Artykuł metodologiczny

5/6 nefrektomia w połączeniu z dietą bogatą w sól i hamowaniem syntazy tlenku azotu w celu wywołania przewlekłej choroby nerek u szczura Lewisa

23.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50398

⸱

3 lipca 2013

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology & Hypertension, University Medical Center Utrecht

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano dwuetapową metodę leczenia przewlekłej choroby nerek (PChN) u szczura Lewisa poprzez chirurgiczne usunięcie 5/6 masy nerkowej. Połączenie zabiegu chirurgicznego, hamowania NOS i diety bogatej w sól prowadzi do powstania modelu przypominającego ludzką PChN, co pozwala na badanie mechanizmów przyczynowych i opracowywanie nowych interwencji terapeutycznych.

Streszczenie

Przewlekła choroba nerek (PChN) jest problemem globalnym. Spowolnienie postępu PChN jest głównym priorytetem zdrowotnym. Ponieważ PChN charakteryzuje się złożonymi zaburzeniami homeostazy, integracyjne modele zwierzęce są niezbędne do badania rozwoju i progresji PChN. Aby zbadać rozwój PChN i nowe interwencje terapeutyczne w PChN, wykorzystujemy model ablacji 5/6 nefrektomii, dobrze znany eksperymentalny model postępującej choroby nerek, przypominający kilka aspektów PChN u ludzi. Znaczne zmniejszenie masy nerkowej powoduje postępujące uszkodzenie kłębuszków nerkowych i cewkowo-śródmiąższowych, utratę resztkowych nefronów oraz rozwój nadciśnienia ogólnoustrojowego i kłębuszkowego. Wiąże się to również z postępującą utratą naczyń włosowatych śródnerkowych, stanem zapalnym i miażdżycą kłębuszków nerkowych. Czynniki ryzyka PChN niezmiennie wpływają na funkcję śródbłonka. Aby to naśladować, łączymy usunięcie 5/6 masy nerkowej z niedoborem tlenku azotu (NO) i dietą bogatą w sól. Po przyjeździe i aklimatyzacji zwierzęta otrzymują inhibitor syntazy NO (NG-nitro-L-Arginina) (L-NNA) uzupełniony do wody pitnej (20 mg/L) przez okres 4 tygodni, a następnie prawostronną uninfrektomię. Tydzień później wykonuje się nefrektomię subtotalną (SNX) po lewej stronie. Po SNX zwierzętom pozwala się na rekonwalescencję przez dwa dni, a następnie LNNA w wodzie pitnej (20 mg/l) przez kolejny okres 4 tygodni. Dieta bogata w sól (6%), uzupełniona mieloną karmą (patrz oś czasu Rysunek 1), jest kontynuowana przez cały czas trwania eksperymentu. Postęp niewydolności nerek śledzi się w miarę upływu czasu poprzez pomiar mocznika w osoczu, skurczowego ciśnienia krwi i białkomoczu. Po sześciu tygodniach od SNX dochodzi do niewydolności nerek. Czynność nerek mierzy się za pomocą "złotego standardu" inuliny i technologii klirensu kwasu para-amino-hippurowego (PAH). Ten model PChN charakteryzuje się zmniejszeniem współczynnika filtracji kłębuszkowej (GFR) i efektywnym przepływem osocza nerkowego (ERPF), nadciśnieniem tętniczym (skurczowe ciśnienie krwi >150 mmHg), białkomoczem (> 50 mg/24 h) i łagodną mocznicą (>10 mM). Cechy histologiczne obejmują uszkodzenie kanalików śródmiąższowych objawiające się stanem zapalnym, zanik kanalików i zwłóknienie oraz ogniskowe stwardnienie kłębuszków nerkowych prowadzące do masywnego zmniejszenia liczby zdrowych kłębuszków nerkowych w pozostałej populacji (<10%). Obserwacja do 12 tygodni po SNX wykazuje dalszą progresję PChN.

