Artykuł metodologiczny

Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

DOI:

10.3791/50443

⸱

16 lipca 2013

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Międzykomórkowe fale Ca2+ są napędzane przez kanały połączeń szczelinowych i półkanały. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru międzykomórkowych fal Ca2 + w monowarstwach komórkowych w odpowiedzi na lokalny bodziec mechaniczny pojedynczej komórki oraz jej zastosowanie do badania właściwości i regulacji kanałów połączeń szczelinowych i półkanałów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja międzykomórkowa jest niezbędna do koordynacji procesów fizjologicznych między komórkami w różnych organach i tkankach, w tym w mózgu, wątrobie, siatkówce, ślimaku i naczyniach krwionośnych. W warunkach eksperymentalnych międzykomórkowe fale Ca2 + mogą być wywoływane przez zastosowanie bodźca mechanicznego do pojedynczej komórki. Prowadzi to do uwolnienia wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnałowych IP3 i Ca2 +, które inicjują koncentryczną propagację fali Ca2 + z mechanicznie stymulowanej komórki do sąsiednich komórek. Główne szlaki molekularne, które kontrolują międzykomórkową propagację fali Ca2 +, są zapewniane przez kanały połączeń szczelinowych poprzez bezpośredni transfer IP3 oraz przez półkanały poprzez uwalnianie ATP. Identyfikacja i charakterystyka właściwości i regulacji różnych izoform koneksyny i pannexyny jako kanałów połączeń szczelinowych i półkanałów jest możliwa dzięki ilościowemu określeniu rozprzestrzeniania się międzykomórkowej fali Ca2 +, siRNA oraz zastosowaniu inhibitorów kanałów i półkanałów połączeń szczelinowych. W tym miejscu opisano metodę pomiaru międzykomórkowego zawałka Ca2+ w monowarstwach pierwotnych komórek śródbłonka rogówki obciążonych Fluo4-AM w odpowiedzi na kontrolowany i zlokalizowany bodziec mechaniczny wywołany ostrym, krótkotrwałym odkształceniem komórki w wyniku dotknięcia błony komórkowej szklaną mikropipetą sterowaną mikromanipulatorem o średnicy końcówki mniejszej niż 1 μm. Opisujemy również izolację pierwotnych komórek śródbłonka rogówki bydła i jej zastosowanie jako systemu modelowego do oceny aktywności półkanału Cx43 jako siły napędowej dla międzykomórkowych fal Ca2 + poprzez uwalnianie ATP. Na koniec omówiono zastosowanie, zalety, ograniczenia i alternatywy tej metody w kontekście badań kanałów złączy szczelinowych i półkanałów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja i sygnalizacja międzykomórkowa są niezbędne do koordynacji procesów fizjologicznych w odpowiedzi na agonistów zewnątrzkomórkowych na poziomie tkanek i całego narządu 1,2 . Najbardziej bezpośredni sposób komunikacji międzykomórkowej powstaje w wyniku występowania połączeń szczelinowych. Połączenia szczelinowe to blaszki kanałów połączeń szczelinowych, które są kanałami białkowymi utworzonymi przez dokowanie głową w głowę dwóch półkanałów koneksynowych (Cx) sąsiednich komórek 3,4 (ryc. 1). Złącza szczelinowe umożliwiają przejście małych cząsteczek sygnałowych o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1,5 kDa, w tym Ca2 + lub IP3 5, powodując i modulując uwalnianie Ca2 + z wewnątrzkomórkowych magazynów sąsiednich komórek 6 (Figura 2). Kanały połączeń szczelinowych są ściśle regulowane przez wewnątrz- i międzycząsteczkowe interakcje białek oraz przez procesy sygnalizacji komórkowej, takie jak modyfikacja redoks i fosforylacja7. GJ ułatwiają skoordynowaną odpowiedź połączonych komórek, działając w ten sposób jako syncytium chemiczne i elektryczne. Na przykład rozprzestrzenianie się potencjału czynnościowego serca przez miocyty przedsionkowe i komorowe odbywa się za pośrednictwem kanałów GJ opartych na Cx 85. Cxs pełnią nie tylko rolę kanałów ze złączami szczelinowymi, ale także tworzą niesparowane półkanały, funkcjonując w ten sposób jako kanały w błonach podobnie jak zwykłe kanały jonowe 8-10 (ryc. 1). Półkanały uczestniczą w sygnalizacji parakrynnej między sąsiednimi komórkami, kontrolując wymianę jonów i cząsteczek sygnałowych między środowiskiem wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym.

