Arginina-wazopresyna (AVP) kontroluje precyzyjne dostrojenie homeostazy wody w organizmie poprzez ułatwienie reabsorpcji wody przez główne komórki nerkowe. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych komórek przewodu zbiorczego rdzenia wewnętrznego rdzenia szczura, odpowiednich do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Hodowla pierwotnych komórek przewodu rdzeniowego wewnętrznego rdzenia szczura
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Arginina-wazopresyna (AVP) ułatwia reabsorpcję wody przez główne komórki przewodu nerkowego, a tym samym precyzyjnie dostraja homeostazę wody w organizmie. AVP wiąże się z receptorami wazopresyny V2 (V2R) na powierzchni komórek i w ten sposób indukuje syntezę cAMP. Stymuluje to procesy sygnalizacji komórkowej prowadzące do zmian w fosforylacji kanału wodnego akwaporyny-2 (AQP2). Kinaza białkowa A fosforyluje AQP2, a tym samym wyzwala translokację AQP2 z pęcherzyków wewnątrzkomórkowych do błony plazmatycznej, ułatwiając reabsorpcję wody z moczu pierwotnego. Aberracje w uwalnianiu AVP z przysadki lub sygnalizacji aktywowanej przez AVP w głównych komórkach mogą powodować odpowiednio moczówkę prostą centralną lub nerkopochodną; podwyższony poziom AVP w osoczu krwi jest związany z chorobami sercowo-naczyniowymi, takimi jak przewlekła niewydolność serca i zespół nieprawidłowego wydzielania hormonu antydiuretycznego.
Tutaj prezentujemy protokół hodowli komórek IMCD (ang. primary mespinary collector duct) szczura, które endogenicznie wyrażają V2R i AQP2. Komórki te nadają się do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kontroli AQP2, a tym samym do odkrycia nowych celów leków w leczeniu chorób związanych z rozregulowaniem reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP. Komórki IMCD są pozyskiwane z wewnętrznych rdzeni nerkowych szczurów i są używane do eksperymentów sześć do ośmiu dni po wysiewie. Komórki IMCD mogą być hodowane w zwykłych szalkach do hodowli komórkowych, kolbach i płytkach do mikromiareczkowania o różnych formatach, procedura trwa tylko kilka godzin i jest odpowiednia dla standardowych laboratoriów hodowli komórkowych.
Wprowadzenie
W głównych komórkach przewodu zbiorczego nerki, arginina-wazopresyna (AVP) kontroluje reabsorpcję wody poprzez stymulację wprowadzania kanału wodnego akwaporyna-2 (AQP2) do błony plazmatycznej. AVP wiąże się z receptorem wazopresyny typu 2 sprzężonym z białkiem G (V2R), stymulując cyklazę adenylową, a tym samym tworzenie cAMP. Zainicjowanie tej kaskady sygnalizacyjnej prowadzi do aktywacji kinazy białkowej A (PKA). PKA fosforyluje AQP2 w serynie 256 (S256), co jest kluczowym czynnikiem wyzwalającym jego redystrybucję z pęcherzyków wewnątrzkomórkowych do błony komórkowej. Wprowadzenie membrany ułatwia reabsorpcję wody wzdłuż gradientu osmotycznego i precyzyjnie dostraja homeostazę wody w organizmie.
Dysregulacja reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP, spowodowana aberracjami wydzielania AVP lub sygnalizacją aktywowaną przez AVP, powoduje lub jest związana z poważnymi chorobami. Zmniejszona absorpcja zwrotna wody spowodowana mutacjami V2R lub AQP2 prowadzi do moczówki prostej nerkopochodnej, podczas gdy podwyższony poziom AVP w osoczu krwi wiąże się z nadmiernym wchłanianiem zwrotnym wody w chorobach sercowo-naczyniowych, takich jak przewlekła niewydolność serca i zespół nieprawidłowego wydzielania hormonu antydiuretycznego (SIADH).
Znaczenie reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP wynika nie tylko z jej wpływu na chorobę. Indukowana przez AVP translokacja pęcherzyków zawierających AQP2 do błony plazmatycznej i fuzja z nią stanowi ściśle zależny od cAMP proces egzocytarny, który obecnie nie jest dobrze poznany. Innymi przykładami egzocytozy zależnej od cAMP są wydzielanie reniny w nerkach i wydzielanie H+ w żołądku. W związku z tym wyjaśnienie mechanizmów molekularnych rządzących translokacją AQP2 w głównych komórkach nerek nie tylko pomaga zrozumieć podobne procesy molekularne w innych typach komórek, ale może również utorować drogę do nowych terapii w leczeniu chorób związanych z zaburzeniami reabsorpcji wody za pośrednictwem AVP.
