Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Aby zidentyfikować aberracje, które są obecne w chorobie, niezwykle ważne jest, abyśmy używali zdrowych tkanek lub komórek, które odpowiadają tkance lub typowi komórki dotkniętej chorobą. Jednym z powodów takiego stanu rzeczy jest to, że zmienność epigenetyczna między typami tkanek jest odpowiedzialna za regulację ekspresji genów i ma kluczowe znaczenie dla różnicowania komórek podczas normalnego rozwoju człowieka^1,2. Drugim powodem jest to, że nieprawidłowa regulacja genów specyficznych dla tkanek może mieć tragiczne konsekwencje dla prawidłowego rozwoju i wiadomo, że przyczynia się do wielu stanów chorobowych, w tym raka. Dlatego lepsze zrozumienie choroby, która obejmuje komórki krwiotwórcze, wymaga wiedzy na temat zdrowych komórek krwiotwórczych.

Rozwój komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym przebiega poprzez systematyczny porządek zdarzeń charakteryzujących się zmianami w ekspresji markerów powierzchni komórki³. Badania z udziałem dorosłych uczestników wykazały, że szpik kostny zwykle zawiera małą liczbę prekursorowych limfocytów B^4,5; mając na uwadze, że badania z udziałem uczestników pediatrycznych wykazały, że odsetek prekursorowych limfocytów B jest stosunkowo wysoki u osób w wieku poniżej 5 lat⁶. Krew pępowinowa jest wykorzystywana jako źródło hematopoetycznych komórek macierzystych w leczeniu chorób i nowotworów złośliwych związanych z krwią, jest łatwo dostępna za pośrednictwem banków krwi pępowinowej i jest wzbogacana o niedojrzałe limfocyty B i T⁷, które są komórkami docelowymi wielu zaburzeń, w tym białaczki i chłoniaków.

Prekursorowe komórki B w szpiku kostnym zostały dokładnie fenotypowane^8,9 i mogą być zdefiniowane przez obecność specyficznych markerów powierzchni komórek, które mogą być użyte do sortowania tych komórek na odrębne podzbiory. Normalne różnicowanie komórek B przebiega przez szereg etapów w szpiku kostnym, zaczynając od najwcześniejszych komórek pro-B, a kończąc na niedojrzałych lub naiwnych komórkach B. Według van Zelma i współpracowników¹⁰, komórki pro-B charakteryzują się obecnością CD34, a podczas przejścia do etapu 2 (Pre-BI) dochodzi do nabycia CD19. Komórki etapu 3 (Pre-BII) nie wykazują już ekspresji CD34 i zaczynają wyrażać cytoplazmatyczne IgM. Wreszcie, cechą charakterystyczną etapu 4 (niedojrzałe komórki B) jest ekspresja powierzchniowej IgM. Strategia sortowania opisana w tym protokole została po raz pierwszy opisana przez Caldwella i współpracowników⁶ i obejmuje użycie tylko 3 markerów powierzchni komórek, co znacznie zmniejsza złożoność i koszt przeprowadzania eksperymentów sortowania komórek. W swojej pracy ustalono związek między CD45 a etapami różnicowania limfocytów B. Zaobserwowali, że limfocyty B w szpiku kostnym wykazują zmienne poziomy ekspresji CD45. W szczególności komórki, które wyrażały wysoki poziom CD45, odpowiadały komórkom, które wyrażały powierzchniowe IgM (niedojrzałe komórki B), te, które wyrażały pośredni poziom CD45, odpowiadały komórkom, które wyrażały cytoplazmatyczne IgM (komórki pre-BII), a te, które wyrażały niski poziom CD45, odpowiadały komórkom, które nie wyrażały cytoplazmatycznego IgM (komórki pre-BI). Protokół ten wykorzystuje strategię opracowaną przez Caldwella i współpracowników⁶ w celu wyizolowania podzbiorów prekursorowych limfocytów B z krwi pępowinowej (ryc. 1), które można wykorzystać w dalszych testach wymagających wysokiej jakości kwasów nukleinowych, takich jak test odzyskiwania wyspy metylowanej CpG (MIRA)¹¹ i ilościowe testy PCR w czasie rzeczywistym. Metoda wykorzystuje wstępną separację za pomocą kulek magnetycznych w celu wyczerpania wszystkich komórek innych niż B z krwi pępowinowej i wymaga barwienia tylko 3 przeciwciałami (CD34, CD19 i CD45). Odzyskane komórki reprezentują 4 etapy różnicowania limfocytów B: 1) CD34⁺; CD19⁺ (późny pro-B i wczesny pre-BI); 2) CD34^-; CD19⁺; CD45^niski (późny pre-BI); 3) CD34^-; CD19⁺; CD45^med (przed BII); oraz 4) CD34^-; CD19⁺; ^Wysoki poziom CD45 (niedojrzałe komórki B).

