Ten artykuł szczegółowo opisuje procedury analizy obrazowania optycznego nanocząsteczki HerDox, ukierunkowanej na nowotwór. W szczególności opisano tutaj szczegółowe zastosowanie wielomodowego urządzenia do obrazowania do wykrywania celowania w guz i oceny penetracji guza.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza celowanych nanocząstek białek wirusowych dostarczanych do guzów HER2+
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nanocząstka ukierunkowana na nowotwór HER2+, HerDox, wykazuje akumulację preferencyjną dla guza i ablację wzrostu guza w zwierzęcym modelu raka HER2+. HerDox powstaje w wyniku niekowalencyjnej samoorganizacji białka penetrującego komórki ukierunkowane na nowotwór ze środkiem chemioterapeutycznym, doksorubicyną, za pośrednictwem małego łącznika kwasu nukleinowego. Połączenie oddziaływań elektrofilowych, interkalacyjnych i oligomeryzacyjnych ułatwia samoorganizację w okrągłe cząstki o długości 10-20 nm. HerDox wykazuje stabilność we krwi, a także w długotrwałym przechowywaniu w różnych temperaturach. Ogólnoustrojowe dostarczanie HerDox myszom z nowotworem powoduje śmierć komórek nowotworowych bez wykrywalnych działań niepożądanych dla tkanek nienowotworowych, w tym serca i wątroby (które ulegają znacznemu uszkodzeniu przez nieukierunkowaną doksorubicynę). Zwiększenie poziomu HER2 ułatwia celowanie w komórki wykazujące ekspresję receptora ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu, stąd nowotwory wykazujące podwyższony poziom HER2 wykazują większą akumulację HerDox w porównaniu z komórkami wykazującymi niższą ekspresję, zarówno in vitro, jak i in vivo. Obrazowanie intensywności fluorescencji w połączeniu z analizą konfokalną i spektralną in situ pozwoliło nam zweryfikować in vivo celowanie w guz i penetrację komórek nowotworowych HerDox po dostarczeniu ogólnoustrojowym. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nasze metody oceny celowania w guz za pomocą obrazowania wielomodowego po dostarczeniu ogólnoustrojowym.
Wprowadzenie
Chemioterapia ukierunkowana na nowotwory ma potencjał do eliminacji komórek rakowych przy niższych dawkach w porównaniu do leków niecelowanych, ponieważ więcej dostarczonej terapii może zgromadzić się w zamierzonym miejscu docelowym, zamiast rozprowadzać się do tkanki nienowotworowej. Ponieważ ta ostatnia sytuacja osłabiłaby skuteczność leku, a tym samym wymagałaby większych dawek, aby była skuteczna, celowanie w nowotwór ma zarówno korzyści terapeutyczne, jak i bezpieczeństwa w porównaniu ze standardowym leczeniem niecelowanym.
Ukierunkowanie chemioterapii poprzez enkapsulację w samoorganizujących się nanocząstkach pozwala lekowi pozostać chemicznie niezmodyfikowanym, w przeciwieństwie do leków, które są kowalencyjnie powiązane z cząsteczkami docelowymi. W związku z tym powiązanie może potencjalnie zmienić aktywność zarówno leku, jak i cząsteczki docelowej; Montaż niekowalencyjny pozwala na zachowanie siły działania leku.
Wcześniej pokazaliśmy, że nowy trzyskładnikowy, samoorganizujący się kompleks, HerDox, atakuje guzy HER2+ in vivo i wywołuje ablację wzrostu guza, oszczędzając normalną tkankę, w tym serce 1. HerDox powstaje w wyniku niekowalencyjnych oddziaływań między białkiem penetrującym komórki, wiążącym receptor, HerPBK10, a środkiem chemioterapeutycznym, doksorubicyną (Dox), za pośrednictwem małego łącznika kwasu nukleinowego. HerPBK10 wiąże receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER) i wyzwala endocytozę za pośrednictwem receptora 2-4, podczas gdy penetracja błony endosomalnej odbywa się poprzez włączenie białka kapsydu 4-6 pochodzącego z adenowirusa pentonowego. Dodatnio naładowana domena na białku umożliwia wiązanie kwasów nukleinowych 4, 5, przez które Interkalowany DNA Dox może być transportowany w celu docelowego dostarczenia. Oddziaływania elektrofilowe, interkalacyjne i ewentualnie oligomeryzacja białek ułatwiają samoorganizację w okrągłe cząstki o długości fali 10-20 nm, które są stabilne we krwi i przechowywane przez dłuższy czas w różnych temperaturach 1. Preferencyjne celowanie w komórki nowotworowe HER2 + jest ułatwione dzięki zwiększonemu powinowactwu ligandów, gdy HER2 jest podwyższony.
