Pierwotna hodowla komórkowa jest użyteczną techniką do analizy określonych populacji komórek, szczególnie z transgenicznych zarodków myszy w określonych stadiach rozwoju. W tym przypadku komory embrionalne są preparowane i dysocjowane, a kulki sprzężone z przeciwciałami rozpoznają i oddzielają komórki śródbłonka do dalszej analizy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Hodowla komórkowa znacznie zwiększyła naszą zdolność do oceny poszczególnych populacji komórek w niezliczonych warunkach hodowli. Podczas gdy unieśmiertelnione linie komórkowe oferują znaczące korzyści ze względu na łatwość użycia, te linie komórkowe są niedostępne dla wszystkich potencjalnych typów komórek. Izolując komórki pierwotne z określonego regionu zainteresowania, w szczególności od myszy transgenicznej, można przeprowadzić bardziej zniuansowane badania. Podstawowa technika polega na rozbiorze narządu lub części narządu będącego przedmiotem zainteresowania (np. serca lub określonego obszaru serca) i dysocjacji narządu na pojedyncze komórki. Komórki te są następnie inkubowane z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z przeciwciałem, które rozpoznaje typ komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Interesujące komórki można następnie wyizolować za pomocą magnesu, z krótką inkubacją trypsyny oddzielającą komórki od kulek. Te izolowane komórki mogą być następnie hodowane i analizowane zgodnie z potrzebami. Technika ta została pierwotnie zaprojektowana dla dorosłych narządów myszy, ale można ją łatwo zmniejszyć do użytku z narządami embrionalnymi, jak pokazano tutaj. Ponieważ interesuje nas rozwijające się naczynia wieńcowe, chcieliśmy zbadać tę populację komórek w określonych stadiach embrionalnych. W związku z tym pierwotny protokół musiał zostać zmodyfikowany, aby był zgodny z małymi rozmiarami komór embrionalnych i niską potencjalną wydajnością komórek śródbłonka na tych etapach rozwoju. Wykorzystując to zmniejszone podejście, oceniliśmy przebudowę splotu wieńcowego w transgenicznych embrionalnych komórkach śródbłonka komór.
Wprowadzenie
Pojawienie się nieśmiertelnych linii komórkowych zrewolucjonizowało podstawową biologię komórki1. Obecnie dostępne linie komórkowe pochodzą z szerokiej gamy narządów i obejmują wszystkie główne typy komórek. Jednak ustalone linie komórkowe mają pewne ograniczenia. Proces nieśmiertelności oczywiście zmienia zachowanie komórek, szczególnie w odniesieniu do długości życia i proliferacji, ale może również wpływać na ekspresję nieoczekiwanych białek, takich jak białka cytoszkieletu 2. Ponadto, chociaż dostępnych jest wiele różnych linii komórkowych, istnieje znaczna różnorodność nawet wśród jednego typu komórek w całym organizmie. W szczególności komórki śródbłonka wykazują różne zachowania w zależności od tego, czy wyściełają tętnice czy żyły i jaki rodzaj przepływu jest obecny w naczyniu 3. Jeszcze bardziej palące z punktu widzenia rozwoju jest jednak to, że zdecydowana większość dostępnych linii komórkowych pochodzi z tkanek dorosłych (patrz np. kolekcja dostępna za pośrednictwem ATCC). Te dorosłe linie komórkowe prawdopodobnie nie oddają dynamicznej natury swoich embrionalnych prekursorów. Szybko zmieniające się czasoprzestrzenne wzorce ekspresji genów obserwowane podczas rozwoju sugerują również, że komórka śródbłonka z jednego narządu na danym etapie rozwoju może nie zachowywać się tak samo, jak komórka śródbłonka z tego samego narządu na innym etapie rozwoju.
Jako alternatywa dla korzystania z komercyjnie dostępnych nieśmiertelnych linii komórkowych, komórki pierwotne mogą być izolowane z konkretnej tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Jedną z zalet tej techniki jest to, że te pierwotne komórki można wyizolować z określonego narządu lub nawet części narządu na dowolnym określonym etapie rozwoju. Co więcej, te pierwotne komórki można wyizolować z szerokiej gamy dostępnych zwierząt transgenicznych, co pozwala na badanie in vitro nokautu genów i knock-in, unikając jednocześnie innych problemów, takich jak wydajność transfekcji. Nic dziwnego, że opublikowano wiele technik szczegółowo opisujących, jak izolować określone typy komórek 4,5. Ogólnie rzecz biorąc, techniki te obejmują zbieranie obszaru zainteresowania, dysocjację komórek, oznaczanie określonego typu komórek zainteresowania i izolowanie tych komórek do dalszej analizy.
Aby zbadać wczesną populację embrionalną komórek śródbłonka wieńcowego, zmniejszyliśmy wcześniej opublikowaną technikę4 do użycia z mniejszym organem. Dzięki tej zmniejszonej procedurze możemy wyizolować komórki śródbłonka naczyń wieńcowych z serca embrionalnego w określonych stadiach embrionalnych. Komórki te można następnie wykorzystać w tradycyjnych testach śródbłonka, takich jak analizy migracji. Dopóki wczesne linie komórkowe embrionalne nie staną się bardziej rozpowszechnione, praca z komórkami pierwotnymi jest nieocenioną techniką.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotuj koraliki sprzężone z przeciwciałami
- Na jeden dzień przed sekcją należy połączyć wybrane przeciwciało z odpowiednimi Dynabeads (np. szczurzymi IgG Dynabeads dla przeciwciała wyhodowanego u szczura, 4 x 108 kulek/ml) zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku szczurzego przeciwciała anty-CD31 BD (0,5 μg/μl, stosowanego do izolacji komórek śródbłonka) dodaje się 3 μl przeciwciała na każde 25 μl kulek, dla końcowego stężenia 1,5 μg przeciwciała anty-CD31 i 1 x 10 7 kulek/25 μl buforu.