1. Izolacja komórek jednojądrzastych z krwi pępowinowej

1. Przygotować bufor EDTA-PBS - dodać 5 ml roztworu podstawowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 95 ml buforu do płukania (rozcieńczenie 1:20). Odgazuj bufor i utrzymuj bufor na lodzie. ważny: Brak odgazowania buforu może skutkować mniej niż optymalnymi wynikami podczas izolowania komórek B CD19 +, ponieważ pęcherzyki mogą blokować kolumnę izolacyjną.
2. Przygotować stożkowe probówki o pojemności 50 ml do wirowania w gradiacji gęstości. Określ liczbę probówek potrzebnych do przetworzenia krwi pępowinowej (1 probówka może przetworzyć 8 ml krwi) i dodaj 15 ml Ficoll-Paque PLUS do każdej probówki.
3. Rozcieńczyć 8 ml krwi pępowinowej w 24 ml DPBS (1X) i ostrożnie nałożyć rozcieńczoną mieszaninę krwi pępowinowej na wierzch Ficoll-Paque PLUS w każdej ze stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Nie mieszać krwi z Ficoll-Paque PLUS. ważny: Aby uniknąć mieszania się krwi pępowinowej i Ficoll-Paque PLUS, trzymaj probówkę pod kątem 45 stopni i powoli nakładaj mieszaninę krwi.
4. Wirować przy 400 x g przez 40 minut w temperaturze 20 °C. Komórki jednojądrzaste (MNC) pozostaną na granicy faz osocza-Ficoll-Paque PLUS, podczas gdy granulocyty i erytrocyty osadzają się ze względu na większą gęstość przy ciśnieniu osmotycznym Ficoll-Paque PLUS. Oznaczyć siedem okrągłodennych probówek o pojemności 5 ml przeznaczonych do użycia w części 3 numerem identyfikacyjnym próbki, datą i następującymi informacjami:

Pokryj probówki 4, 5, 6 i 7 2% FBS i umieść wszystkie probówki na lodzie.

5. Ostrożnie zasysać górną warstwę osocza i unikać kontaktu z warstwą komórek jednojądrzastych. Za pomocą szklanej pipety o pojemności 10 ml ostrożnie przenieś warstwę komórek jednojądrzastych do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Połączyć komórki jednojądrzaste z trzech probówek w jedną probówkę o pojemności 50 ml.
6. Napełnić probówkę PBS, delikatnie wymieszać i odwirować przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 20 °C. Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Powtórz 1x. Po pierwszym umyciu ponownie zawiesić granulki i przenieść do pojedynczej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
7. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 200 μl PBS. Pobrać 1 μl zawiesiny komórek, dodać ją do 1 ml PBS w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i odstawić do liczenia (policzyć komórki po umieszczeniu 50 ml zawiesiny komórek w wirówce). Napełnij probówkę PBS i odwiruj przy 200 x g przez 15 minut w celu usunięcia płytek krwi. Usunąć supernatant całkowicie, nie naruszając osadu komórkowego.