Nasze poprzednie badania wykazały, że systemowe dostarczanie HerDox daje preferencyjne akumulację w guzach w porównaniu z tkankami nienowotworowymi i w porównaniu do nieukierunkowanej Dox 1 i penetracji komórek nowotworowych in vivo 7. Zaobserwowaliśmy, że HerDox uwalnia Dox po wniknięciu do komórki nowotworowej, umożliwiając akumulację Dox do jądra 1. Akumulacja guza wydaje się korelować z poziomem receptora, ponieważ stosunkowo niskie guzy wykazujące ekspresję HER2 gromadzą mniej HerDox w porównaniu z tymi ze stosunkowo wyższymi poziomami HER2 1. Co więcej, efektywne stężenie śmierci komórki wykazuje odwrotną korelację z wyświetlaniem HER2 na liniach komórek nowotworowych wyrażających różne poziomy HER2 na powierzchni komórki 1. HerDox wykazuje przewagę terapeutyczną i bezpieczeństwa nad nieukierunkowanym Dox, ponieważ zabijanie guza następuje przy ponad 10 razy niższej dawce w porównaniu z lekiem niecelowanym i nie ma wykrywalnego negatywnego wpływu na tkankę serca (wykrywaną przez echokardiografię i barwienie histologiczne) lub wątrobę (wykrywaną przez barwienie TUNEL), w przeciwieństwie do nieukierunkowanego Dox 1. Pomimo pochodzenia z białka kapsydu wirusa, HerPBK10 nie wykazuje wykrywalnej immunogenności na poziomie terapeutycznym 2. Podczas gdy istniejące wcześniej przeciwciała przeciwko całemu adenowirusowi mogą rozpoznać HerPBK10, nie są w stanie zapobiec wiązaniu komórek 2.
Objętość guza mierzona w czasie jest standardową metodą oceny skuteczności terapeutycznej celowanych terapii i została wykorzystana do oceny skuteczności terapeutycznej HerDox. Uzupełnienie tego podejścia o obrazowanie intensywności fluorescencji in vivo i ex vivo pozwoliło nam lepiej ocenić skuteczność celowania 7. Specjalnie zintegrowaliśmy obrazowanie konfokalne in situ wyciętych guzów z analizą spektralną fluorescencji Dox, aby sprawdzić, czy HerDox nie tylko gromadził się w guzach in vivo, ale przenikał do komórek nowotworowych i dostarczał Dox do cytoplazmy i jądra 7. Analiza spektralna pozwoliła nam ponadto odróżnić fluorescencję Dox od autofluorescencji 7.
Tutaj demonstrujemy bardziej szczegółowo nasze podejście do oceny HerDox in vivo po dostarczeniu ogólnoustrojowym, a co najważniejsze, do oceny celowania za pomocą metod obrazowania wielomodowego i analiz.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Dostarczanie ogólnoustrojowe In vivo
- Wymieszaj wystarczającą ilość HerDox ze sterylną solą fizjologiczną, aby zrównać 0,2 ml dawki 0,004 mg/kg HerDox na wstrzyknięcie dla 6-8 tygodniowej myszy NU/NU z podskórnymi obustronnymi guzami ksenoprzeszczepu bocznego.
- Delikatnie narysuj mieszaninę HerDox do strzykawki insulinowej o pojemności 3/10 cm3 wyposażonej w igłę 29G, unikając pęcherzyków.
- Znieczulenie jest wywoływane przez krótką ekspozycję na izofluran w komorze indukcyjnej wyposażonej w system usuwania gazów (natężenie przepływu tlenu: 0,5-1 l/min, stężenie izofluranu: 3-4% (lub mniej).
- Wstrzyknąć całą mieszaninę do żyły ogonowej znieczulonej myszy (0,2 ml na wstrzyknięcie). Wstrzyknięcie dożylne można również wykonać u skrępowanej, nieznieczulonej myszy.
- Powtarzaj wstrzyknięcia tej samej myszy przez kolejne sześć dni, raz dziennie.
2. Obrazowanie fluorescencyjne in vivo
Nagromadzenie fluorescencji HerDox w guzach może być wykryte w ostatnim dniu iniekcji (Dzień 7) za pomocą wielomodowego imagera. Poniższe procedury zakładają zastosowanie dostosowanego do potrzeb użytkownika systemu makrooświetlenia i detekcji (rys. 1) 8.
- Włącz wielomodowy obrazownik optyczny in vivo.
- Wybrać filtr pasmowoprzepustowy emisji (590 nm ± 30 nm) odpowiedni do wykrywania fluorescencji doksorubicyny.
- Włącz laser Argon-Krypton i umieść filtr pasmowo-przepustowy wzbudzenia (488 nm ± 10 nm) na torze optycznym lasera.