Wyjaśnienie mechanizmów kontrolujących AQP2 wymaga zebrania modeli głównych komórek kanału. W tym celu dostępnych jest wiele różnych linii komórkowych nerek ssaków. Modele te mają jednak kilka wad. W wielu układach komórkowych poziom białka AQP2 jest niski (Tabela 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1)1-10, inne ektopowo nadekspresja ludzka (MCD4, WT10)11,12 lub szczurza (CD8)13 AQP2. W komórkach MCD4 i COS-7 receptor V2 nie ulega ekspresji. O ile nam wiadomo, nie ma stałej linii komórkowej jako dostępnego modelu, która wywodzi się z wewnętrznego przewodu zbiorczego rdzenia nerkowego, tej części nerki, w której ekspresja AQP2 jest najobfitsza, ale z korowego przewodu zbiorczego1,11,13-16. Takimi modelami komórkowymi są na przykład szeroko stosowane uwiecznione linie komórkowe mpkCCD (np. 17) lub niedawno powstałe linie komórkowe mTERT-CCD14. Obie linie komórkowe endogennie wyrażają AQP2 i V2R, ale ponieważ pochodzą z korowego przewodu zbiorczego, najprawdopodobniej zawierają inny proteom w porównaniu z komórkami wewnętrznego rdzeniowego przewodu zbiorczego (IMCD). Muszą one na przykład wyrażać różne systemy transportowe Na+.
Tutaj prezentujemy protokół hodowli pierwotnych komórek IMCD wykazujących endogenną ekspresję V2R i AQP2. Model ten zatem najwierniej odwzorowuje sytuację fizjologiczną w nerkowym przewodzie zbiorczym. Ponieważ założenie hodowli wymaga tylko standardowego sprzętu laboratoryjnego, inne laboratoria mogą z łatwością przyjąć to podejście.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie
- Przygotowanie potraw z kultur
- Rozmrozić kolagen typu IV O/N w temperaturze 4 °C i rozpuścić go w 0,1% sterylnym kwasie octowym. Objętość, której należy użyć, zależy od rodzaju i liczby naczyń, w których mają zostać wysiane komórki. Stosować 2 μg/cm2.
- Inkubować naczynia przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej i dwukrotnie obmyć wodą destylowaną (A. tridest).
- Pozostaw naczynia do prawidłowego wyschnięcia.
- Suplementacja pożywki
- Zwiększ poziom glukozy do 4,5 g/l, dodając 1,75 g glukozy do 500 ml pożywki. Aby dostosować pożywkę do 600 mosmol, dodaj 100 mM NaCl i 100 mM mocznika, aby zwiększyć osmolarność odpowiednio o 200 mosmol i 100 mosmol.
- Dodać 1% aminokwasów endogennych, 1% ultrosera, 500 μM DBcAMP, 20 U/ml nystatyny i 0,25 μg/ml gentamycyny (rozcieńczenie roztworu podstawowego 1:200 o stężeniu 50 μg/ml) do 600 pożywki MOSMOL DMEM świeżo w dniu przygotowania.
- Roztwór enzymatyczny
- Dodać 1 mg/ml hialuronidazy i 2,2 mg/ml kolagenazy do 0,25 μg/ml gentamycyny i nystatyny zawierających DPBS. Przygotować 1 ml tego roztworu enzymatycznego do trawienia 2 rdzeni wewnętrznych nerek. Roztwór musi być wysterylizowany przez filtrację i jest przechowywany w probówkach Falcon o pojemności 50 ml.
2. Hodowla komórek IMCD (Root Rin) Inner Mespinary Collector Duct (IMCD)
Wszystkie procedury postępowania ze zwierzętami muszą być przeprowadzane zgodnie z lokalnymi i federalnymi przepisami.
- Znieczulać szczury w CO2 (w pudełku nasyconym CO2 ) lub izofluranem (jednostka anestezjologiczna U-400, Univentor Ltd., Malta; przepływ powietrza 350-400 ml/min z 2-2,5% izofluranem). Odciąć głowy zwierzętom w celu wykrwawienia, co pozwala na dokładne wykrycie granicy między białawym rdzeniem wewnętrznym a ciemniejszym zewnętrznym. Ponadto krwawienie minimalizuje liczbę izolowanych erytrocytów. Usunąć nerki i umyć je w sterylnych DPBS z dodatkiem gentamycyny i nystatyny (patrz wyżej) na lodzie. Wszystkie dalsze czynności należy wykonywać w sterylnych, czystych warunkach laboratoryjnych.
- Przenieść nerki z roztworu DPBS na sterylny kompres w celu usunięcia nadmiaru płynu. Usuń tłuszczową torebkę nerkową za pomocą sterylnych kleszczyków i nożyczek.