2. Zmodyfikowana izolacja komórek B z komórek jednojądrzastych za pomocą separacji MACS

1. Zawiesić osad z kroku 1.7 za pomocą 160 μl zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS.
2. Dodać 40 μl koktajlu przeciwciał biotynowych B-CLL. Dobrze wymieszać pipetą i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Umyć komórki - dodać 1 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS na 10 milionów komórek (liczba komórek określona w kroku 1.7) i odwirować przy 300 x g przez 10 min. Całkowicie odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad komórek w 320 μl zimnego (4 °C) buforu EDTA-Pbs.
4. Dodać 80 μl mikrokulek antybiotyny, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
5. Umyć komórki - dodać 1 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS na 10 milionów komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 min. Ponownie zawiesić do 100 milionów komórek w 500 μl zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS. Skaluj wolumin buforu zgodnie z numerem komórki.
6. Przygotuj kolumny MACS i separatory MACS podczas wirowania (krok 2.5). Umieścić kolumnę LS w polu magnetycznym separatora MACS, dodać 3 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-Pbs na kolumnę i pozwolić, aby bufor przepłynął przez kolumnę. Użyj pojemnika, aby złapać przepływ. Odrzuć przepływ.
7. Umieścić stożkową probówkę o pojemności 50 ml pod kolumną i odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę. Pozwolić, aby nieoznakowane komórki przesączyły się przez kolumnę i trafiły do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. WAŻNE: Są to komórki, które będą używane do znakowania przeciwciał i sortowania komórek. Nie wyrzucaj przepływu. Aby odzyskać wszystkie komórki z kroku 2.5, dodać dodatkowy 1 ml zimnego (4 °C) buforu EDTA-PBS do ścianek stożkowej probówki. Delikatnie wymieszać i odpipetować pozostałą zawiesinę komórek na kolumnę. Powtórz 1x. Przejdź do kroku 2.8, używając nieoznakowanych komórek zebranych w stożkowej probówce po przejściu przez kolumnę.
8. Napełnić stożkową probówkę zawierającą nieoznakowane komórki PBS i wirować przy 300 x g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Dodać 200 μl buforu EDTA-PBS i delikatnie zawiesić komórki.

3. Znakowanie przeciwciał i przygotowanie do sortowania komórek

1. Odessać 1 μl zawiesiny komórkowej i umieścić w probówce oznaczonej jako "niebarwiona" (krok 1.4). Dodać 500 μl buforu EDTA-PBS i przechowywać probówkę na lodzie.
2. Dodaj 20 μl każdego przeciwciała (CD19, CD34 i CD45) na milion komórek do pozostałej zawiesiny komórkowej. Dobrze wymieszaj i umieść probówkę w ciemności na 30 minut w temperaturze pokojowej. Przeciwciała CD są wrażliwe na światło, wykonaj kroki 2-4 przy wyłączonych światłach.
3. Po 30 minutach inkubacji z przeciwciałami odessać 40 μl zawiesiny komórkowej i umieścić ją w probówce oznaczonej "7AAD". Dodać 1 ml PBS do probówki i odwirować przy 500 x g przez 2 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu wiążącego. Dodać 7 μl 7AAD (7-Aminoactinomycyny D) i inkubować w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas 10-minutowej inkubacji wykonać krok 3.4.
4. Dodać PBS do górnej części probówki zawierającej pozostałe komórki znakowane przeciwciałami CD. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant, dodać 500 μl buforu EDTA-PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy. Przenieść całą objętość zawiesiny komórek do probówki oznaczonej "+++". Aby odzyskać całą zawiesinę komórkową, dodać dodatkowy 1 ml buforu EDTA-PBS do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przenieść do probówki oznaczonej "+++".
5. Po inkubacji (krok 3.3) dodać 300 μl buforu wiążącego do probówki 7AAD. Próbki "niebarwione", "7AAD" i "+++" oraz probówki "34 ⁺", "45^low", "45^med" i "^{45 high}" są gotowe do cytometrii przepływowej.

