.

Dyskusja

Trzy kanały opisane na wszystkich dotychczasowych obrazach są wymienne dla trzech markerów będących przedmiotem zainteresowania w innych modelach i pozostawiają badaczom nieoceniony zestaw narzędzi do badania wielu typów komórek i interakcji. Konieczne jest planowanie, aby upewnić się, że wszystkie markery i typy komórek z powodzeniem zintegrowały cząsteczkę fluorescencji reporterowej w odrębnym kanale.

Oprócz standardowych trzech zastosowanych tutaj kanałów, byliśmy również w stanie zintegrować czwarty kanał CFP (rysunek 4A) i kanał kolagenowy ⁷ oparty na SHG (rysunek 4B). Rozszerza to możliwość przyjrzenia się interakcjom komórkowym in vivo , a ponadto pozwala użytkownikowi na mieszanie populacji w celu zbadania określonych interakcji komórka-komórka, przy jednoczesnym zachowaniu dwóch kanałów dla innych markerów. Na przykład przyjrzeliśmy się komórkom nowotworowym (RFP) i rakowym komórkom macierzystym (CFP) w stosunku 1:3 z zainteresowaniem porównaniem ich interakcji wewnątrznowotworowych (ryc. 4A). Zaobserwowaliśmy, że 7 dni po implantacji populacji mieszanej stosunek ten został utrzymany i obie populacje komórek były nadal widoczne.

Kanał CFP stwarza problemy techniczne ze względu na nakładanie się na kanał GFP zarówno w widmach wzbudzenia, jak i emisji, i jako taki wymaga przetwarzania po obrazowaniu w celu zdefiniowania prawdziwych komórek CFP+ od tych, które faktycznie są GFP+. Przetwarzanie po obrazowaniu można przeprowadzić bezpośrednio na mikroskopach 2-fotonowych wbudowanych w oprogramowanie Zeiss LSM, dzięki czemu obraz GFP jest odejmowany od obrazu CFP, co powoduje, że prawdziwe komórki CFP pozostają w tyle (ryc. 4A). Przesłanka do odejmowania proporcji zależy od równie jasnych obrazów i wynika z tego, że laser CFP (458 nm) fluoryzuje zarówno komórki CFP, jak i GFP, podczas gdy laser GFP (488 nm) jest zbyt wysoki, aby fluoryzować komórki CFP. Oprócz CFP udało nam się również użyć wcześniej opublikowanych konfiguracji, aby przyjrzeć się poziomom SHG, a tym samym zobrazować włókna kolagenowe, które tworzą błonę podstawną otaczającą naczynia krwionośne (Figura 4B).

Inna adaptacja tego modelu wykorzystuje specjalnie zbudowany promiennik dla małych zwierząt, który ma możliwość wykorzystania stereotaktycznego promieniowania kierowanego do naświetlania odcinków tkanek o średnicy zaledwie 2 mm. Kierując okno z napromieniowaniem, można przyjrzeć się wpływowi, jaki promieniowanie wywiera na znajdującą się pod nim tkankę. Niedawno opublikowaliśmy badanie, w którym przyjrzeliśmy się wpływowi promieniowania na normalną tkankę mózgową w odniesieniu do rekrutacji BMDC do układu krwionośnego, patrząc w szczególności na ich rolę w zmianach w tkankach po promieniowaniu. Odkryliśmy, że rekrutacja BMDC była zależna zarówno od czasu, jak i dawki w normalnej tkance ¹¹.