Wprowadzenie

Ze względu na swój postępujący charakter, wynikającą z niego schyłkową chorobę nerek i związaną z nią zachorowalność i śmiertelność z powodu chorób sercowo-naczyniowych, PChN stanowi rosnący problem zdrowia publicznego1. Spowolnienie postępu PChN jest zatem głównym priorytetem zdrowotnym. Ponieważ PChN charakteryzuje się złożonymi zaburzeniami homeostazy, integracyjne modele zwierzęce są niezbędne do badania rozwoju i progresji PChN. Nerka składa się z szerokiej gamy różnych typów komórek, które wchodzą ze sobą w interakcje. Tej złożoności nie da się naśladować in vitro.

Aby badać nowe interwencje terapeutyczne w PChN, używamy modelu ablacji 5/6 nefrektomii, dobrze znanego eksperymentalnego modelu postępującej choroby nerek, przypominającego kilka aspektów ludzkiej PChN2,3. Znaczne zmniejszenie masy nerkowej powoduje postępujące uszkodzenie kłębuszków nerkowych i cewkowo-śródmiąższowych, utratę resztkowych nefronów oraz rozwój nadciśnienia ogólnoustrojowego i kłębuszkowego. Jest to związane z postępującą utratą naczyń włosowatych śródnerkowych4, stanem zapalnym i stwardnieniem kłębuszków nerkowych. Czynniki ryzyka PChN niezmiennie wpływają na funkcję śródbłonka5. Użyliśmy szczepu szczura (Lewis), który jest stosunkowo odporny na rozwój PChN i dlatego połączyliśmy usunięcie 5/6 masy nerkowej z niedoborem tlenku azotu (NO)6, 7, 8 i dietą o wysokiej zawartości soli9. Po przyjeździe i aklimatyzacji zwierzęta otrzymują inhibitor syntazy NO (L-NNA) uzupełniony do wody pitnej (20 mg/L) przez okres 4 tygodni, a następnie prawostronną uninfrektomię (UNX) z kontynuacją L-NNA po dwóch dniach. Tydzień później wykonuje się nefrektomię subtotalną (SNX), czyli usunięcie 2/3 masy nerkowej po stronie lewej. Po SNX zwierzętom pozostawia się rekonwalescencję przez 2 dni, a następnie ponownie podaje się 20 mg/l lnna w wodzie pitnej przez okres 4 tygodni. Dieta bogata w sól (6%), uzupełniona mieloną karmą (patrz oś czasu Rysunek 1), jest kontynuowana przez cały czas trwania eksperymentu. Powodem, dla którego należy wykonać UNX po prawej stronie, a SNX po lewej stronie, jest to, że naczynia nerkowe są dłuższe po lewej stronie, co ułatwia dostęp do nerki bez nadmiernego rozciągania naczyń, gdy nerka jest odsłonięta na zewnątrz ciała. W literaturze opisywane są modele, w których najpierw usuwa się bieguny lewej nerki, a tydzień później UNX prawej nerki10,11,12. W naszych rękach model ten wykazał znacznie szybszy rozwój niewydolności nerek, ale także znacznie większą zmienność w utracie funkcji nerek. Postęp niewydolności nerek śledzi się w miarę upływu czasu poprzez pomiar mocznika w osoczu, skurczowego ciśnienia krwi i białkomoczu. Po sześciu tygodniach od SNX dochodzi do niewydolności nerek, charakteryzującej się znacznym zmniejszeniem współczynnika filtracji kłębuszkowej (69%) i efektywnym przepływem osocza nerkowego (62%)13, nadciśnieniem tętniczym (skurczowe ciśnienie krwi >150 mmHg), białkomoczem (> 50 mg/24 godz.) i łagodną mocznicą (>10 mM). Cechy histologiczne obejmują uszkodzenie kanalików śródmiąższowych objawiające się stanem zapalnym, zanik kanalików i zwłóknienie oraz ogniskowe stwardnienie kłębuszków nerkowych prowadzące do masywnego zmniejszenia liczby zdrowych kłębuszków nerkowych w pozostałej populacji (<10%). Obserwacja do 12 tygodni po SNX pokazuje dalszą progresję PChN, co daje możliwość oceny interwencji terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi etycznymi Komitetu ds. Zwierząt Doświadczalnych w Utrechcie. Protokół jest wykonywany pod kierunkiem i za zgodą komitetu ds. opieki nad zwierzętami i wykorzystania zwierząt, w której znajduje się autor

