Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół izolacji podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej. Wystarczająca ilość i jakość kwasów nukleinowych może zostać wyekstrahowana z komórek i wykorzystana w kolejnych testach z wykorzystaniem DNA lub RNA.

Streszczenie

Krew pępowinowa jest bardzo wzbogacona dla krwiotwórczych komórek progenitorowych na różnych etapach zaangażowania w linię. Opracowaliśmy protokół izolacji prekursorowych limfocytów B na czterech różnych etapach różnicowania. Ponieważ geny ulegają ekspresji, a modyfikacje epigenetyczne zachodzą w sposób specyficzny dla tkanki, konieczne jest rozróżnienie między tkankami i typami komórek, aby móc zidentyfikować zmiany w genomie i epigenomie, które mogą prowadzić do rozwoju choroby. Metodę tę można dostosować do każdego typu komórek obecnych we krwi pępowinowej na każdym etapie różnicowania.

Ta metoda składa się z 4 głównych kroków. Najpierw komórki jednojądrzaste są rozdzielane przez wirowanie gęstości. Po drugie, limfocyty B są wzbogacane za pomocą przeciwciał sprzężonych z biotyną, które rozpoznają i usuwają komórki inne niż B z komórek jednojądrzastych. Po trzecie, limfocyty B są znakowane fluorescencyjnie przeciwciałami białkowymi na powierzchni komórki specyficznymi dla poszczególnych etapów rozwoju komórek B. Na koniec znakowane fluorescencyjnie komórki są sortowane i odzyskiwane są poszczególne populacje. Odzyskane komórki mają wystarczającą ilość i jakość, aby można je było wykorzystać w dalszych testach kwasów nukleinowych.

Wprowadzenie

Aby zidentyfikować aberracje, które są obecne w chorobie, niezwykle ważne jest, abyśmy używali zdrowych tkanek lub komórek, które odpowiadają tkance lub typowi komórki dotkniętej chorobą. Jednym z powodów takiego stanu rzeczy jest to, że zmienność epigenetyczna między typami tkanek jest odpowiedzialna za regulację ekspresji genów i ma kluczowe znaczenie dla różnicowania komórek podczas normalnego rozwoju człowieka^1,2. Drugim powodem jest to, że nieprawidłowa regulacja genów specyficznych dla tkanek może mieć tragiczne konsekwencje dla prawidłowego rozwoju i wiadomo, że przyczynia się do wielu stanów chorobowych, w tym raka. Dlatego lepsze zrozumienie choroby, która obejmuje komórki krwiotwórcze, wymaga wiedzy na temat zdrowych komórek krwiotwórczych.

Rozwój komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym przebiega poprzez systematyczny porządek zdarzeń charakteryzujących się zmianami w ekspresji markerów powierzchni komórki³. Badania z udziałem dorosłych uczestników wykazały, że szpik kostny zwykle zawiera małą liczbę prekursorowych limfocytów B^4,5; mając na uwadze, że badania z udziałem uczestników pediatrycznych wykazały, że odsetek prekursorowych limfocytów B jest stosunkowo wysoki u osób w wieku poniżej 5 lat⁶. Krew pępowinowa jest wykorzystywana jako źródło hematopoetycznych komórek macierzystych w leczeniu chorób i nowotworów złośliwych związanych z krwią, jest łatwo dostępna za pośrednictwem banków krwi pępowinowej i jest wzbogacana o niedojrzałe limfocyty B i T⁷, które są komórkami docelowymi wielu zaburzeń, w tym białaczki i chłoniaków.