W wielu typach komórek (takich jak komórki nabłonkowe, osteoblasty, astrocyty, komórki śródbłonka, itp.) i narządach (takich jak mózg, wątroba, siatkówka, ślimak i układ krwionośny), międzykomórkowe fale Ca2+ są fundamentalne dla koordynacji odpowiedzi wielokomórkowych 11. Wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2 + w określonej komórce nie ogranicza się do tej komórki, ale rozprzestrzenia się do otaczających sąsiednich komórek, tworząc w ten sposób międzykomórkową falę Ca2 + 12,13 . Te międzykomórkowe fale Ca2 + są ważne dla normalnej fizjologicznej regulacji warstw komórkowych jako syncytium, a ich rozregulowanie jest związane z procesami patofizjologicznymi 11. W śródbłonku i nabłonku rogówki różne grupy 14-24, w tym nasza własna 25-33, badały mechanizmy i role komunikacji międzykomórkowej. W komórkach niepobudliwych, takich jak komórki śródbłonka rogówki, występują dwa odrębne tryby komunikacji międzykomórkowej 28,29 , a mianowicie komunikacja międzykomórkowa w szczelinie i parakrynna komunikacja międzykomórkowa. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym polega na bezpośredniej wymianie cząsteczek sygnałowych za pośrednictwem połączeń szczelinowych 7. Komunikacja międzykomórkowa w szczelinie ma kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy tkanek, kontrolowania proliferacji komórek i ustanowienia zsynchronizowanej odpowiedzi na stres zewnątrzkomórkowy 10,34,35 . W wielu patologiach sprzężenie połączeń szczelinowych jest zmniejszone z powodu wadliwego Cxs, a tym samym wpływa na komunikację międzykomórkową węzła szczelinowego 36. Podkreśla to znaczenie i wpływ komunikacji międzykomórkowej w organizmach wielokomórkowych. W przeciwieństwie do komunikacji międzykomórkowej w szczelinie, parakrynna komunikacja międzykomórkowa nie jest zależna od ułożenia komórka-komórka, ponieważ obejmuje uwalnianie rozproszonych przekaźników zewnątrzkomórkowych (ryc. 2). Różne rodzaje cząsteczek sygnałowych są uwalniane w przestrzeni zewnątrzkomórkowej przez komórki sygnalizacyjne. Cząsteczka jest następnie transportowana do komórki docelowej, gdzie jest wykrywana przez określone białko receptorowe. Następnie kompleks receptor-sygnał indukuje odpowiedź komórkową, która kończy się usunięciem sygnału, inaktywacją lub odczulaniem. Uwolnione lipofilowe zewnątrzkomórkowe przekaźniki sygnalizacyjne przenikają przez błonę i działają na receptory wewnątrzkomórkowe. W przeciwieństwie do tego, hydrofilowi przekaźniki nie przechodzą przez błonę plazmatyczną reagującej komórki, ale działają jak ligand, który wiąże się z białkami receptorowymi o ekspresji powierzchniowej, które następnie przekazują sygnał do środowiska wewnątrzkomórkowego. W procesie tym uczestniczą trzy główne rodziny białek receptorów powierzchniowych komórek: połączone z kanałem jonowym, połączone z enzymem i połączone z białkiem G. Uwolniona cząsteczka przekaźnikowa może działać na receptory tej samej komórki (autokrynne), na komórki docelowe w bliskim sąsiedztwie (parakrynne) lub na odległe komórki docelowe, które wymagają układu krążenia (endokrynologiczne).

W wielu typach komórek, w tym w śródbłonku rogówki 28,29, ATP jest jednym z głównych hydrofilowych, parakrynnych czynników, które napędzają rozprzestrzenianie się międzykomórkowych fal Ca2+ 37-40. Podczas deformacji mechanicznej, niedotlenienia, stanu zapalnego lub stymulacji różnymi czynnikami, ATP może być uwalniany ze zdrowych komórek 41-44 w odpowiedzi na naprężenie ścinające, rozciąganie lub pęcznienie osmotyczne 44,45. Postulowano różne mechanizmy uwalniania ATP, w tym egzocytozę pęcherzykową 44 i mnóstwo mechanizmów transportu, takich jak transportery kasety wiążącej ATP (ABC), plazmomalne kanały anionowe zależne od napięcia plazmalnego 46, kanały receptora P2X7 47,48, a także półkanały koneksyny 49-52 i półkanały aneksyny 43,49,53. Zewnątrzkomórkowe ATP może być szybko hydrolizowane do ADP, AMP i adenozyny 54,55 przez ektonukleotydazy, które są obecne w środowisku zewnątrzkomórkowym. Uwalniany zewnątrzkomórkowo ATP i jego metabolit ADP 56 rozprzestrzeniają się poprzez dyfuzję. Późniejsze oddziaływanie tych nukleotydów z receptorami purynergicznymi w sąsiednich komórkach jest związane z propagacją międzykomórkowych fal Ca2 + 28,37,51. Występują dwie różne klasy receptorów purynergicznych: adenozyna jest głównym naturalnym ligandem dla purynoceptorów P1, podczas gdy nukleotydy purynowe (ATP, ADP) i pirymidynowe (UTP, UDP) działają na większość purynoceptorów P2 57.