.

CKD jest indukowana u samców wsobnych szczurów Lewis (Charles River, Sulzfeld, Niemcy) w wieku 8 tygodni. Szczury są trzymane w standardowych warunkach w środowisku o kontrolowanym świetle, temperaturze i wilgotności.

1. Przygotowanie do operacji

  1. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne:
    • 1 kleszczyki do tkanek studenckich 1-2 zęby 12 cm
    • 1 kleszcze uczniowskie o standardowym wzorze
    • 2 kleszcze Semken
    • 1 nożyczki majonezowe
    • 1 student nożyczki do tęczówki
    • 1 uchwyt na igły Olsen-Hegar z nożyczkami
    • koc
  2. Sprawdź listę inwentarza:
    • Stół operacyjny z podkładką rozgrzewającą i lampą
    • O2, izofluran
    • Tkanek
    • golarka
    • waga
    • Sterylny zestaw operacyjny
    • Sterylna gaza 5x5 i 10x10
    • 70% alkoholu
    • 0,9% roztwór NaCl
    • Strzykawka 1 ml
    • Igły (25G)
    • Żelowe podkładki piankowe: spongostan
    • Vicryl 4.0 i 5.0
    • Buprenorfina 0,03 mg/kg (1:10 rozcieńczona w soli fizjologicznej)
    • Czysta klatka dla szczurów po operacji