Prekursorowe komórki B w szpiku kostnym zostały dokładnie fenotypowane^8,9 i mogą być zdefiniowane przez obecność specyficznych markerów powierzchni komórek, które mogą być użyte do sortowania tych komórek na odrębne podzbiory. Normalne różnicowanie komórek B przebiega przez szereg etapów w szpiku kostnym, zaczynając od najwcześniejszych komórek pro-B, a kończąc na niedojrzałych lub naiwnych komórkach B. Według van Zelma i współpracowników¹⁰, komórki pro-B charakteryzują się obecnością CD34, a podczas przejścia do etapu 2 (Pre-BI) dochodzi do nabycia CD19. Komórki etapu 3 (Pre-BII) nie wykazują już ekspresji CD34 i zaczynają wyrażać cytoplazmatyczne IgM. Wreszcie, cechą charakterystyczną etapu 4 (niedojrzałe komórki B) jest ekspresja powierzchniowej IgM. Strategia sortowania opisana w tym protokole została po raz pierwszy opisana przez Caldwella i współpracowników⁶ i obejmuje użycie tylko 3 markerów powierzchni komórek, co znacznie zmniejsza złożoność i koszt przeprowadzania eksperymentów sortowania komórek. W swojej pracy ustalono związek między CD45 a etapami różnicowania limfocytów B. Zaobserwowali, że limfocyty B w szpiku kostnym wykazują zmienne poziomy ekspresji CD45. W szczególności komórki, które wyrażały wysoki poziom CD45, odpowiadały komórkom, które wyrażały powierzchniowe IgM (niedojrzałe komórki B), te, które wyrażały pośredni poziom CD45, odpowiadały komórkom, które wyrażały cytoplazmatyczne IgM (komórki pre-BII), a te, które wyrażały niski poziom CD45, odpowiadały komórkom, które nie wyrażały cytoplazmatycznego IgM (komórki pre-BI). Protokół ten wykorzystuje strategię opracowaną przez Caldwella i współpracowników⁶ w celu wyizolowania podzbiorów prekursorowych limfocytów B z krwi pępowinowej (ryc. 1), które można wykorzystać w dalszych testach wymagających wysokiej jakości kwasów nukleinowych, takich jak test odzyskiwania wyspy metylowanej CpG (MIRA)¹¹ i ilościowe testy PCR w czasie rzeczywistym. Metoda wykorzystuje wstępną separację za pomocą kulek magnetycznych w celu wyczerpania wszystkich komórek innych niż B z krwi pępowinowej i wymaga barwienia tylko 3 przeciwciałami (CD34, CD19 i CD45). Odzyskane komórki reprezentują 4 etapy różnicowania limfocytów B: 1) CD34⁺; CD19⁺ (późny pro-B i wczesny pre-BI); 2) CD34^-; CD19⁺; CD45^niski (późny pre-BI); 3) CD34^-; CD19⁺; CD45^med (przed BII); oraz 4) CD34^-; CD19⁺; ^Wysoki poziom CD45 (niedojrzałe komórki B).

Protokół

1. Izolacja komórek jednojądrzastych z krwi pępowinowej

1. Przygotować bufor EDTA-PBS - dodać 5 ml roztworu podstawowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 95 ml buforu do płukania (rozcieńczenie 1:20). Odgazuj bufor i utrzymuj bufor na lodzie. ważny: Brak odgazowania buforu może skutkować mniej niż optymalnymi wynikami podczas izolowania komórek B CD19 +, ponieważ pęcherzyki mogą blokować kolumnę izolacyjną.
2. Przygotować stożkowe probówki o pojemności 50 ml do wirowania w gradiacji gęstości. Określ liczbę probówek potrzebnych do przetworzenia krwi pępowinowej (1 probówka może przetworzyć 8 ml krwi) i dodaj 15 ml Ficoll-Paque PLUS do każdej probówki.
3. Rozcieńczyć 8 ml krwi pępowinowej w 24 ml DPBS (1X) i ostrożnie nałożyć rozcieńczoną mieszaninę krwi pępowinowej na wierzch Ficoll-Paque PLUS w każdej ze stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Nie mieszać krwi z Ficoll-Paque PLUS. ważny: Aby uniknąć mieszania się krwi pępowinowej i Ficoll-Paque PLUS, trzymaj probówkę pod kątem 45 stopni i powoli nakładaj mieszaninę krwi.
4. Wirować przy 400 x g przez 40 minut w temperaturze 20 °C. Komórki jednojądrzaste (MNC) pozostaną na granicy faz osocza-Ficoll-Paque PLUS, podczas gdy granulocyty i erytrocyty osadzają się ze względu na większą gęstość przy ciśnieniu osmotycznym Ficoll-Paque PLUS. Oznaczyć siedem okrągłodennych probówek o pojemności 5 ml przeznaczonych do użycia w części 3 numerem identyfikacyjnym próbki, datą i następującymi informacjami:

rura	etykieta	cel
1	Niepoplamione	Niebarwione komórki do normalizacji podczas cytometrii przepływowej
cyfra arabska	7AAD powiedział:	Określenie żywotności podczas cytometrii przepływowej
3	+++	Zawiera komórki, które zostaną posortowane
4	34+	Aby zebrać komórki CD34+/CD19+ (późne pro-B - wczesne pre-BI)
5	45niski	Do zbierania komórek CD34-/CD19+/CD45o niskiej zawartości (pre-BI)
6	45śr.	Pobieranie komórek CD34-/CD19+/CD45med (pre-BII)
7	45wysoki	Aby zebrać CD34-/CD19+/CD45(niedojrzałe komórki B)