Komunikacja międzykomórkowa może być badana różnymi metodami, takimi jak ładowanie skrobania, transfer barwnika, lokalne odblokowywanie agonistów takich jak IP3 i Ca2+, stymulacja mechaniczna, itp. Tutaj opisujemy badanie propagacji fal Ca2+ wywołanych mechaniczną stymulacją pojedynczej komórki. Zaletą badania propagacji fali Ca2+ za pomocą stymulacji mechanicznej jest to, że zapewnia łatwe narzędzie do ilościowego określenia rozprzestrzeniania się fali Ca2+ w czasie i umożliwia ilościowe porównanie różnych zabiegów wstępnych komórek. W śródbłonku rogówki te międzykomórkowe fale Ca2 + umożliwiają skoordynowaną odpowiedź z monowarstwy, działając w ten sposób jako możliwy mechanizm obronny nieregeneracyjnego śródbłonka rogówki, pomagając śródbłonkowi wytrzymać naprężenia zewnątrzkomórkowe podczas operacji wewnątrzgałkowej lub po ekspozycji na mediatory stanu zapalnego podczas odrzucenia immunologicznego lub zapalenia błony naczyniowej oka 58,59 .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Izolacja komórek śródbłonka rogówki

Zanim zaczniesz: Wyizoluj komórki z świeżych oczu, uzyskanych z lokalnej rzeźni, jak najszybciej po wyłuszczeniu oka. Upewnij się, że oko zostało wyłuszczone od krowy w wieku maksymalnie 18 miesięcy, pięć minut po sekcji zwłok i zakonserwowane w Earle's Balanced Salt Solution - 1% roztworze jodu w temperaturze 4 °C w celu transportu do laboratorium.

  1. Wyjmij oko z Earle's Balanced Salt Solution - 1% roztworu jodu i umieść je na szalce Petriego (100 x 20 mm).
  2. Wysterylizuj oko roztworem zawierającym 70% etanolu i przepłucz zrównoważonym roztworem soli Earle's zawierającym 1% jodu.
  3. Od tego kroku pracuj w sterylnym kapturze. Ostrożnie wypreparuj rogówkę z oka i umieść ją na szalce Petriego (35 x 10 mm) zawierającej zrównoważony roztwór soli Earle'a, z warstwą komórek nabłonka skierowaną do góry. W razie potrzeby ostrożnie usuń pozostałą tkankę tęczówki, która nadal jest przyczepiona do rogówki.
  4. Przenieś rogówkę do innego Zbilansowanego Roztworu Soli Earle'a zawierającego szalkę Petriego z warstwą komórek śródbłonka skierowaną do góry i spłucz dwukrotnie Zrównoważonym Roztworem Soli Earle'a.
  5. Przenieś rogówkę z warstwą śródbłonka skierowaną do góry do klepsydry, która jest naczyniem w kształcie miseczki, i przykryj ją pożywką wzrostową. Pożywka składa się z modyfikowanej pożywki Dulbecco's Eagle's Medium zawierającej 25 mM glukozy, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 6,6% L-glutaminy, 2,5 μg/ml amfoterycyny-B i 1% mieszaniny antybiotykowo-przeciwgrzybiczej zawierającej 10 000 jednostek/ml penicyliny, 10 000 μg/ml streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B.
  6. Usunąć pożywkę za pomocą pipety ssącej.
  7. Nanieś 300 μl roztworu trypsyny (0,5 g/l) na warstwę śródbłonka rogówki (wszystkie etapy zawierające trypsynę są wykonywane przy użyciu tego samego stężenia).
  8. Umieścić klepsydrę zawierającą rogówkę na przykrytej szalce Petriego i umieścić w inkubatorze na 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  9. Delikatnie zeskrob komórki śródbłonka z rogówki za pomocą wypolerowanej na ogniowo szklanej pipety Pasteura w kształcie haczyka w sterylnym kapturze.
  10. Odessać roztwór zawierający komórki śródbłonka i dodać go do kolb hodowlanych (25cm2) zawierających 4 ml pożywki hodowlanej.
  11. Nałożyć 300 μl pożywki wzrostowej na rogówkę i powtórzyć skrobanie, a następnie dodać roztwór zawierający komórki śródbłonka do kolby hodowlanej.
  12. Powtórz ten ostatni krok (1.11) jeszcze raz.
  13. Umieścić kolby hodowlane zawierające komórki śródbłonka rogówki w pożywce wzrostowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  14. Po dwóch dniach dodać 6 ml pożywki hodowlanej.
  15. Odświeżaj podłoże co drugi dzień.