2. Uninefrektomia po prawej stronie

  1. Zdezynfekuj stół 70% alkoholem.
  2. Umieścić szczura w pudełku indukcyjnym i wywołać znieczulenie 4% izofluranem i 1 litrem przepływuO2. Uwaga: w zależności od zastosowanego szczepu szczura przepisywane jest znieczulenie przed- i okołooperacyjne, należy to omówić z lokalnym weterynarzem.
  3. Przenieś szczura na stół i umieść nos w stożku. Stożek szczura i nosa umieszcza się na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała szczura. Szczur jest wentylowany mieszaniną 2% izofluranu i 1 litra O2 .
  4. Ogol bok szczura i zdezynfekuj alkoholem. Myć i dezynfekować ręce oraz nosić sterylne rękawice chirurgiczne. Załóż czapkę na głowę i maskę. Wykonaj nacięcie 1-1,5 cm równolegle do żeber za pomocą anatomicznych kleszczy i nożyczek. Odsłoń nerkę poprzez rozwarstwienie mięśni pleców.
  5. Dolny biegun nerki jest widoczny, ostrożnie użyj małych kleszczyków, aby chwycić okołonerkową tkankę tłuszczową. Eksternalizacji nerki delikatnie ciągnąc za tłuszcz okołonerkowy kleszczami. Należy uważać, aby podczas tego zabiegu nie naruszyć pracy nadnercza. Nadnercza można łatwo usunąć, umieszczając kleszcze w miejscu przyśrodkowym w tkance tłuszczowej i delikatnie przesuwając w górę między nadnerczami a nerką, jak pokazano na rycinie 2.
  6. Delikatnie umieść nerkę na gazie i oczyścij ją z otaczającego tłuszczu i tkanki łącznej. Zidentyfikuj tętnicę nerkową i żyłę nerkową i umieść ligaturę (5,0 vicryl) z pojedynczym węzłem wokół naczyń, ale nie zawiązuj węzła.
  7. Ostrożnie przesuń luźny węzeł wzdłuż naczyń w kierunku aorty o około 0,5 cm, aby utworzyć przestrzeń między nerką a węzłem. Ma to na celu zapobieżenie zsuwaniu się ligatury po przecięciu.
  8. Zawiąż węzeł dwoma podwójnymi węzłami. Jeśli perfuzja zostanie zatrzymana, kolor nerki natychmiast zmieni się na brązowy. Nie obcinaj końców ligatury.
  9. Przeciąć naczynia nerkowe w pobliżu nerki i usunąć nerkę. Delikatnie pociągnij za długie końce ligatury, aby sprawdzić, czy nie ma krwawienia z naczyń nerkowych. Podwiązanie powinno pozostać na swoim miejscu na naczyniu. Odetnij długie końce ligatury. Należy pamiętać, że resztki naczyń nerkowych natychmiast cofną się do jamy brzusznej.
  10. Osusz wyciętą nerkę do sucha i zważ ją.
  11. Zamknij nacięcie mięśni szkieletowych za pomocą szwów biegowych za pomocą Vicryl 5.0. Wstrzyknąć 0,10 ml (0,03 mg/kg) buprenorfiny domięśniowo w kończynę tylną. Zamknij skórę za pomocą Vicryl 4.0 za pomocą szwów śródskórnych. Zapobiega to otwieraniu rany przez szczury. Uwaga: ze względu na depresję oddechową u szczurów Lewisa, podajemy tylko pooperacyjne znieczulenie tuż przed wyłączeniem izofluranu.
  12. Trzymaj szczura w czystej, samotnej klatce z łatwym dostępem do jedzenia i wody. Umieść połowę klatki na podkładce grzewczej O/N i dokładnie sprawdź szczura następnego dnia. Gdy rana zostanie zamknięta, a szczur jest aktywny, co zwykle trwa od 6 do 12 godzin po operacji, szczur może zostać umieszczony z powrotem w pomieszczeniu grupowym.

3. Nefrektomia z sumą częściową lewej strony

  1. Siedem dni później po lewej stronie wykonuje się te same preparaty, co po prawej stronie, jak opisano od 2,1 do 2,5. Przed zabiegiem oblicza się ilość tkanki nerkowej, która musi zostać usunięta, odpowiadającą około 2/3 masy prawej nerki. Przygotuj małe kawałki pianki żelowej (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) przed zabiegiem.
  2. Umieść ostre nożyczki wokół górnego bieguna lewej nerki i wytnij górny biegun jednym pociągnięciem (w celu ustalenia nożyczek, patrz rysunek 3). Natychmiast przykryj kawałkiem pianki żelowej i delikatnie dociśnij sterylną gazą.
  3. Powtórzyć z dolnym biegunem nerki, jak w ppkt 3.3.
  4. Podnieś nerkę, aby zapobiec zakrzepom na skórze. Utrzymuj łagodny nacisk na obie żelowe wkładki piankowe sterylną gazą, aż krwawienie ustanie. Gdy krwawienie utrzymuje się, dodaj kolejną podkładkę piankową.
  5. Umieść resztki nerki z przylegającymi żelowymi podkładkami piankowymi w jamie brzusznej. Zamknij mięsień i skórę i postępuj zgodnie z 2,9-2,12.