Pokryj probówki 4, 5, 6 i 7 2% FBS i umieść wszystkie probówki na lodzie.

5. Ostrożnie zasysać górną warstwę osocza i unikać kontaktu z warstwą komórek jednojądrzastych. Za pomocą szklanej pipety o pojemności 10 ml ostrożnie przenieś warstwę komórek jednojądrzastych do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Połączyć komórki jednojądrzaste z trzech probówek w jedną probówkę o pojemności 50 ml.
6. Napełnić probówkę PBS, delikatnie wymieszać i odwirować przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Powtórz 1x. Po pierwszym umyciu ponownie zawiesić granulki i przenieść do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
7. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS. Pobrać 1 μl zawiesiny komórek, dodać ją do 1 ml PBS w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i odstawić do liczenia (policzyć komórki po umieszczeniu 50 ml zawiesiny komórek w wirówce). Napełnij probówkę PBS i odwiruj przy 200 x g przez 15 minut w celu usunięcia płytek krwi. Usunąć supernatant całkowicie, nie naruszając osadu komórkowego.

2. Zmodyfikowana izolacja komórek B z komórek jednojądrzastych za pomocą separacji MACS

1. Zawiesić osad z kroku 1.7 za pomocą 160 μl zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS.
2. Dodać 40 μl koktajlu przeciwciał biotynowych B-CLL. Dobrze wymieszać pipetą i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Umyć komórki - dodać 1 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS na 10 milionów komórek (liczba komórek określona w kroku 1.7) i odwirować przy 300 x g przez 10 min. Całkowicie odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórek w 320 μl zimnego (4 °C) buforu EDTA-Pbs.
4. Dodać 80 μl mikrokulek antybiotyny, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
5. Umyć komórki - dodać 1 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS na 10 milionów komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 min. Ponownie zawiesić do 100 milionów komórek w 500 μl zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS. Skaluj wolumin buforu zgodnie z numerem komórki.
6. Przygotuj kolumny MACS i separatory MACS podczas wirowania (krok 2.5). Umieścić kolumnę LS w polu magnetycznym separatora MACS, dodać 3 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-Pbs na kolumnę i pozwolić, aby bufor przepłynął przez kolumnę. Użyj pojemnika, aby złapać przepływ. Odrzuć przepływ.
7. Umieścić stożkową probówkę o pojemności 50 ml pod kolumną i odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę. Pozwolić, aby nieoznakowane komórki przesączyły się przez kolumnę i trafiły do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. WAŻNE: Są to komórki, które będą używane do znakowania przeciwciał i sortowania komórek. Nie wyrzucaj przepływu. Aby odzyskać wszystkie komórki z kroku 2.5, dodać dodatkowy 1 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS do ścianek stożkowej probówki. Delikatnie wymieszać i odpipetować pozostałą zawiesinę komórek na kolumnę. Powtórz 1x. Przejdź do kroku 2.8, używając nieoznakowanych komórek zebranych w stożkowej probówce po przejściu przez kolumnę.
8. Napełnić stożkową probówkę zawierającą nieoznakowane komórki PBS i wirować przy 300 x g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Dodać 200 μl buforu EDTA-PBS i delikatnie zawiesić komórki.