4. Sortowanie komórek za pomocą cytometru przepływowego MoFlo XDP

1. Konfiguracja MoFlo do sortowania: Wyrównaj lasery, ustabilizuj strumień kropli, określ opóźnienie upuszczania.
2. Przygotuj pojedyncze kontrolki kompensacji kolorów za pomocą zestawu koralików Invitrogen AbC Mouse (lub podobnego) zgodnie z instrukcjami producenta. Uruchom sterowanie pojedynczym kolorem, dostosowując napięcia kanałów fluorescencyjnych w celu optymalnej separacji populacji dodatnich i ujemnych. Ustaw współczynniki kompensacji i zastosuj skompensowany parametr do protokołu odbioru. Przywróć współczynniki kompensacji za każdym razem, gdy uzyskuje się nową partię przeciwciał.
3. Utwórz protokół zawierający wykresy, jak pokazano na rysunku 2.
4. Uruchom niebarwioną próbkę, ustaw napięcie i wzmocnienie dla rozproszenia do przodu i bocznego oraz zidentyfikuj populacje fluorescencji ujemnej. Ponieważ celem jest odzyskanie DNA, próg powinien być ustawiony na niskim poziomie (≤1%), aby szczątki zawierające DNA nie zanieczyszczały odzyskanych próbek. *Upewnij się, że system ewakuacji aerozolu jest uruchomiony przez cały czas, gdy żywe komórki ludzkie są uruchamiane na MoFlo.
5. Uruchom małą porcję próbki +++ (~ 50 000 zdarzeń), aby ustawić strategię bramkowania (Rysunek 2). Ponieważ komórki progenitorowe komórek B nie rozpraszają się identycznie jak dojrzałe komórki B, należy umieścić niezainfekowaną populację CD19 + / CD34 + na wykresie SSC vs FSC, aby upewnić się, że brama limfocytów zawiera potencjalne komórki Pro-B. Z tej próbki ustalono również populację ujemnej fluorescencji dla 7AAD.
6. Uruchom próbkę 7AAD, aby określić żywotność próbki. Sortuj tylko komórki z próbki o wysokiej żywotności na początku (≥95%), ponieważ martwe komórki będą się barwić bezkrytycznie i mogą zanieczyścić populacje sortu.
7. Skonfiguruj decyzje sortowania, aby zebrać cztery populacje: CD19⁺/CD34⁺; CD19⁺/CD34^-/CD45^niski; CD19⁺/CD34^-/CD45^med.; i CD19⁺/CD34^-/CD45^wysoki. Uwzględnij bramki dyskryminacji limfocytów i dubletów w decyzjach dotyczących sortowania we wszystkich populacjach.
8. Aby zapobiec zatykaniu się końcówki sortującej, należy przefiltrować próbkę +++ przez sitko komórkowe o wielkości 40 μm bezpośrednio przed sortowaniem i ponownie przefiltrować, jeśli podczas sortowania w próbce wystąpi jakakolwiek agregacja.
9. Posortuj komórki do probówek zbiorczych (krok 1.4) pokrytych 2% FBS w PBS w schłodzonym lub wypełnionym lodem uchwycie na probówki.
10. Natychmiast po zakończeniu sortowania wyekstrahuj DNA.

Różnica między próbkami odgrywa rolę w powodzeniu sortowania komórek (Tabela 1). Próbki o dobrych wskaźnikach powodzenia mają niski poziom zanieczyszczeń (rysunek 3A), a próbki o słabych wskaźnikach powodzenia mają wysoki poziom zanieczyszczeń (rysunek 3B). Różnice między próbkami mogą być w pewnym stopniu kontrolowane, jeśli próbka krwi pępowinowej została pobrana w ciągu 24 godzin od wysyłki (pierwszy priorytet O/N).

Komórki posortowane przepływowo z każdego podzbioru prekursorowych komórek B są wystarczająco dużo i jakościowo, aby przeprowadzić izolację kwasów nukleinowych. Wyizolowane DNA jest wysokiej jakości i może być wykorzystane w dalszych analizach. Rutynowo wykorzystujemy to DNA w MIRA11 do wzbogacenia na metylowane DNA (Figura 4).

Tabela 1. Reprezentatywne statystyki sortowania komórek. Rzędy 1-5 to liczby podawane przez zakład krwi pępowinowej. Pozostałe wiersze to dane zebrane w naszym laboratorium. Ubogi gatunek zawierał wysoki poziom zanieczyszczeń i niski procent komórek w bramie limfocytów.