- Włącz system znieczulający, a następnie umieść mysz w komorze anestezjologicznej (Natężenie przepływu tlenu: 0,5-1 L/min, stężenie izofluranu: 3-4% (lub niższe)wyposażone w system oczyszczania gazów.
- Przenieś mysz z komory anestezjologicznej do komory obrazowania wielomodowego obrazu optycznego in vivo, gdy mysz jest znieczulona.
- Umieść nos nad nosem myszy i otwórz przepływ, aby podać ciągłe znieczulenie podczas akwizycji obrazu (natężenie przepływu tlenu: 0,5-1 l/min, stężenie izofluranu: 2-3% (lub mniej).
- Uzyskuj obrazy fluorescencyjne przy czasie naświetlania 5-15 sek.
- Wykonuj analizę i przetwarzanie obrazu, w tym korekcję tła lub regulację kontrastu.
3. Obrazowanie fluorescencyjne ex vivo
Fluorescencję HerDox można zaobrazować w guzach i konkretnych narządach (w tym wątrobie, nerkach, śledzionie, sercu i mięśniach szkieletowych) pobranych od myszy poddanych eutanazji w ciągu 24 godzin po ostatnim (Dzień 7) wstrzyknięciu HerDox.
- Włącz wielomodowy obrazownik optyczny in vivo.
- Wybierz filtr pasmowoprzepustowy emisji (580 nm ± 20 nm) do wykrywania fluorescencji doksorubicyny.
- Włącz laser Argon-Krypton i umieść filtr pasmowo-przepustowy wzbudzenia (488 nm ±10 nm) na torze optycznym lasera.
- Umieść guzy i określone narządy ułożone na szalce Petriego w komorze obrazowania wielomodowego obrazowania optycznego in vivo.
- Uzyskaj obrazy fluorescencyjne tkanek przy użyciu czasu naświetlania 5-15 sek. Przykład wstępnej akwizycji obrazu fluorescencyjnego pokazano na rysunku 2a. Powtórz to samo używając pustej szalki Petriego, która posłuży jako tło (Rysunek 2b).
- Wykonuj analizę i przetwarzanie obrazu, w tym korekcję tła lub regulację kontrastu. Przykład skorygowanego obrazu przedstawiono na rysunku 2c, wynikającym z odjęcia rysunku 2b od rysunku 2a.
4. Obrazowanie konfokalne in situ guzów
Obrazowanie konfokalne in situ umożliwia wykrywanie i analizę akumulacji guza HerDox na poziomie komórkowym.
- Włącz mikroskop konfokalny Leica SPE.
- Wybierz światło laserowe 488 nm do wzbudzenia doksorubicyny i długości fal emisji (560-620 nm) do wykrywania fluorescencji doksorubicyny.
- Wybierz obiektyw 40X lub 63X i upuść olejek immersyjny na soczewkę obiektywu.
- Ekstrakcja świeżych guzów od myszy poddanych eutanazji, które wcześniej otrzymały HerDox i pozorowane leczenie, jak opisano w procedurze 2.
- Umieść guzy na szalce Petriego na lodzie, aby uniknąć degradacji tkanek, a następnie przenieś guzy do komory Delta T w celu obrazowania konfokalnego.
- Uzyskaj obrazy konfokalne guzów na sekwencyjnych głębokościach ogniskowych (wielkość kroku: 1 μm, grubość: 20 μm). Przykład sekwencyjnie uzyskanych obrazów wzdłuż osi z pokazano na rysunku 3, lewy panel.
- Wykonaj projekcję z obrazów o maksymalnej intensywności. Projekcja maksymalnej intensywności obrazów z ułożonymi w stos jest pokazana na rysunku 3 w prawym panelu.
- Obliczać średnie intensywności fluorescencji obrazów z projekcją Z o maksymalnej intensywności. Średnie intensywności fluorescencji obrazów w całym polu widzenia obliczono za pomocą ImageJ.
5. Ratiometryczne obrazowanie i analiza spektralna
Ratiometryczne obrazowanie i analiza spektralna pozwala na rozróżnienie między fluorescencją Dox a autofluorescencją.
- Włącz laserowy skaningowy fluorescencyjny mikroskop konfokalny.
- Uzyskaj 15 obrazów guzów leczonych i nieleczonych HerDox na określonej głębokości w zakresie widmowym 510-650 nm, z krokiem 10 nm i wzbudzeniem przy świetle 488 nm za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica SPE.
- Przygotować 100 μM roztwór doksorubicyny.
- Wykonać obrazowanie spektralne roztworu doksorubicyny 100 μM, aby uzyskać czystą sygnaturę spektralną fluorescencji Dox (zakres widmowy: 510-650 nm, wielkość kroku: 10 nm). Typowe wyniki akwizycji obrazu z obrazowania spektralnego i wynikowe widmo fluorescencji przedstawione w postaci wykresu przedstawiono na rysunku 4.