3. Znakowanie przeciwciał i przygotowanie do sortowania komórek

1. Odessać 1 μl zawiesiny komórkowej i umieścić w probówce oznaczonej jako "niebarwiona" (krok 1.4). Dodać 500 μl buforu EDTA-PBS i przechowywać probówkę na lodzie.
2. Dodaj 20 μl każdego przeciwciała (CD19, CD34 i CD45) na milion komórek do pozostałej zawiesiny komórkowej. Dobrze wymieszaj i umieść probówkę w ciemności na 30 minut w temperaturze pokojowej. Przeciwciała CD są wrażliwe na światło, wykonaj kroki 2-4 przy wyłączonych światłach.
3. Po 30 minutach inkubacji z przeciwciałami odessać 40 μl zawiesiny komórkowej i umieścić ją w probówce oznaczonej "7AAD". Dodać 1 ml PBS do probówki i odwirować przy 500 x g przez 2 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu wiążącego. Dodać 7 μl 7AAD (7-Aminoactinomycyny D) i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas 10-minutowej inkubacji wykonać krok 3.4.
4. Dodać PBS do górnej części probówki zawierającej pozostałe komórki znakowane przeciwciałami CD. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant, dodać 500 μl buforu EDTA-PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy. Przenieść całą objętość zawiesiny komórek do probówki oznaczonej "+++". Aby odzyskać całą zawiesinę komórkową, dodać dodatkowy 1 ml buforu EDTA-PBS do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przenieść do probówki oznaczonej "+++".
5. Po inkubacji (krok 3.3) dodać 300 μl buforu wiążącego do probówki 7AAD. Próbki "niebarwione", "7AAD" i "+++" oraz probówki "34 ⁺", "45^low", "45^med" i "^{45 high}" są gotowe do cytometrii przepływowej.

4. Sortowanie komórek za pomocą cytometru przepływowego MoFlo XDP

1. Konfiguracja MoFlo do sortowania: Wyrównaj lasery, ustabilizuj strumień kropli, określ opóźnienie upuszczania.
2. Przygotuj pojedyncze kontrolki kompensacji kolorów za pomocą zestawu koralików Invitrogen AbC Mouse (lub podobnego) zgodnie z instrukcjami producenta. Uruchom sterowanie pojedynczym kolorem, dostosowując napięcia kanałów fluorescencyjnych w celu optymalnej separacji populacji dodatnich i ujemnych. Ustaw współczynniki kompensacji i zastosuj skompensowany parametr do protokołu odbioru. Przywróć współczynniki kompensacji za każdym razem, gdy uzyskuje się nową partię przeciwciał.
3. Utwórz protokół zawierający wykresy, jak pokazano na rysunku 2.
4. Uruchom niebarwioną próbkę, ustaw napięcie i wzmocnienie dla rozproszenia do przodu i bocznego oraz zidentyfikuj populacje fluorescencji ujemnej. Ponieważ celem jest odzyskanie DNA, próg powinien być ustawiony na niskim poziomie (≤1%), aby szczątki zawierające DNA nie zanieczyszczały odzyskanych próbek. *Upewnij się, że system ewakuacji aerozolu jest uruchomiony przez cały czas, gdy żywe komórki ludzkie są uruchamiane na MoFlo.
5. Uruchom małą porcję próbki +++ (~ 50 000 zdarzeń), aby ustawić strategię bramkowania (Rysunek 2). Ponieważ komórki progenitorowe komórek B nie rozpraszają się identycznie jak dojrzałe komórki B, należy umieścić niezainfekowaną populację CD19 + / CD34 + na wykresie SSC vs FSC, aby upewnić się, że brama limfocytów zawiera potencjalne komórki Pro-B. Z tej próbki ustalono również populację ujemnej fluorescencji dla 7AAD.
6. Uruchom próbkę 7AAD, aby określić żywotność próbki. Sortuj tylko komórki z próbki o wysokiej żywotności na początku (≥95%), ponieważ martwe komórki będą się barwić bezkrytycznie i mogą zanieczyścić populacje sortu.
7. Skonfiguruj decyzje sortowania, aby zebrać cztery populacje: CD19⁺/CD34⁺; CD19⁺/CD34^-/CD45^niski; CD19⁺/CD34^-/CD45^med.; i CD19⁺/CD34^-/CD45^wysoki. Uwzględnij bramki dyskryminacji limfocytów i dubletów w decyzjach dotyczących sortowania we wszystkich populacjach.
8. Aby zapobiec zatykaniu się końcówki sortującej, należy przefiltrować próbkę +++ przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm bezpośrednio przed sortowaniem i ponownie przefiltrować, jeśli podczas sortowania w próbce wystąpi jakakolwiek agregacja.
9. Posortuj komórki do probówek zbiorczych (krok 1.4) pokrytych 2% FBS w PBS w schłodzonym lub wypełnionym lodem uchwycie na probówki.
10. Natychmiast po zakończeniu sortowania wyekstrahuj DNA.