4. Pozorna chirurgia

  1. Kontrole sterowane pozorami są poddawane tej samej procedurze w celu odsłonięcia nerek. Zamiast wytępić nerkę lub przeciąć bieguny tydzień później, obie nerki są odkapsulowane w odstępach jednego tygodnia, uważając, aby nie naruszyć pracy nadnerczy. Zamykanie ran i opieka pooperacyjna są identyczne jak w 2.11 i 2.12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po subtotalnej nefrektomii pozostaje około 1/6 całkowitej masy nerek. Rysunek 4 przedstawia masę usuniętej części prawej nerki wraz ze średnią i odchyleniem standardowym w dwóch poprzednich eksperymentach. Należy pamiętać, że w tygodniu po UNX następuje przerost lewej nerki; oznacza to, że masa do usunięcia wyliczona na podstawie masy prawej nerki zawsze skutkuje usunięciem mniej niż 5/6 całej masy. Ponieważ jednak podczas operacji nie jest możliwe określenie masy lewej nerki, jest to najdokładniejsza me...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chirurgiczne usunięcie 5/6 masy nerkowej u szczura Lewisa, w połączeniu z dietą bogatą w sól i tymczasowym hamowaniem NOS, prowadzi do powstania modelu PChN, który przypomina ludzką PChN i umożliwia badanie mechanizmów przyczynowych i skuteczności interwencji terapeutycznych w PChN.

Model nefrektomii 5/6 jest dobrze znanym i szeroko opisanym modelem PChN. Jednak samo usunięcie 5/6 masy nerkowej nie prowadzi do natychmiastowej niewydolności nerek u wszystkich szczepów szczurów. Używamy szczurów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Krista den Ouden za doskonałą pomoc techniczną. Technika ta została wsparta finansowo przez Dutch Kidney Foundation, grant C06.2174. M.C.V. jest wspierany przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO) Vidi-grant 016.096.359.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
   odczynnik
L-NNASigma-aldrichN5501 
Spongostan dental: żelowe podkładki piankowe 1x1x1 cmJohnson& JohnsonMs0005 
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36EthiconV303H 
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36EthiconV392H 
Buprenorfina (0,3 mg/ml)Za pośrednictwem lokalnego farmaceuty zamówionego przez Reckitt Benckiser pharmaceuticalsnieznany 
   Sprzęt
Kleszczyki do tkanek studenckich - 1x2 zęby 12 cmFine Science Tools (FST)91121-12 
Kleszcze studenckie o standardowym wzorzeFST91100-12 
Nożyczki majonezoweFST14010-15 
2X Kleszcze SemkenFST11008-13 
Nożyczki studenckie do irysówFST91460-11 
Uchwyt na igły Olsen-HegarFST12002-14 

