Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Summary

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Abstract

Badanie funkcji genu na skalę genomu za pomocą interferencji RNA (RNAi) daje ogromne nadzieje na szybką identyfikację chemicznie podatnych na uszkodzenia komórek rakowych. Ograniczeniem potencjału tej technologii jest niemożność szybkiego określenia mechanistycznych podstaw wyników fenotypowych, a tym samym poinformowania o rozwoju molekularnie ukierunkowanych strategii terapeutycznych. Przedstawiamy tutaj metody dekonstrukcji fenotypów komórkowych indukowanych przez celowanie genowe za pośrednictwem RNAi przy użyciu multipleksowanych systemów reporterowych, które umożliwiają monitorowanie kluczowych procesów związanych z komórkami rakowymi. Ta metodologia badań przesiewowych o wysokiej zawartości jest wszechstronna i może być łatwo dostosowana do badań przesiewowych innych typów dużych bibliotek molekularnych.

Introduction

Na rynku dostępne są różne reportery oparte na lucyferazie do monitorowania różnorodnych procesów biologicznych komórek. Większość tych konstruktów DNA koduje białka lucyferazy, które są indukowane do ekspresji przez określone bodźce komórkowe lub perturbacje. Najbardziej wytrzymałe reportery oparte na transkrypcji umieszczają ekspresję enzymu lucyferazy pod kontrolą syntetycznych elementów wzmacniających lub regionów promotora genów, dobrze znanych ze względu na ich niezawodność w zgłaszaniu fizjologicznie istotnego zdarzenia transkrypcyjnego^1,2. Istnieją również systemy lucyferazy transreporterowej, które wykorzystują GAL4-UAS do napędzania ekspresji białka lucyferazy. Gal4 jest aktywatorem transkrypcji drożdży, a UAS jest wzmacniaczem, z którym Gal4 specyficznie się wiąże, aby aktywować transkrypcję sekwencji genów umieszczonych poniżej niego³. Tego typu systemy lucyferazy są zazwyczaj wspierane przez dwa plazmidy DNA - jeden koduje białko GAL4 połączone z częścią regulatorową białka będącego przedmiotem zainteresowania, a drugi koduje białko lucyferazy umieszczone pod kontrolą jednej lub więcej sekwencji UAS. W ten sposób sygnał lucyferazy komórkowej odzwierciedla poziom aktywności białka będącego przedmiotem zainteresowania. Innym powszechnym zastosowaniem reporterów opartych na lucyferazy jest monitorowanie stabilności białek, w którym białko będące przedmiotem zainteresowania jest łączone z enzymem lucyferazy⁴. Niezależnie od typu reportera, odnotowuje się tu zastrzeżenie emptor, ponieważ nie można zakładać, że specyfika któregokolwiek z reporterów została dobrze przesłuchana. W związku z tym wymagana jest należyta staranność przy włączaniu nowych konstruktów reporterskich do każdej strategii badawczej.

Wybór odczytu enzymu lucyferazy może być równie ważny, jak wiarygodność elementów DNA, które kontrolują jego ekspresję. Podczas gdy lucyferazy świetlików (FL) są najczęściej stosowanym enzymem w dostępnych na rynku konstruktach, pojawienie się nowych systemów reporterowych lucyferazy, które nie wymagają ATP (jak w przypadku reakcji opartych na FL) lub zawierają bardziej stabilne enzymy, które emitują silniejsze sygnały, obiecuje poprawę wydajności i niezawodności tej platformy badawczej. Ważną uwagą dotyczącą wyboru reporterów lucyferazy w badaniach chemicznych jest podatność FL na hamowanie chemiczne, które może prowadzić do fałszywych doniesień. Z naszego doświadczenia wynika, że inne enzymy, takie jak lucyferazy Renilla lub Gaussia (odpowiednio RL i GL), które wykorzystują koelennterazinę jako substrat, są mniej łatwo hamowane przez małe cząsteczki⁵.