Wyniki

Zmienność międzypróbkowa odgrywa istotną rolę w sukcesie sortowania komórek (Tabela 1). Próbki o wysokim stopniu powodzenia charakteryzują się niskim poziomem zanieczyszczeń w postaci debris (Rysunek 3A), natomiast próbki o niskim stopniu powodzenia wykazują wysoki poziom zanieczyszczeń w postaci debris (Rysunek 3B). Zmienność międzypróbkową można w pewnym stopniu kontrolować, jeśli próbka krwi pępowinowej została pobrana w ciągu 24 h przed wysyłką (pierwszy priorytet O/N).

Komórki posortowane za pomocą cytometrii przepływowej z każdej subpopulacji prekursorowych limfocytów B są obecne w ilości i jakości wystarczającej do przeprowadzenia izolacji kwasów nukleinowych. Izolowane DNA jest wysokiej jakości i może być wykorzystane w dalszych analizach. Rutynowo wykorzystujemy to DNA w metodzie MIRA¹¹ w celu wzbogacenia w zmetylowane DNA (Rysunek 4).

Dane ośrodka przechowywania krwi pępowinowej	Niewłaściwa segregacja	Właściwa segregacja
Robocza objętość krwi z antykoagulantem (ml)	110	104
Leukocyty [103/ μl]	8.68	11.19
Limfocyty [103/ μl]	3.88	3.76
Limfocyty (%)	44.70	33.6
Erytrocyty [106/ μl]	3.65	3.05
Dane wewnętrzne
Liczba komórek po zastosowaniu Ficoll-Paque	206 M	309 M
Liczba komórek po separacji MACS	22 M	16,5 M
Całkowita liczba zdarzeń (MoFlo XDP)	30,57 M	19,97 M
Żywotność (%)	98.00	98.00
Odsetek komórek w bramce limfocytów (%)	17.00	50.00
CD19+/CD34+
Całkowita liczba komórek	10959	48316
% całkowitej liczby zdarzeń	0.04	0.24
Wydajność	88%	88%
CD19+/CD34-/CD45niski
Całkowita liczba komórek	16619	26941
% całkowitej liczby zdarzeń	0.05	0.13
Wydajność	89%	87%
CD19+/CD34-/CD45med
Całkowita liczba komórek	469745	507540
% całkowitej liczby zdarzeń	1.54	2.54
Wydajność	89%	89%
CD19+/CD34-/CD45wysoki
Całkowita liczba komórek	1896062	2047142
% całkowitej liczby zdarzeń	6.2	10.25
Wydajność	91%	90%

Tabela 1. Reprezentatywne statystyki sortowania komórek. Wiersze 1-5 zawierają liczby dostarczone przez ośrodek krwi pępowinowej. Pozostałe wiersze stanowią dane zebrane w naszym laboratorium. Słabe sortowanie charakteryzowało się wysokim poziomem zanieczyszczeń oraz niskim odsetkiem komórek w bramce limfocytów.

Rysunek 1. Schemat procedury. Krew z krwi pępowinowej jest przetwarzana, a komórki monocytyczne są izolowane przy użyciu Ficoll-paque plus. Wprowadzono dodatkowy etap płukania w celu usunięcia zanieczyszczających płytek krwi. Limfocyty B są izolowane z komórek monocytycznych przy użyciu zestawu do izolacji ludzkich limfocytów B MACS (B-CLL). Na tym etapie wykorzystuje się biotynylowane przeciwciała monoklonalne (CD2, CD4, CD11b, CD36, Anti-IgE oraz CD235a) w celu usunięcia wszystkich komórek innych niż limfocyty B. Odzyskane limfocyty B są znakowane przeciwciałami CD19-APC, CD34-PE i CD45-FITC, a następnie sortowane za pomocą cytometru przepływowego MoFlo XDP w celu wyodrębnienia subpopulacji prekursorowych limfocytów B: CD19⁺/CD34⁺; CD19⁺/CD34^-/CD45^low; CD19⁺/CD34^-/CD45^med; oraz CD19⁺/CD34^-/CD45^high.