2. Hodowla komórkowa

  1. Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć komórki zrównoważonym roztworem soli Earle'a, po osiągnięciu konfluencji (w ciągu około 10 dni po izolacji).
  2. Dodać 1,5 ml roztworu trypsyny do komórek, aby je oddzielić i umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 3 do 4 minut.
  3. Dodać 12 ml pożywki wzrostowej. Trzykrotnie odpipetować pożywkę do środka i z powrotem, aby rozproszyć komórki i policzyć komórki.
  4. Wysiewaj komórki o zmiennej frakcji w zależności od gęstości komórek i umieść je w inkubatorze. Przygotuj dwa szkiełka o dobrze komorowych komórkach (o powierzchni 4,2 cm2) z liczbą komórek 165 000 komórek (gęstość komórek 39 286 na cm2). Przygotować kolby hodowlane o średnicy 80cm2 do nowego przejścia o gęstości 6,250 nacm2 i dodać świeżą pożywkę do całkowitej objętości 25 ml.
  5. Odświeżaj podłoże co dwa dni.
  6. Zbieg warstwy komórkowej osiąga się po 3 do 4 dniach. Używanie komórek do eksperymentów.
  7. Po osiągnięciu zbiegu warstwy komórkowej w kolbach powtórz kroki od 2.1 do 2.6. Do eksperymentów można wykorzystać hodowle komórkowe do pasażu 2.

3. Mechaniczna stymulacja do wywoływania fali wapniowej

  1. Załadować komórki do szkiełka z komorą za pomocą 10 μM Fluo-4 AM w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami przez 30 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając.
  2. Usunąć roztwór Fluo-4 AM, przemyć komórki pięciokrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, inkubować komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i pozostawić komórki na co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej przed pomiarem.
  3. Wzbudzić przy 488 nm za pomocą lasera argonowego i użyć rozdzielacza wiązki HFT 488, zebrać emisję fluorescencji przy 530 nm za pomocą długoprzepustowego filtra emisyjnego LP 505, ustawić otwór na minimum. Użyj obiektywu 40X z olejkiem (Air, 1.2 N.A.). W eksperymentach z ARL-67156 używaj obiektywu 10X (Air, 0.3 N.A.).
  4. Wyszukaj pole, w którym komórki zlewają się na mikroskopie konfokalnym.
  5. Ustawić pipetę tak, aby znajdowała się pod kątem 45° w stosunku do szkiełka z komorą i dotykała błony komórkowej. Sprowokuj krótką (≈ 1 sek.) mechaniczną stymulację pojedynczej komórki. Stymulacja mechaniczna polega na ostrym, krótkotrwałym odkształceniu komórki poprzez krótkie dotknięcie mniej niż 1% błony komórkowej szklaną mikropipetą (średnica końcówki <1 μm) sprzężoną z piezoelektrycznym nanopozycjonerem kryształowym, obsługiwanym przez wzmacniacz zamontowany na mikromanipulatorze. Szklane mikropipety są wykonane ze ściągaczem do mikroelektrod. Upewnij się, że nanopozycjoner jest zasilany napięciem od 0,2 do 1,5 V podczas stymulacji mechanicznej. Napięcie wyższe niż 1,5 V może spowodować uszkodzenie ogniwa. Dla każdego typu i stanu ogniwa optymalne napięcie do stymulacji mechanicznej bez uszkodzenia ogniwa musi być dokładnie określone, stosując szereg napięć zaczynających się od niskiego (0,2 V) do wysokiego (1,5 V) napięcia. Napięcie jest miarą siły stymulacji, ponieważ napięcie to określa naprężenia mechaniczne i odkształcenia wywierane na błonę komórkową. Siłę stymulacji mechanicznej można obliczyć, mnożąc naprężenie mechaniczne przez powierzchnię. Ponieważ zarówno powierzchnia (<3,14 μm2), jak i naprężenia mechaniczne są bardzo niskie, siła stymulacji mechanicznej jest niska. (Zauważ, że gdy komórka jest uszkodzona, fluorescencja wycieka z komórki i komórka staje się ciemna).
  6. Zmierz zmiany przestrzenne w [Ca2+]i po stymulacji mechanicznej za pomocą mikroskopu konfokalnego.
  7. Zbieraj i przechowuj obrazy.
  8. Narysuj wielokątny obszar zainteresowania, aby zdefiniować całkowitą powierzchnię reagujących komórek (obszar aktywny, AA) za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane zgodnie z wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i wymogami organów regulacyjnych, a prezentowany protokół jest realizowany pod nadzorem i za zgodą komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt Uniwersytetu KU Leuven.