Najczęstszym formatem do multipleksowania odczytów lucyferazy jest użycie FL i RL, głównie ze względu na dostępność łatwych w użyciu zestawów z możliwością sekwencyjnego pomiaru aktywności enzymatycznej z pojedynczej próbki. W większości zestawów próbki są najpierw wystawiane na działanie lucyferyny, aby ujawnić poziomy aktywności FL, a następnie odczynnik hartujący, który jest jednocześnie osadzany z koelennterazyną, aby uzyskać wtórny sygnał RL. Wraz z dodaniem innych lucyferazy, które mogą być wydzielane, takich jak GL lub które wykorzystują jeszcze inny substrat, taki jak lucyferazy Cypridina (CL), pojawiła się większa liczba możliwości generowania danych o wysokiej zawartości przy użyciu lucyferazy. Przykład badania przesiewowego RNAi całego genomu przy użyciu tej techniki można znaleźć tutaj⁶. Ten postęp technologiczny z kolei pobudził rozwój specyficznych mechanizmów wygaszania każdego typu enzymu lucyferazy w celu ograniczenia przesłuchów⁷. W naszych rękach zauważamy większą częstotliwość "efektów brzegowych" (niewytłumaczalnych trendów w aktywności komórkowej związanych z krawędzią płytek hodowlanych o wysokim mianie), z wydzielanymi lucyferazy, takimi jak GL lub CL. Z drugiej strony, takie wydzielane lucyferazy są przydatne w testach kinetycznych, ponieważ umożliwiają pobieranie próbek sygnału bez zafałszowania żywotności komórek.

Na potrzeby naszego badania przedstawionego tutaj, będziemy jednocześnie monitorować aktywność trzech procesów komórkowych istotnych dla raka: szlaków transdukcji sygnału p53, Kras i Wnt. Reporterzy uwzględnieni w naszym badaniu to reporter pp53-TA-Luc FL firmy Clontech (zwany dalej reporterem p53-FL)⁸, system reporterski Elk1-GAL4/UAS-CL (zwany dalej reporterem Elk-1; Agilent) i reporter 8X TCF RL, który zawiera wiele syntetycznych elementów wzmacniających rozpoznawanych przez regulatory transkrypcji szlaku Wnt, znane jako czynniki komórek T (lub TCF)^9-11.

Protocol

Cały protokół trwa około 4 dni.

1. Przygotowanie komórek do transfekcji siRNA i reporterowej

Przedstawimy tutaj protokół do przeszukiwania bibliotek siRNA przy użyciu małego zestawu siRNA (384 różne zestawy pul siRNA w formacie 96 dołków, z których każda składa się z 4 siRNA ukierunkowanych na pojedynczy gen) z biblioteki siRNA dla celów ilustracyjnych. W tym konkretnym badaniu wykorzystamy komórki HCT116, które wykazują dewiacyjną sygnalizację Wnt i Kras oraz aktywność p53. Właściwa linia komórkowa w badaniach mających na celu zbadanie innych procesów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania będzie musiała zostać zidentyfikowana i oceniona w podobny sposób.

1. Umyj⁵ x 10 cm 2 płytki z 80-90% zlewającymi się komórkami HCT116 PBS, a następnie zbierz komórki przez trypsynizację przy użyciu 1 ml roztworu/płytki trypsynizacji, a następnie zneutralizuj 10 ml zmodyfikowanej pożywki orła (DMEM) firmy Dulbecco zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny/płytki.
2. Przenieść zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy ~130 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml DMEM / 2% FBS / 1% penicyliny / streptomycyny.
3. Policz liczbę komórek za pomocą licznika komórek, a następnie przygotuj roztwór komórek z 10⁵ komórkami / ml, zachowaj 150 ml zawiesiny komórek do następnego kroku. Płytka 10:⁴ komórki (100 μl) w każdym dołku 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej za pomocą automatycznego dozownika płynów Multidrop (zwanego dalej Multidrop). W tym przypadku zawiesina komórek powinna być wystarczająca do posiewu płytek 12 x 96-dołkowych.
4. Inkubować płytki z komórkami w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniem CO_{2 ,} przygotowując mieszaninę do transfekcji.