Rycina 2. Strategia bramkowania w celu identyfikacji i sortowania populacji. Czerwone strzałki wskazują bramkę zastosowaną do kolejnego wykresu. Bramki R4, R5, R6 i R7 wskazują posortowane populacje. a) Wykres rozpraszania światła w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC) przedstawiający wzbogaconą populację limfocytów. R1, bramka limfocytów. b) Wykres wysokości względem szerokości rozpraszania w przód w celu identyfikacji pojedynczych komórek w odróżnieniu od dubletów. R2, bramka pojedynczych komórek. c) Komórki CD19-APC dodatnie dzielą się na populacje CD34-PE ujemne i dodatnie. R3, bramka CD19⁺/CD34^-; R4, bramka CD19⁺/CD34⁺ wskazująca pożądaną populację do sortowania. d) Komórki CD19⁺/CD34^- dzielą się na trzy dość wyraźne populacje CD45-FITC. R5 i R6 to odpowiednio populacje CD19⁺/CD34^-/CD45^low oraz CD19⁺/CD34^-/CD45^med. R7, ze względu na dużą liczbę komórek w populacji CD19⁺/CD34^-/CD45^high, ta bramka sortująca obejmuje tylko część populacji. Nie wszystkie komórki tej populacji muszą być zbierane do dalszych analiz.

Rycina 3. a) Niski poziom zanieczyszczeń szczątkami po wzbogacaniu kolumnowym. R1, bramka limfocytów. b) Wysoki poziom zanieczyszczeń szczątkami po wzbogacaniu kolumnowym.

Rycina 4. Wzbogacenie zmetylowanego DNA z subpopulacji prekursorowych limfocytów B. a) Sonikowane DNA wyizolowane z subpopulacji prekursorowych limfocytów B jest wysokiej jakości. Do konstrukcji bibliotek DNA sonikowano do średniej wielkości 200-600 bp. Ścieżka 1: drabinka Promega 100 bp (nr katalogowy #G2101); ścieżka 2: całkowite DNA wyizolowane z komórek CD19+/CD34+; ścieżka 3: całkowite DNA wyizolowane z komórek CD19⁺/CD34^-/CD45^low; ścieżka 4: 100 ng DNA wyizolowanego z komórek CD19⁺/CD34^-/CD45^med; ścieżka 5: 100 ng DNA wyizolowanego z komórek CD19⁺/CD34^-/CD45^high. DNA sonikowano za pomocą urządzenia Diagenode Bioruptor w trybie High przez łącznie 9 min (30 s włączone; 30 s wyłączone). DNA oczyszczono kolumnowo i uwizualizowano na 1% żelu agarozowym przy użyciu barwnika do kwasów nukleinowych SYBR green. b) Po przeprowadzeniu MIRA z użyciem zestawu ActivMotif MethylCollector Ultra wykonano reakcję PCR dla SLC25A37 (1-6) oraz APC1 (7-12), aby potwierdzić wzbogacenie zmetylowanego DNA. 1&7: sonikowane DNA genomiczne (bez MIRA); 2&8: DNA MIRA-CD19+/CD34+; 3&9: DNA MIRA-CD19⁺/CD34^-/CD45^low; 4&10: DNA MIRA-CD19⁺/CD34^-/CD45^med; 5&11: DNA MIRA-CD19⁺/CD34^-/CD45^high; 6&12: kontrola z wodą. Silniejsza amplifikacja SLC25A37 potwierdza wzbogacenie zmetylowanego DNA w subpopulacjach prekursorowych limfocytów B.

Dyskusja

Czynnikiem, który ma największy wpływ na powodzenie protokołu, jest obecność zanieczyszczeń. W przypadku zamawiania krwi z banku krwi pępowinowej ważne jest, aby krew została wysłana jak najszybciej po pobraniu. Ponadto próbki sklasyfikowane jako limfocytoza zawierają większą liczbę limfocytów; jednak próbki te nie mają odpowiedniej liczby prekursorowych limfocytów B i nie powinny być używane. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania wystarczającej liczby komórek dla każdego z podzbiorów prekursorów, zalecamy rozpoczęcie od co najmniej 85 ml krwi pępowinowej.