- Mając nerkę nadal zamocowaną w kompresie, przeciąć lekko obok osi podłużnej zewnętrznej (korowej) strony. Upewnij się, że nie przecinasz go całkowicie, ale pozostawiasz go w jednym kawałku, połączonym w miednicy nerkowej.
- Zakrzywionymi nożyczkami ostrożnie rozetnij białawe rdzeń wewnętrzny, który jest otoczony różowo połyskującym rdzeniem zewnętrznym. Zebrać je w DPBS, zawierającym gentamycynę i nystatynę, w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm na lodzie.
- Gdy wszystkie rdzenie zostaną wyizolowane i zebrane na lodzie, zmniejsz objętość DPBS do poziomu, w którym są one po prostu pokryte buforem. Za pomocą sterylnej żyletki pokrój rdzeń w kostkę o średnicy 5 mm3.
- Rozpuść i zaokrąglij ostry koniec sterylnej pipety Pasteura, trzymając ją krótko w płomieniu. Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że pipeta jest schłodzona.
- Przenieść zawiesinę tkankową do 50 ml probówek Falcon zawierających świeżo przygotowany sterylny roztwór enzymatyczny z hialuronidazą i kolagenazą (patrz 1.3.1) za pomocą zaokrąglonej pipety Pasteura. Zamknij szczelnie pokrywę i inkubuj w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu (220 obr./min) w zwykłej łaźni wodnej przez 1,5 - 2 godziny.
- W celu rozprowadzenia zawiesiny, należy kilkakrotnie odpipetować mieszaninę w górę i w dół za pomocą okrągłej pipety Pasteura (patrz wyżej), aż zawiesina stanie się jednorodnie mętna.
- Odwirować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 16 °C. Odrzucić supernatant, dokładnie zawiesić osad w DPBS, zawierającym gentamycynę i nystatynę, a następnie ponownie odwirować. Powtórz ten krok prania raz.
- Zawiesić komórki w całkowicie uzupełnionej pożywce i umieścić je w szalkach hodowlanych i/lub płytkach z mikromiareczkami. Przygotowanie 2 rdzeni (1 zwierzę) da wystarczającą ilość komórek na jedno 60 mm naczynie hodowlane.
- Po 24 godzinach umyj komórki dwukrotnie 600 mosmol DMEM i dodaj świeże podłoże. W ciągu następnego tygodnia komórki należy umyć 2-3 razy (ryc. 1). 6-8 dni po wysianiu komórki IMCD można wykorzystać do eksperymentów. Pamiętaj, aby inkubować je w pożywce bez DBcAMP i nystatyny przez 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. W przeciwnym razie AQP2 będzie zlokalizowany wyłącznie w błonie komórkowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pomywna hodowla pierwotnych komórek IMCD szczura skutkuje powstaniem konfluentnej warstwy jednowarstwowej 6-8 dni po wysianiu (Rycina 2). W szalce hodowlanej o średnicy 60 mm znajduje się około 6 x 106 komórek. Komórki ściśle przylegają do szalek hodowlanych, ponieważ zostały one pokryte kolagenem typu IV, składnikiem błony podstawnej18. W związku z tym komórki IMCD nie odrywają się nawet podczas kilku dokładnych procedur płukania. Do 80% hodowanych komórek wykazuje endogenną ekspre...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania i hodowli pierwotnych komórek IMCD szczurów. Podejście daje do 21cm2 komórek od jednego szczura20. Eksperyment wymaga standardowego sprzętu do hodowli komórkowej i może być przeprowadzony przez jedną osobę w ciągu około 6 godzin. Dlatego podejście to jest odpowiednie jako standardowa metoda laboratoryjna.
Pierwotne komórki IMCD szczura można wysiewać w szalkach hodowlanych o różnej wielkości, od płytek 96-dołkowych do szale...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; KL 1415/3-2 i KL 1415/4-2).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolagen typu IV Mysz | BD Biosciences | 356233 | |
| Hialuronidaza | SIGMA | H6254 | |
| Kolagenaza typu CLS-II | Biochrom AG | C2-22 | |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 | |
| Nystatyna | SIGMA | N4014 | |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 | |
| Aminokwasy endogenne (NEA) | Biochrom AG | K0293 | |
| Gentamycyna | Invitrogen GIBCO | 15710 | |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
Bibliografia
- Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
- Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
- Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
- Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
- Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
- Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
- Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
- Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
- Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
- Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
- Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
- Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
- Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
- Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
- Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
- Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
- Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
- Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
- Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
- Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
- Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
- Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
- Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
- Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
- Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
- Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
- Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.
A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Enno Klussmann
instead of:
Enno Klussman