2. Przygotowanie roztworu stockowego do konstruowania reportera

1. Wyizoluj wysokiej jakości DNA reporterowe za pomocą standardowych zestawów midiprep (NucleoBond Xtra Midi produkowane przez Clontech) i rozcieńcz DNA do końcowego stężenia 1 mg / ml dla każdego reportera.
2. Przygotować 100 μl roztworu podstawowego do konstruowania reportera, łącząc 30 μl p53-FL, 30 μl 8X TCF-RL, 30 μl Elk1-Gal4, 6 μl UAS-CL i 4 μl_H2O, aby uzyskać mieszaninę DNA o końcowym stosunku reporterów 1:1:1:0,2. Końcowe stężenie DNA w tym roztworze podstawowym mieszanki DNA wynosi 0,3 mg/ml.

3. Przygotowanie mieszanki do transfekcji siRNA/DNA

W tej części protokołu przygotujemy mieszanki transfekcji siRNA/DNA, które będą wystarczające do transfekcji płytek 12 x 96 dołków. W przypadku tej biblioteki testowej składającej się z 4 x 96-dołkowej płytki siRNA będziemy transfekować każdą pulę siRNA w trzech egzemplarzach. Odczynnik do transfekcji, którego będziemy używać, nazywa się Effectene (Qiagen). W naszych rękach jest to jedyny odczynnik, który działa na rzecz jednoczesnego dostarczania siRNA i DNA do hodowanych komórek.

1. Rozcieńczyć 80 μl roztworu podstawowego konstruktu reporterowego w 8 ml buforu EC (Effectene Kit) w celu uzyskania roztworu DNA o końcowym stężeniu 3 μg/ml. Ogólnie rzecz biorąc, przygotuj wystarczającą ilość mieszanki roztworów DNA do natychmiastowego użycia.
2. Płytkę 20 μl tego roztworu DNA do każdego dołka 96 dołków / płytki. Liczba 96 płytek dołkowych będzie zależała od tego, ile pul siRNA zostanie przetestowanych. Na przykład w tym przypadku będziemy potrzebować 4 x 96 płytek dołkowych, aby ocenić 384 różne pule siRNA.
3. SiRNA, które mają być badane, powinny mieć podstawowe stężenie 5 μM. Jeśli nie, można je powieleć i rozcieńczyć do tego stężenia przy użyciu zalecanego buforu rozcieńczającego związanego z każdą biblioteką.
4. Przenieść 2 μl każdego zasobnika siRNA o wielkości 5 μM do odpowiedniego dołka płytki PCR zawierającej rozcieńczony materiał podstawowy DNA za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy Biomek. W zależności od skali badania może wystarczyć pipetor wielokanałowy.
5. Teraz dodamy 1 μl roztworu Enhancer (zestaw Effectene) do każdego dołka płytki DNA/siRNA. Również w tym przypadku można to osiągnąć za pomocą automatycznego urządzenia do obsługi cieczy lub pipetatora wielokanałowego.
6. Pozostawić reakcję wzmacniacza w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie dodać 3 μl odczynnika do transfekcji Effectene do każdego dołka i inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 10 minut.
7. Aby zatrzymać tworzenie się kompleksu transfekcji, dodaj 10 μl DMEM / 2% FBS / 1% penicyliny / streptomycyny do każdego dołka płytki PCR.
8. Przenieść 10 μl mieszanki transfekcyjnej do każdego dołka z 96-dołkowej płytki zawierającej komórki (pobranej z inkubatora komórkowego). Ponieważ każda transfekcja będzie wykonywana w trzech powtórzeniach, ta sama mieszanina zostanie nałożona na dwie dodatkowe 96-dołkowe płytki zawierające komórki.
9. Inkubować komórki z mieszaninami transfekcji dodanymi w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku z 5% CO₂ przez 36 godzin.

4. Określ aktywność lucyferazy na podstawie próbek komórek

Po 36 godzinach, aktywność lucyferazy jest gotowa do pomiaru w transfekowanych komórkach. Punkt końcowy powinien być określany dla każdego eksperymentu. W naszym badaniu 36-godzinny czas inkubacji dał wcześniej wystarczająco silny sygnał do określenia znaczenia. Ponieważ badanie to obejmuje wiele reporterów (jeden wydzielany do pożywki hodowlanej, a dwa inne ulegają ekspresji w cytoplazmie komórki), uzyskamy pomiary zarówno z pożywki hodowlanej, jak i lizatu komórkowego.