Ważne jest, aby pamiętać, że w przeciwieństwie do separacji krwi obwodowej u dorosłych, podczas frakcjonowania krwi pępowinowej warstwa jednojądrzasta jest często zanieczyszczona czerwonymi krwinkami¹². Protokół ten obejmuje dodatkowy etap płukania w celu usunięcia zanieczyszczających płytek krwi. Protokoły opisujące separację jednojądrzastą od krwi pępowinowej sugerują włączenie etapu lizy w celu usunięcia niechcianych krwinek czerwonych. Nie zalecamy tego kroku, ponieważ powoduje on powstawanie zanieczyszczeń i ma negatywny wpływ na powodzenie sortowania komórek.

W celu zmniejszenia liczby komórek, które muszą być rozróżniane za pomocą cytometrii przepływowej, konieczne jest wykonanie wzbogacenia komórek B przed sortowaniem komórek. Protokół dostarczony przez Miltenyi Biotec, który towarzyszy zestawowi do izolacji komórek B (B-CLL), został zoptymalizowany pod kątem krwi obwodowej i zaleca stosowanie 10 μl koktajlu przeciwciał biotyny B-CLL na 10 milionów komórek. W tym etapie wykorzystuje się przeciwciała przeciwko CD2 (limfocyty T; Komórki NK), CD4 (limfocyty T), CD11b (granulocyty; monocyty; makrofagi), CD16 (komórki NK; makrofagi; komórki tuczne), CD36 (płytki krwi), CD235a (komórki erytroidalne) w celu zubożenia komórek innych niż B z krwi pępowinowej. Ważne jest, aby używać opisanego zestawu, a nie zestawu do izolacji komórek B II, ponieważ poprzedni zestaw zawiera przeciwciało przeciwko CD43, które jest obecne na komórkach pro-B. Podczas naszej optymalizacji tego protokołu stwierdziliśmy, że łącznie 40 μl koktajlu przeciwciał biotynowych B-CLL wystarcza do uzyskania pozytywnego wyniku sortowania komórek. Ponadto stwierdziliśmy, że użycie zaledwie 5 μl więcej koktajlu przeciwciał biotynowych B-CLL miało niekorzystny wpływ na rodzaj komórek. Dlatego zdecydowanie zalecamy użycie 40 μl koktajlu przeciwciał biotynowych B-CLL dla całkowitej liczby komórek jednojądrzastych między 175-250 milionami. Jeśli zaczynasz od mniejszej lub większej liczby komórek, może być konieczne odpowiednie skalowanie odczynników.

Istnieje wiele sprzecznych publikacji opisujących markery, które można wykorzystać do rozróżnienia subpopulacji komórek B. Większość rozbieżności można wytłumaczyć faktem, że różnicowanie jest procesem ciągłym i że obecność lub brak markerów na powierzchni komórki zachodzi w sposób stopniowy, a nie w sposób "wszystko albo nic". W tym protokole CD34^-/CD19 ⁺ i poziom intensywności ekspresji CD45 ⁺ (niska, średnia, wysoka) wykorzystano do rozróżnienia komórek B pre-BI, pre-BII i niedojrzałych ze wzrostem poziomu ekspresji CD45 odpowiadającym progresji różnicowania⁶. Komórki Pro-B zostały opisane przez niektórych jako CD19 ⁺ / CD34 ^{+ 13} , podczas gdy inni wykazali, że komórki pro-B to CD19 ^/ CD34 ⁺ , a komórki pre-BI to CD19 ⁺ / CD34 ^{+ 9,10}. Na podstawie tych rozbieżności oznaczyliśmy komórki CD19 ⁺ / CD34 ⁺ jako późne komórki pro-B / wczesne komórki pre-BI. Należy zauważyć, że strategia ta została opracowana w celu wyizolowania podzbiorów prekursorowych limfocytów B, które odpowiadają komórkom dotkniętym chorobą ostrej białaczki limfoblastycznej. Istnieje jednak wiele strategii sortowania, które można zastosować w zależności od podtypu komórki będącej przedmiotem zainteresowania.

Kombinacje przeciwciało-fluorochrom należy dobierać w oparciu o możliwości dostępnego sortera komórek. Zgodnie z ogólną zasadą, najjaśniejszy fluorochrom w panelu powinien być używany do oznaczania najmniej zaludnionego antygenu i odwrotnie. W wykrywaniu podwójnie barwionych populacji, zwłaszcza rzadkich zdarzeń, takich jak te, dyskryminacja dubletowa (Figura 2B) jest niezwykle ważną częścią strategii bramkowania. Gwarantuje to, że zdarzenia podwójnie dodatnie są naprawdę pojedynczymi komórkami wybarwionymi obydwoma przeciwciałami, a nie tylko dwiema pojedynczymi barwionymi komórkami przylegającymi do siebie.