Bibliografia

  1. AS, G. o, Chertow, G. M., Fan, D., McCulloch, C. E., Hsu, C. Y. Chronic kidney disease and the risks of death, cardiovascular events, and hospitalization. N. Engl. J. Med. 351 (13), 1296-1305 (2004).
  2. Fleck, C., Appenroth, D., et al. Suitability of 5/6 nephrectomy (5/6NX) for the induction of interstitial renal fibrosis in rats--influence of sex, strain, and surgical procedure. Exp. Toxicol. Pathol. 57 (3), 195-205 (2006).
  3. Griffin, K. A., Picken, M. M., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A. K. Functional and structural correlates of glomerulosclerosis after renal mass reduction in the rat. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (3), 497-506 (2000).
  4. Kang, D. H., Kanellis, J., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
  5. Baylis, C. Nitric oxide synthase derangements and hypertension in kidney disease. Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 21 (1), 1-6 (2012).
  6. Bongartz, L. G., Braam, B., et al. Transient nitric oxide reduction induces permanent cardiac systolic dysfunction and worsens kidney damage in rats with chronic kidney disease. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 298 (3), 815-823 (2010).
  7. Fujihara, C. K., De N, G., Zatz, R. Chronic nitric oxide synthase inhibition aggravates glomerular injury in rats with subtotal nephrectomy. J. Am. Soc. Nephrol. 5 (7), 1498-1507 (1995).
  8. Fujihara, C. K., Sena, C. R., Malheiros, D. M., Mattar, A. L., Zatz, R. Short-term nitric oxide inhibition induces progressive nephropathy after regression of initial renal injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (3), F632-F640 (2006).
  9. Dikow, R., Kihm, L. P., et al. Increased infarct size in uremic rats: reduced ischemia tolerance? J. Am. Soc. Nephrol. 15 (6), 1530-1536 (2004).
  10. Elrashidy, R. A., Asker, M. E., Mohamed, H. E. Pioglitazone attenuates cardiac fibrosis and hypertrophy in a rat model of diabetic nephropathy. J. Cardiovasc. Pharmacol. Ther. 17 (3), 324-333 (2012).
  11. Haylor, J., Schroeder, J., et al. Skin gadolinium following use of MR contrast agents in a rat model of nephrogenic systemic fibrosis. Radiology. 263 (1), 107-116 (2012).
  12. Moriguchi, Y., Yogo, K., et al. Left ventricular hypertrophy is associated with inflammation in sodium loaded subtotal nephrectomized rats. Biomed. Res. 32 (2), 83-90 (2011).
  13. van Koppen, A., Joles, J. A., et al. Healthy bone marrow cells reduce progression of kidney failure better than CKD bone marrow cells in rats with established chronic kidney disease. Cell Transplant. , (2012).
  14. Baylis, C., Corman, B. The aging kidney: insights from experimental studies. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (4), 699-709 (1998).
  15. Szabo, A. J., Muller, V., Chen, G. F., Samsell, L. J., Erdely, A., Baylis, C. Nephron number determines susceptibility to renal mass reduction-induced CKD in Lewis and Fisher 344 rats: implications for development of experimentally induced chronic allograft nephropathy. Nephrol. Dial Transplant. 23 (8), 2492-2495 (2008).
  16. Darling, I. M., Morris, M. E. Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion. Pharm. Res. 8 (10), 1318-1322 (1991).
  17. Levey, A. S. Measurement of renal function in chronic renal disease. Kidney Int. 38 (1), 167-184 (1990).
  18. Myers, G. L., Miller, W. G., et al. Recommendations for improving serum creatinine measurement: a report from the Laboratory Working Group of the National Kidney Disease Education Program. Clin. Chem. 52 (1), 5-18 (2006).
  19. Hostetter, T. H., Meyer, T. W. The development of clearance methods for measurement of glomerular filtration and tubular reabsorption. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287 (5), F868-F870 (2004).
  20. Koeners, M. P., Racasan, S., Koomans, H. A., Joles, J. A., Braam, B. Nitric oxide, superoxide and renal blood flow autoregulation in SHR after perinatal L-arginine and antioxidants. Acta. Physiol. (Oxf). 190 (4), 329-338 (2007).
  21. van den Brandt, J., Wang, D., Kwon, S. H., Heinkelein, M., Reichardt, H. M. Lentivirally generated eGFP-transgenic rats allow efficient cell tracking in vivo. Genesis. 39 (2), 94-99 (2004).
  22. Kreutz, R., Kovacevic, L., Schulz, A., Rothermund, L., Ketteler, M., Paul, M. Effect of high NaCl diet on spontaneous hypertension in a genetic rat model with reduced nephron number. J. Hypertens. 18 (6), 777-782 (2000).
  23. Liu, Z. C., Chow, K. M., Chang, T. M. Evaluation of two protocols of uremic rat model: partial nephrectomy and. 25 (6), 935-943 (2003).
  24. Griffin, K. A., Picken, M., Bidani, A. K. Method of renal mass reduction is a critical modulator of subsequent hypertension and glomerular injury. J. Am. Soc. Nephrol. 4 (12), 2023-2031 (1994).
  25. Meyer, F., Ioshii, S. O., et al. Laparoscopic partial nephrectomy in rats. Acta. Cir. Bras. 22 (2), 152-156 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model przewlek ej choroby nerekpomiar funkcji nerekklirens inulinyklirens PAHpomiar bia komoczuskurczowe ci nienie t tnicze

Powiązane artykuły