1. Wykrywanie aktywności CL w pożywce hodowlanej:
   1. 20 μl pożywki hodowlanej umieszcza się w postaci repliki na białej, nieprzezroczystej płytce 96-dołkowej (przy użyciu płynu do obsługi Biomek lub pipetora wielokanałowego).
   2. Dodać 20 μl buforu do oznaczania CL (systemy celowania) do każdej studzienki.
   3. Dodać 10 μl substratu lucyferyny Cypridina (systemy celownicze) do każdej studzienki i wykryć aktywność CL za pomocą luminometru (na przykład czytnika płytek Pherastar produkowanego przez BMG).
2. Wykrywanie aktywności FL i RL:
   1. Poddać komórki lizie, usuwając najpierw pożywkę hodowlaną. Można to szybko osiągnąć, odwracając talerz do góry nogami i wrzucając medium do zlewu. Pozostały nośnik można usunąć, delikatnie stukając odwróconą płytką o ręczniki papierowe. Dodaj 30 μl 1X Passive Lysis Buffer (Promega) do każdej studzienki komórek za pomocą Multidrop i umieść na kołysce platformy (Bellco jest jedną z firm, która je produkuje) ustaw średnią prędkość na 5 minut w RT.
   2. Dodać 20 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy II (część zestawu Promega Dual Luciferazy) za pomocą Multidrop i natychmiast zmierzyć aktywność FL za pomocą luminometru. Następnie dodaj odczynnik Stop & Glo (Promega), który wygasi aktywność FL i umożliwi pomiar aktywności RL. Uwaga: o ile nie używasz mieszanek substratów, które pozwalają na wydłużenie czasu trwania sygnału (takich jak zestawy Dual-Glo Lucyferazy firmy Promega), użycie zestawów flash wymaga szybkiego pomiaru po dodaniu substratu (w ciągu 5 minut).

Results

Pomimo postępów w mapowaniu krajobrazu mutacji różnych nowotworów za pomocą ogromnych wysiłków sekwencjonowania genomu^12-14, nadal nie mamy systematycznego podejścia do przełożenia tych obserwacji na strategie interwencyjne. W raku jelita grubego (CRC) mutacje, które według przewidywań wpływają na składniki trzech procesów komórkowych - Wnt / β-kateniny, p53 i sygnalizacji Kras - znajdują się w 99% wszystkich nowotworów, co sugeruje, że są one kluczowymi czynnikami transformacji komórkowej w jelitach^.

Discussion

Istnieje kilku dostawców systemów reporterowych opartych na lucyferazie (takich jak Promega, Targeting Systems, New England BIolabs i Thermo Fisher), którzy zapewniają przydatne zasoby on-line dla tych, którzy po raz pierwszy bawią się ekranem o wysokiej przepustowości. Ponadto pomocny powinien być szereg doskonałych przeglądów dotyczących optymalizacji wykorzystania wysokoprzepustowych badań przesiewowych do odkrywania genów oraz tego, w jaki sposób wyniki badań przesiewowych opartych na RNAi można zintegrować z innymi ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System	Agilent Technologies Inc.
System profilowania szlaków lucyferazy 4 pp53-TA-Luc Vector	Clontech Lab Inc.
Odczynnik do transfekcji Effectene	Qiagen Inc.
System do oznaczania reporterowego z podwójnym lucyferazy	Promega Corp.	E1960
Cypridina Odczynnik do oznaczania lucyferazy	Systemy celowania	VLAR-1
HCT116 komórki	ATCC	CCL-247
Test cytotoksyczności CytoTox-Fluo	Promega Corp.	G9260
EQUIPMENT
MultiFlo Dozownik mikropłytek	Labsystems Inc.	Model 832
Stacja robocza automatyzacji laboratorium Biomek FXP	Beckman Coulter Inc.	A31842
PHERAstar FS-wielomodowy czytnik mikropłytek HTS	BMG Labtech Inc.	0471-101A
Reichert Bright-Line	Hausser Scientific Company	1490