Możliwe jest zbadanie mechanizmów dostarczania i integracji środków terapeutycznych, pod warunkiem, że lek jest oznaczony markerem fluorescencyjnym. Podczas naszych badań udało nam się prześledzić produkcję VEGFTrap, leku antyangiogennego, który blokuje całą sygnalizację VEGF w lokalnym obszarze produkcji ²⁵. Poprzez genetyczną modyfikację naszych komórek nowotworowych w celu ekspresji genu VEGFtrap sprzężonego z IRES do EGFP (ryc. 4Ci) i przy użyciu "dawcy" BM RFP, byliśmy w stanie zobrazować produkcję EGFP: VEGFtrap, interakcję BMDC i unaczynienie jednocześnie (ryc. 4Cii). Pokazało to wszechstronność modelu i dostępnych kanałów. Możliwe jest również przyjrzenie się kinetyce leku ze względu na obietnicę rozdzielczości pojedynczej komórki. Fluoresceina (GFP+) jest stosowana do wyznaczania guzów podczas operacji, aby zapewnić osiągnięcie maksymalnej resekcji ²⁶. Poprzez wstrzykiwanie dożylne podczas obrazowania można wykazać, że rozgraniczenie następuje NIE poprzez aktywny wychwyt fluoresceiny do samych komórek nowotworowych, ale zamiast tego poprzez gromadzenie się leku w obszarze zrębu z czasem, co widać po braku kolokalizacji 10 minut po wstrzyknięciu fluoresceiny (ryc. 4D).

Ogólnie rzecz biorąc, nasza strategia łączy nowatorskie i istniejące techniki w celu uzyskania unikalnej platformy eksperymentalnej, która jest korzystna w badaniu dynamicznych interakcji komórkowych. Strategia ta okazała się nieocenionym podejściem do badania dynamicznej ewolucji pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości BMDC, guza i normalnego unaczynienia mózgu w odpowiedzi na terapię wewnątrzczaszkową. Obrazowanie przyżyciowe może zapewnić lepsze zrozumienie molekularnych regulatorów rekrutacji, migracji i różnicowania BMDC w wewnątrzczaszkowym unaczynieniu guza mózgu, a także wielu innych dynamicznych procesów, które można dostosować do innych dziedzin badań. Hamowanie przypuszczalnych czynników, które regulują BMDC w połączeniu z innymi strategiami terapeutycznymi, może pomóc w określeniu dokładnego czasu terapii skojarzonych. Co więcej, strategia ta może zostać zaadaptowana do wielu przyszłych projektów wykorzystujących nie tylko barwniki barwiące in vivo in vivo , ale także inhibitory małocząsteczkowe i nanocząstki, które są znakowane fluorescencyjnie, co pozwala naukowcom śledzić wzorce dystrybucji i migracji bardziej ukierunkowanych środków terapeutycznych, a także spojrzeć podłużnie na ich kinetykę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
odczynnik
NODSCID myszy	Jackson Lab	001303	8-tygodniowe
myszy B5/EGFP	Jackson Lab	003516
myszy ACTB/DsRED	Lab	005441
Żel przeciwłzowy	Novartis	T296/2
2% lidokaina-epinefryna	Bimeda MTC	25SP	Zastosowanie schludny
Vetbond	3M	1469SB
Samoutwardzalny zestaw akrylowy	Bosworth	166260	Użyj ~30% (w/v)
10K MW Dextran-Alexa647	Invitrogen	D22914	@ 0,6 mg / kg w soli fizjologicznej
CD31-APC	BDPharmingen	551262	Użyj @ 0,3 mg / kg w soli fizjologicznej
AK-fluor (Fluoresceina) 10%	AKORN inc.	NDC 17478-253-10	Użyj @ 7,7 mg/kg w roztworze soli fizjologicznej
Betadine	Produkty Purdue	NDC 67618-150
Equipment
fine Pęseta	VWR	82027-402
Nożyczki do precyzyjnego rozwarstwiania	VWR	25870-002
Igła 22G	BD	305156
27G 0,5 ml strzykawka TB	BD	305620
Ręczne wiertło Micro-Drill	Fine Science Tools	18000-17
Wiertło Trephine 2,7 mm	Fine Science Tools	18004-27
10 μ l Strzykawka 30G Hamilton	Sigma Aldrich	20909-U
Szkiełko nakrywkowe 3 mm	Warner Instruments	64-0720 CS-3R
Gogle fluorescencyjne	BLS	FHS/T01	Podstawowa rama na głowę
Rama stereotaktyczna	stoelting	51950
Ogranicznik myszy do wstrzykiwań dożylnych	Brain Tree Lifescience	MTI