W komórkach endotelialnych rogówki bydlęcej (BCEC) eksponowane są funkcjonalne połączenia szczelinowe, a zarówno międzykomórkowa komunikacja poprzez połączenia szczelinowe, jak i komunikacja paracryna znacząco przyczyniają się do kom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym manuskrypcie opisujemy prostą metodę pomiaru międzykomórkowej propagacji fali Ca2 + w monowarstwach pierwotnych komórek śródbłonka rogówki bydła poprzez zapewnienie miejscowej i kontrolowanej stymulacji mechanicznej za pomocą mikropipety. Komórki stymulowane mechanicznie reagują lokalnym wzrostem wewnątrzkomórkowego IP3 i Ca2 +, z których oba są niezbędnymi wewnątrzkomórkowymi cząsteczkami sygnałowymi, które napędzają międzykomórkową propagację fali Ca2 + 11,67...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace badawcze prowadzone w laboratorium były wspierane przez granty Fundacji Badawczej - Flandria (FWO; numery grantów G.0545.08 i G.0298.11), Interuniversity Attraction Poles Program (Belgijska Polityka Naukowa; numer grantu P6/28 i P7/13) i są częścią społeczności badawczej wspieranej przez FWO. CDH jest adiunktem Fundacji Badawczej we Flandrii (FWO). Autorzy są bardzo wdzięczni wszystkim obecnym i byłym członkom Laboratorium Sygnalizacji Molekularnej i Komórkowej (KU Leuven), dr SP Srinivasowi (Indiana University School of Optometry, USA), laboratorium dr Leybaerta (Uniwersytet w Gandawie) i dr Vinkenowi (VUB), którzy zapewnili pomocne dyskusje, zoptymalizowali procedury lub byli zaangażowani w rozwój narzędzi do badania półkanałów koneksyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)Sondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)14155-048
JodSigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)38060-1EA
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)Sondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)11960-044
L-glutamina (Glutamax)Sondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)35050-038
Amphoterycyna-BSigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)A2942
Mieszanina antybiotykowo-przeciwgrzybiczaSondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)15240-096
TrypsynaSondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)25300-054
DulbeccoSondymolekularne PBS Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)14190-091
Fluo-4 AMSondy molekularne Invitrogen-Gibco (Karlsruhe, Niemcy)F14217
ARL-67156 (6-N,N-dietylo-b,g-dibromometyleno-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)A265
Apyrase VISigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)A6410
Apyrase VIISigma-Aldrich (Deisenhofen, Niemcy)A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)Niestandardowa synteza
Gap27 (SRPTEKTIFII)Niestandardowa synteza
Peptyd kontrolny (SRGGEKNVFIV)Niestandardowa synteza
siRNA1 Cx43 (sens: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdTT) Wyżarzone siRNA zakupiono w Eurogentec (Luik, Belgia)
siRNA2 Cx43 (sens: 5'CAAUUCUUCCUGGCAAUdTdT) Wyżarzone siRNA zostało zakupione w Eurogentec (Luik, Belgia)
Mieszanie siRNA: zaszyfrowana sekwencja siCx43-1 (sens: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdTTT) Wyżarzone siRNA zostało zakupione w Eurogentec (Luik, Belgia)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)Thermo Electron (Ulm, Niemcy)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Niemcy)
Szkiełka szklane dwukomoroweLaboratory-Tek Nunc (Roskilde, Dania)155380
Mikroskop konfokalny Carl Zeiss Meditec (Jena, Niemcy)LSM510
Piez– elektryczny nanopozycjoner kryształowy (Piezo Flexure NanoPositioner)PI Polytech (Karlsruhe, Niemcy)P-280
Wzmacniacz HVPZTPI Polytech (Karlsruhe, Niemcy)E463 Wzmacniacz
Szklane rurki (zamiennik szkła 3,5 nanolitra)World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Floryda, USA4878
Micr– ściągacz do ręczników Zeitz Instrumente (München, Niemcy)WZ DMZ-Ściągacz
peptydówpeptydówpeptydówHVPZT uniwersalny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell Signal. 18, 592-600 (2006).
  2. Mese, G., Richard, G., White, T. W. Gap junctions: basic structure and function. J. Invest. Dermatol. 127, 2516-2524 (2007).
  3. Bruzzone, R., White, T. W., Paul, D. L. Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. Eur. J. Biochem. 238, 1-27 (1996).
  4. White, T. W., Bruzzone, R., Paul, D. L. The connexin family of intercellular channel forming proteins. Kidney Int. 48, 1148-1157 (1995).
  5. Decrock, E., et al. Connexin-related signaling in cell death: to live or let die? Cell Death Differ. 16, 524-536 (2009).
  6. Herve, J. C. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 1-4 (2007).