- Uzyskaj sygnaturę spektralną autofluorescencji z kostki obrazu (zakres widmowy: 510-650 nm, rozmiar kroku: 10 nm) uzyskanej przez obrazowanie spektralne nieleczonych guzów. Typowe wyniki akwizycji obrazu z obrazowania spektralnego i wynikowe widmo fluorescencji przedstawione w postaci wykresu przedstawiono na rysunku 5.
- Wygeneruj cztery referencyjne sygnatury spektralne (czysta autofluorescencja, 0.1.doksorubina+0.9.autofluorescencja, 0.2. doksorubicyna+0.8.autofluorescencja, 0.3.doksorubina+0.7.autofluorescencja) za pomocą opracowanego przez nas programu 9. Typowa krzywa przedstawiająca cztery referencyjne sygnatury spektralne pokazano na rysunku 6.
- Wykonaj klasyfikację spektralną obrazów zgodnie z definicją referencyjnych sygnatur spektralnych za pomocą euklidesowego pomiaru odległości za pomocą wcześniej opracowanego przez nas programu 9.
- Wykonaj liniowe rozmieszanie spektralne tych obrazów za pomocą opracowanego przez nas programu do rozmieszania spektralnego (wtyczka w ImageJ), 7, 10 do porównania z ratiometrycznym obrazowaniem i analizą spektralną. Przykład oddzielenia fluorescencji HerDox od autofluorescencji za pomocą liniowego rozmieszania spektralnego pokazano na rysunku 7.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 1 przedstawia prototyp obrazownika optycznego in vivo, który został zbudowany w celu pozyskiwania obrazów w wielu modalnościach, w tym obrazowania intensywności fluorescencji, obrazowania spektralnego, czasu życia, dwufotonowego, konfokalnego intravitalnego oraz bioluminescencji. Ponadto chłodzona kamera o wysokiej czułości i linie laserowe o wysokiej mocy wbudowane w ten system pozwalają na uzyskanie obrazów fluorescencji o wyższym kontraście w porównaniu z komercyjnymi systemami obrazow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Fluorescencja Dox może być wykrywalna in vivo za pomocą obrazowania wielomodowego, gdy guzy są podskórne. Jednak skuteczna terapeutycznie dawka leku HerDox (0,004 mg/kg) jest niższa od progu wykrywalności po podaniu pojedynczej dawki. Natomiast po 7 codziennych iniekcjach (1x/dzień przez 7 dni) akumulacja guza i zatrzymanie cząstki jest wystarczające, aby umożliwić wizualizację fluorescencji Dox.
Podczas pracy z Dox lub innym fluoroforem do obrazowania in vivo bardzo ważne j...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autor, Daniel Farkas, jest prezesem Spectral Molecular Imaging. Pozostali autorzy nie mają sprzecznych interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana z grantów dla LKM-K z National Institutes of Health/National Cancer Institute (R01CA129822 i R01CA140995). Dr Medina-Kauwe dziękuje C. Rey, M. M-Kauwe i D. Revetto za nieustające wsparcie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fluorescencyjny laserowy skaningowy mikroskop konfokalny | Leica | SPE | |
| em>In Vivo Optical Imager | Spektralne obrazowanie molekularne | wielomodowe In Vivo Obrazowanie | |
| Doxorubicin-HCl | Sigma-Aldrich | D4035 | |
| Mysz Nude (NU/NU), samica, 6-8 tygodni | Charles River | Kod szczepu 088 | |
| MDA-MB-435 ludzkie komórki nowotworowe HER2 + | NCI-Frederick Cancer DCTD Repozytorium guzów/linii komórkowych | 0507292 | |
| Strzykawka insulinowa 3/10 cc U-100 z igłą 29G x 1/2" Ultra-FineIV przymocowaną na stałe BD | 309301 | ||
| komorą Delta T | Bioptechs | 04200417B |
Bibliografia
- Agadjanian, H., Chu, D., et al. Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles. Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).
- Agadjanian, H., Ma, J., et al. Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).
- Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).
- Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).
- Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. 3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins. Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).
- Rentsendorj, A., Xie, J., et al. Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer. Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).
- Hwang, J. Y., Park, J., et al. Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles. PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).
- Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment. Mol. Imaging Biol. , (2011).
- Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo. J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).
- Fujimoto, J. G., Farkas, D. L. Biomedical Optical Imaging. , Oxford University Press. New York. (2009).
- Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. Multimode optical imaging of small animals: development and applications. Proc. of SPIE. 6411, (2007).
- Ducros, M., Moreaux, L., et al. Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo. PLoS One. 4 (2), e4418(2009).
- Zimmermann, T. Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