Szybkie, 4-kierunkowe sortowanie komórek z konieczności tworzy kontrolowane środowisko aerozolowe. Dlatego sortowanie żywych komórek ludzkich powinno być wykonywane z dużą ostrożnością. Opublikowane wytyczne dotyczące bezpieczeństwa i dekontaminacji są dostępne i powinny zostać przejrzane i wdrożone przed sortowaniem¹⁴. Przed sortowaniem może być wymagane zatwierdzenie przez Instytucjonalne Komitety ds. Bezpieczeństwa Biologicznego lub ich odpowiedniki. W celu prawidłowego odkażenia po sortowaniu należy dodać wybielacz do pojemnika na odpady do końcowego stężenia 10%. Podobnie, wszystkie rurki do pobierania próbek, a także wszystkie powierzchnie w bezpośrednim sąsiedztwie powinny być dokładnie odkażone świeżo przygotowanym 10% roztworem wybielacza.

Podsumowując, protokół ten zapewnia strategię uzyskiwania rzadkich populacji prekursorowych komórek B i może być modyfikowany w celu wyizolowania dowolnej rzadkiej populacji obecnej we krwi pępowinowej, w tym hematopoetycznych komórek macierzystych i niedojrzałych komórek T. Ostatnio zidentyfikowano niedojrzałe limfocyty B we krwi obwodowej osób z zaawansowanym wirusem HIV¹⁵. Dlatego użyteczność tej metody wykracza poza badanie nowotworów krwi. Wreszcie, nie przeprowadziliśmy jeszcze izolacji RNA na komórkach posortowanych przepływowo; jednak metoda ta powinna być możliwa do dostosowania z zastrzeżeniem, że podczas sortowania komórek komórki powinny być sortowane bezpośrednio do trizolu lub równoważnego rozwiązania kompatybilnego z RNA, takiego jak RLT z zestawu RNeasy dostępnego za pośrednictwem Qiagen.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DPBS (1X)	Gibco firmy Life Technologies	14190-144
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Bio-Sciences AB	17-1440-03
Kolumna LS	MACS Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multi Stand	MACS Miltenyi Biotec	130-042-303
Separator MidiMACS	MACS Miltenyi Biotec	130-042-302
Zestaw do izolacji komórek B (B CLL)	MACS Miltenyi Biotec	130-093-660
Surowica bydlęca	płodu ATLANTA Biologicals	S11195
Probówka do mikrowirówki (1,5 ml)	MIDSCI	SS1500
BD Pharmingen 7-AAD (7-aminoaktynomycyna D)	BD Biosciences	559763
DB Pharmingen APC Mysz anty-ludzka CD19	BD Biosciences
DB Pharmingen PE Mysz Anti-Human CD34	BD Biosciences	560941
CD45 FITC	BD Biosciences	347463
autoMACS Roztwór do płukania	MACS Miltenyi Biotec	130-091-222
MACS BSA Roztwór podstawowy	MACS Miltenyi Biotec	130-091-376
BD Falcon 5 ml polistyrenowa tuba okrągłodenna	BD Biosciences	352058
BD Falcon 50 ml Tubka	BD Biosciences	352098
PuraFlow Płyn osłonowy, 8X	Beckman Coulter	CY30230
FlowCheck Stopki wyrównujące	Beckman Coulter	6605359
Ultra Rainbow Stopki wyrównujące	Spherotech	URFP-30-2
ViroSafe Aerozolowy filtr ewakuacyjny	Beckman Redlica	ML01330
ABC Zestaw koralików do myszy	Invitrogen	A-10344
40 μ m Sitko do komórek	Fisher Scientific	22363547
Fisher Scientific Hemocytometr	Fisher Scientific	267110
Mikroskop
accuSpin Model 3R Wirówka stołowa	Fisher Scientific	13-100-516
Cytometr przepływowy MoFlo XDP	Beckman Coulter	ML99030
Jednostka ewakuacji aerozoli	Beckman Coulter

555415