Rysunek 1. Schemat blokowy procedury. Krew pępowinowa jest przetwarzana, a komórki jednojądrzaste izolowane są za pomocą Ficoll-paque plus. W zestawie znajduje się dodatkowy etap płukania w celu usunięcia zanieczyszczających płytek krwi. Limfocyty B są izolowane z komórek jednojądrzastych za pomocą zestawu do izolacji ludzkich komórek B MACS (B-CLL). W tym etapie wykorzystuje się przeciwciała monoklonalne sprzężone z biotyną (CD2, CD4, CD11b, CD36, anty-IgE i CD235a) w celu usunięcia wszystkich komórek innych niż B. Odzyskane limfocyty B znakuje się przeciwciałami CD19-APC, CD34-PE i CD45-FITC, a następnie sortuje za pomocą cytometru przepływowego MoFlo XDP w celu odzyskania podzbiorów prekursorowych komórek B: CD19 + / CD34 +; CD19+/CD34-/CD45niski; CD19+/CD34-/CD45med.; i CD19+/CD34-/CD45wysoki.

Rysunek 2. Strategia bramkowania do identyfikowania i sortowania populacji. Czerwone strzałki wskazują bramę, która jest stosowana do kolejnej działki. Bramki R4, R5, R6 i R7 wskazują posortowane populacje. a) Wykres rozproszenia przodu i bocznego przedstawiający wzbogaconą populację limfocytów. R1, bramka limfocytów. b) Wysokość w stosunku do szerokości wykresu punktowego do identyfikowania pojedynczych komórek i dubletów. R2, brama z pojedynczą komórką. c) Komórki CD19-APC dodatnie należą do populacji CD34-PE ujemnych i dodatnich. R3, CD19+/CD34- bramka; R4, bramka CD19+/CD34+ wskazująca żądaną populację sortowania. d) Komórki CD19 + / CD34- należą do trzech nieco odrębnych populacji CD45-FITC. Populacje R5 i R6, CD19+/CD34-/CD45niskie i CD19+/CD34-/CD45med. R7, ze względu na wysoką liczbę komórek wpopulacji CD19 + / CD34 - / CD45, ta brama sortowania obejmuje tylko część populacji. Nie wszystkie komórki z tej populacji muszą być pobierane do dalszych analiz.

Rysunek 3. a) Niski poziom zanieczyszczeń po wzbogaceniu kolumny. R1, bramka limfocytów. b) Wysoki poziom zanieczyszczeń po wzbogaceniu kolumny.

Rysunek 4. Wzbogacanie metylowanego DNA z podzbiorów prekursorowych komórek B. a) Sonikowane DNA wyizolowane z podzbiorów prekursorowych komórek B jest wysokiej jakości. W przypadku budowy bibliotek DNA jest sonikowane średnio do 200-600 pz. Tor 1: Drabinka Promega 100 bp (katalog #G2101); Tor 2: Całkowite DNA wyizolowane z komórek CD19+/CD34+; Tor 3: Całkowite DNA wyizolowane zniskich komórek CD19 + / CD34 / CD45; Tor 4: 100 ng DNA wyizolowane z komórekmed. CD19 + / CD34 / CD45; Tor 5: 100 ng DNA wyizolowane zwysokich komórek CD19 + / CD34 / CD45. DNA poddano sonikacji za pomocą Diagenode Bioruptor w trybie High przez łącznie 9 minut (30 sekund włączenia; 30 sekund wyłączenia). DNA oczyszczono kolumnowo i zwizualizowano na 1% żelu agarozowym z barwieniem zielonym żelem kwasu nukleinowego SYBR. b) Po badaniu MIRA przy użyciu zestawu ActivMotif MethylCollector Ultra przeprowadza się PCR z SLC25A37 (1-6) i APC1 (7-12) w celu potwierdzenia wzbogacenia metylowanego DNA. 1&7: Sonizowane genomowe DNA (bez MIRA); 2&8: DNA MIRA-CD19+/CD34+; 3&9: MIRA-CD19 + / CD34 / CD45niskie DNA; 4&10: MIRA-CD19 + / CD34 / CD45med DNA; 5&11:Wysokie DNA MIRA-CD19+/CD34-/CD45; 6&12: Kontrola wody. Wyższa amplifikacja SLC25A37 potwierdza wzbogacenie metylowanego DNA w podzbiorach prekursorowych komórek B.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.