  7. Herve, J. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Duffy, H. S. Gap junctional complexes: from partners to functions. Prog. Biophys. Mol. Biol. 94, 29-65 (2007).
  8. Bruzzone, R., Barbe, M. T., Jakob, N. J., Monyer, H. Pharmacological properties of homomeric and heteromeric pannexin hemichannels expressed in Xenopus oocytes. J. Neurochem. 92, 1033-1043 (2005).
  9. Ebihara, L., Steiner, E. Properties of a nonjunctional current expressed from a rat connexin46 cDNA in Xenopus oocytes. J. Gen. Physiol. 102, 59-74 (1993).
  10. Evans, W. H., De Vuyst, E., Leybaert, L. The gap junction cellular internet: connexin hemichannels enter the signalling limelight. Biochem. J. 397, 1-14 (2006).
  11. Leybaert, L., Sanderson, M. J. Intercellular Ca2+ waves: mechanisms and function. Physiol. Rev. 92, 1359-1392 (2012).
  12. Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intracellular Ca2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
  13. Himpens, B., Stalmans, P., Gomez, P., Malfait, M., Vereecke, J. Intra- and intercellular Ca2+ signaling in retinal pigment epithelial cells during mechanical stimulation. Faseb J. 13, 63-68 (1999).
  14. Williams, K. K., Watsky, M. A. Bicarbonate promotes dye coupling in the epithelium and endothelium of the rabbit cornea. Curr. Eye Res. 28, 109-120 (2004).
  15. Hernandez Galindo, E. E., Theiss, C., Steuhl, K. P., Meller, D. Gap junctional communication in microinjected human limbal and peripheral corneal epithelial cells cultured on intact amniotic membrane. Exp Eye Res. 76, 303-314 (2003).
  16. Williams, K., Watsky, M. Gap junctional communication in the human corneal endothelium and epithelium. Curr. Eye Res. 25, 29-36 (2002).
  17. Anderson, S. C., Stone, C., Tkach, L., SundarRaj, N. Rho and Rho-kinase (ROCK) signaling in adherens and gap junction assembly in corneal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43, 978-986 (2002).
  18. Joyce, N. C., Harris, D. L., Zieske, J. D. Mitotic inhibition of corneal endothelium in neonatal rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39, 2572-2583 (1998).
  19. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Trinkaus-Randall, V. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  20. Klepeis, V. E., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randall, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. J. Cell Sci. 114, 4185-4195 (2001).
  21. Laux-Fenton, W. T., Donaldson, P. J., Kistler, J., Green, C. R. Connexin expression patterns in the rat cornea: molecular evidence for communication compartments. Cornea. 22, 457-464 (2003).
  22. Rae, J. L., Lewno, A. W., Cooper, K., Gates, P. Dye and electrical coupling between cells of the rabbit corneal endothelium. Curr. Eye Res. 8, 859-869 (1989).
  23. Watsky, M. A., Rae, J. L. Dye coupling in the corneal endothelium: effects of ouabain and extracellular calcium removal. Cell Tissue Res. 269, 57-63 (1992).
  24. Williams, K. K., Watsky, M. A. Dye spread through gap junctions in the corneal epithelium of the rabbit. Curr. Eye Res. 16, 445-452 (1997).
  25. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Thrombin inhibits intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells by modulation of hemichannels and gap junctions. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 120-133 (2007).
  26. D'hondt, C., Ponsaerts, R., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Reduced intercellular communication and altered morphology of bovine corneal endothelial cells with prolonged time in cell culture. Curr. Eye Res. 34, 454-465 (2009).
  27. D'hondt, C., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Adenosine Opposes Thrombin-Induced Inhibition of Intercellular Calcium Wave in Corneal Endothelial Cells. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 1518-1527 (2007).
  28. Gomes, P., Srinivas, S. P., Van Driessche, W., Vereecke, J., Himpens, B. ATP release through connexin hemichannels in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 1208-1218 (2005).
  29. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. ATP-dependent paracrine intercellular communication in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46, 104-113 (2005).
  30. Gomes, P., Srinivas, S. P., Vereecke, J., Himpens, B. Gap junctional intercellular communication in bovine corneal endothelial cells. Exp Eye Res. , (2006).
  31. Ponsaerts, R., et al. The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 4816-4827 (2008).
  32. Ponsaerts, R., et al. RhoA GTPase Switch Controls Cx43-Hemichannel Activity through the Contractile System. PLoS ONE. 7, e42074(2012).
  33. Ponsaerts, R., et al. Intramolecular loop/tail interactions are essential for connexin 43-hemichannel activity. Faseb J. 24, 4378-4395 (2010).
  34. Charles, A. Reaching out beyond the synapse: glial intercellular waves coordinate metabolism. Sci STKE. 2005, pe6(2005).
  35. Laird, D. W. Life cycle of connexins in health and disease. Biochem. J. 394, 527-543 (2006).
  36. Kelsell, D. P., Dunlop, J., Hodgins, M. B. Human diseases: clues to cracking the connexin code. Trends Cell Biol. 11, 2-6 (2001).
  37. Pearson, R. A., Dale, N., Llaudet, E., Mobbs, P. ATP released via gap junction hemichannels from the pigment epithelium regulates neural retinal progenitor proliferation. Neuron. 46, 731-744 (2005).
  38. Klepeis, V. E., Weinger, I., Kaczmarek, E., Randall, V. T. P2Y receptors play a critical role in epithelial cell communication and migration. J. Cell Biochem. 93, 1115-1133 (2004).
  39. Cotrina, M. L., Lin, J. H., Lopez-Garcia, J. C., Naus, C. C., Nedergaard, M. ATP-mediated glia signaling. J. Neurosci. 20, 2835-2844 (2000).
  40. Burnstock, G., Williams, M. P2 purinergic receptors: modulation of cell function and therapeutic potential. J. Pharmacol. Exp. Ther. 295, 862-869 (2000).
  41. Schwiebert, E. M., Zsembery, A. Extracellular ATP as a signaling molecule for epithelial cells. Biochim. Biophys Acta. 1615, 7-32 (2003).
  42. Lazarowski, E. R., Boucher, R. C., Harden, T. K. Mechanisms of release of nucleotides and integration of their action as P2X- and P2Y-receptor activating molecules. Mol. Pharmacol. 64, 785-795 (2003).
  43. Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol. 265, C577-C606 (1993).
  44. Blair, S. A., Kane, S. V., Clayburgh, D. R., Turner, J. R. Epithelial myosin light chain kinase expression and activity are upregulated in inflammatory bowel disease. Lab. Invest. 86, 191-201 (2006).
  45. Boudreault, F., Grygorczyk, R. Cell swelling-induced ATP release and gadolinium-sensitive channels. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C219-C226 (2002).
  46. Romanov, R. A., Rogachevskaja, O. A., Khokhlov, A. A., Kolesnikov, S. S. Voltage dependence of ATP secretion in mammalian taste cells. J. Gen. Physiol. 132, 731-744 (2008).
  47. Pelegrin, P., Surprenant, A. Pannexin-1 mediates large pore formation and interleukin-1beta release by the ATP-gated P2X7 receptor. Embo J. 25, 5071-5082 (2006).
  48. Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272, 735-738 (1996).
  49. D'hondt, C., et al. Pannexin channels in ATP release and beyond: an unexpected rendezvous at the endoplasmic reticulum. Cell Signal. 23, 305-316 (2011).
  50. Leybaert, L., et al. Connexin channels, connexin mimetic peptides and ATP release. Cell Commun. Adhes. 10, 251-257 (2003).
  51. Stout, C. E., Costantin, J. L., Naus, C. C., Charles, A. C. Intercellular calcium signaling in astrocytes via ATP release through connexin hemichannels. J. Biol. Chem. 277, 10482-10488 (2002).
  52. Verma, V., Hallett, M. B., Leybaert, L., Martin, P. E., Howard Evans, W. Perturbing plasma membrane hemichannels attenuates calcium signalling in cardiac cells and HeLa cells expressing connexins. Eur. J. Cell Biol. , (2008).
  53. Pharmacol, B. rJ. 147, S172-S181 (2006).
  54. Slakey, L. L., Gordon, E. L., Pearson, J. D. A comparison of ectonucleotidase activities on vascular endothelial and smooth muscle cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 603, 366-378 (1990).
  55. Gordon, E. L., Pearson, J. D., Slakey, L. L. The hydrolysis of extracellular adenine nucleotides by cultured endothelial cells from pig aorta. Feed-forward inhibition of adenosine production at the cell surface. J. Biol. Chem. 261, 15496-15507 (1986).
  56. Moerenhout, M., Himpens, B., Vereecke, J. Intercellular communication upon mechanical stimulation of CPAE- endothelial cells is mediated by nucleotides. Cell Calcium. 29, 125-136 (2001).
  57. Ralevic, V., Burnstock, G. Receptors for purines and pyrimidines. Pharmacol. Rev. 50, 413-492 (1998).
  58. Edelhauser, H. F. The resiliency of the corneal endothelium to refractive and intraocular surgery. Cornea. 19, 263-273 (2000).
  59. George, A. J., Larkin, D. F. Corneal transplantation: the forgotten graft. Am. J. Transplant. 4, 678-685 (2004).
  60. Hong, S. J., Wu, K. Y., Wang, H. Z., Fong, J. C. Change of cytosolic Ca2+ mobility in cultured bovine corneal endothelial cells by endothelin-1. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 19, 1-9 (2003).
  61. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Histamine H1 receptor-mediated Ca2+ signaling in cultured bovine corneal endothelial cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 33, 3041-3049 (1992).
  62. Crawford, K. M., MacCallum, D. K., Ernst, S. A. Agonist-induced Ca2+ mobilization in cultured bovine and human corneal endothelial cells. Curr. Eye Res. 12, 303-311 (1993).
  63. Srinivas, S. P., Yeh, J. C., Ong, A., Bonanno, J. A. Ca2+ mobilization in bovine corneal endothelial cells by P2 purinergic receptors. Curr. Eye Res. 17, 994-1004 (1998).
  64. Satpathy, M., Gallagher, P., Jin, Y., Srinivas, S. P. Extracellular ATP opposes thrombin-induced myosin light chain phosphorylation and loss of barrier integrity in corneal endothelial cells. Exp Eye Res. 81, 183-192 (2005).
  65. Srinivas, S. P., et al. Cell volume response to hyposmotic shock and elevated cAMP in bovine trabecular meshwork cells. Exp. Eye Res. 78, 15-26 (2004).
  66. D'hondt, C., Ponsaerts, R., De Smedt, H., Bultynck, G., Himpens, B. Pannexins, distant relatives of the connexin family with specific cellular functions. Bioessays. 31, 953-974 (2009).
  67. Boitano, S., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular propagation of calcium waves mediated by inositol trisphosphate. Science. 258, 292-295 (1992).
  68. De Vuyst, E., et al. Intracellular calcium changes trigger connexin 32 hemichannel opening. EMBO J. 25, 34-44 (2006).
  69. De Vuyst, E., et al. Ca2+ regulation of connexin 43 hemichannels in C6 glioma and glial cells. Cell Calcium. 46, 176-187 (2009).
  70. Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium waves propagate through radial glial cells and modulate proliferation in the developing neocortex. Neuron. 43, 647-661 (2004).
  71. Iyer, S., Deutsch, K., Yan, X., Lin, B. Batch RNAi selector: a standalone program to predict specific siRNA candidates in batches with enhanced sensitivity. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 85, 203-209 (2007).
  72. Stehberg, J., et al. Release of gliotransmitters through astroglial connexin 43 hemichannels is necessary for fear memory consolidation in the basolateral amygdala. Faseb J. 26, 3649-3657 (2012).
  73. Evans, W. H., Bultynck, G., Leybaert, L. Erratum to: Manipulating Connexin Communication Channels: Use of Peptidomimetics and the Translational Outputs. J. Membr. Biol. 245, 451(2012).
  74. Majumder, P., et al. ATP-mediated cell-cell signaling in the organ of Corti: the role of connexin channels. Purinergic Signal. 6, 167-187 (2010).
  75. Carvalho, A. C., et al. affects intracellular Ca2+ stores and induces Ca2+ wave propagation. Cell Death Differ. 11, 1265-1276 (2004).
  76. Torres, A., et al. Extracellular Ca2+ acts as a mediator of communication from neurons to glia. Sci. Signal. 5, ra8(2012).
  77. Decrock, E., et al. Transfer of IP(3) through gap junctions is critical, but not sufficient, for the spread of apoptosis. Cell Death Differ. 19 (3), 947-957 (2012).
  78. Beltramello, M., Piazza, V., Bukauskas, F. F., Pozzan, T., Mammano, F. Impaired permeability to Ins(1,4,5)P3 in a mutant connexin underlies recessive hereditary deafness. Nat. Cell Biol. 7 (1,4,5), 63-69 (2005).
  79. Bukauskas, F. F., Bukauskiene, A., Verselis, V. K. Conductance and permeability of the residual state of connexin43 gap junction channels. J. Gen. Physiol. 119, 171-186 (2002).
  80. Bukauskas, F. F., Verselis, V. K. Gap junction channel gating. Biochim. Biophys. Acta. 1662, 42-60 (2004).
  81. Dahl, G. Where are the gates in gap junction channels? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23, 1047-1052 (1996).
  82. Retamal, M. A., Schalper, K. A., Shoji, K. F., Bennett, M. V., Saez, J. C. Opening of connexin 43 hemichannels is increased by lowering intracellular redox potential. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8322-8327 (2007).
  83. Shibayama, J., et al. Effect of charge substitutions at residue his-142 on voltage gating of connexin43 channels. Biophys. J. 91, 4054-4063 (2006).
  84. Desplantez, T., Verma, V., Leybaert, L., Evans, W. H., Weingart, R. Gap26, a connexin mimetic peptide, inhibits currents carried by connexin43 hemichannels and gap junction channels. Pharmacological Research: The Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 65, 546-552 (2012).
  85. Delmar, M. Gap junctions as active signaling molecules for synchronous cardiac function. J. Cardiovasc. Electrophysiol. 11, 118-120 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kana y po cze szczelinowychaktywno hemikana wmikroskopia konfokalnaadowanie Fluo4 AMstymulacja mikromanipulatorempomiar uwalniania ATPanaliza izoform koneksyn

Powiązane artykuły