- Kulki i przeciwciała inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Przygotowanie płytki kolagenowej
- Izolowane komórki tworzą kanaliki szybciej, gdy rosną na żelu kolagenowym, a nie tylko na płytce pokrytej kolagenem. Dlatego żele kolagenowe są wytwarzane w noc poprzedzającą sekcję, jak opisano w punkcie 6. Na lodzie w kapturze do hodowli tkankowej połącz następujące odczynniki (wystarczają na 19 dołków): 206,4 μl sterylnego H2O, 140,4 μl kolagenu typu I (4,08 mg / ml), 38,4 μl 10x M199 i 1,15 μl 5 M NaOH.
- Odpipetować 20 μl tego żelu kolagenowego do studzienek 384-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C na 30 minut.
- Dodać 80 μl DMEM do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Usunąć pożywkę hodowlaną i powtórzyć jeszcze dwa razy.
- Po ostatnim płukaniu dodać 80 μl 10% FBS/DMEM do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Przed dodaniem wyizolowanych komórek usunąć pożywkę hodowlaną.
3. Wyciąć i strawić serce
- Poddaj eutanazji mysz w ciąży w wybranym dniu embrionalnym przy użyciu zatwierdzonej techniki eutanazji. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Karoliny Północnej w Chapel Hill.
- Trzymając mysz w pozycji leżącej, obficie spryskaj brzuszną stronę samicy 70% etanolem przed sekcją. Używając kleszczy do uniesienia skóry i mięśni dolnej części brzucha z dala od narządów wewnętrznych, rozetnij dolną jamę brzuszną kobiety, aby uwidocznić narządy wewnętrzne.
- Trzymając szyjkę macicy kleszczami, ostrożnie przyciąć ogon do kleszczy i zacząć podnosić róg macicy z jamy brzusznej. Podnosząc róg macicy, odetnij tkankę łączną, która utrzymuje róg na miejscu. Aby zakończyć wycinanie rogu macicy, przetnij połączenie rogu macicy z jajowodem, aby uwolnić róg macicy.
- Umieść róg macicy na szalce Petriego zawierającej zimną sól fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS) i spłucz w razie potrzeby. Rozetnij róg macicy przez linię środkową, aby odsłonić przyczepione woreczki embrionalne.
- Rozciąć worek embrionalny na styku łożyska i zarodka, aby uniknąć przypadkowego przecięcia zarodka i pobrania zarodka. Umieść zarodek na drugiej szalce Petriego z zimnym PBS. Umieść szalkę Petriego z rogiem macicy z lodem.
- Odetnij głowę zarodka, aby poprawić dostęp do ściany klatki piersiowej. Jeśli konieczne jest genotypowanie, odetnij ogon, aby go usunąć i zapisz w probówce Eppendorfa umieszczonej na lodzie.
- Trzymając zarodek na plecach, rozetnij ścianę klatki piersiowej, aby uwidocznić serce i płuca. Aby uniknąć przecięcia serca, wykonaj pionowe cięcie wzdłuż boku klatki piersiowej, w pobliżu kończyny przedniej, a następnie poziome cięcie w poprzek dolnej części żeber; Następnie delikatnie pociągnij ścianę klatki piersiowej do góry i usuń ją z drogi. Do około 13,5 dnia embrionalnego ściana klatki piersiowej jest przezroczysta, co pomaga w wizualizacji.
- Ostrożnie podnieś serce za pomocą kleszczy i przetnij naczynia poniżej. Następnie przetnij nad wielkimi naczyniami, aby uwolnić serce. Jeśli naczynia płucne nie zostaną przecięte, płuca mogą zostać usunięte wraz z sercem. W ten sposób usuń obce tkanki, takie jak płuca, jeśli to konieczne.
- Oddziel i odrzuć przedsionki i wielkie naczynia od komór. Za pomocą nożyczek zmielić komory na małe kawałki (około 1 mm3) i umieścić w około 500 μl kolagenazy (1 mg/ml w sterylnym PBS). Próbki należy przechowywać na lodzie, aż wszystkie komory zostaną zmielone i umieszczone w kolagenazie.
- Powtarzaj poprzednie kroki, aż komory zostaną wycięte ze wszystkich zarodków, zbierając każde serce do oddzielnej probówki Eppendorfa. Jeśli wszystkie zarodki mają ten sam genotyp, serca mogą być zebrane w jednej probówce Eppendorfa. Liczba próbek przetwarzanych jednorazowo może być ograniczona w zależności od magnesu używanego do izolacji; zastosowany tutaj DynaMag (123-21D) mieści maksymalnie 16 probówek Eppendorf.
- Ułożyć rozdrobnione komory w temperaturze 37 °C z kołysaniem przez 45 min. Co 15 minut delikatnie wyjmuj próbki i pipetuj w górę i w dół, aby mechanicznie dysocjować komórki.
4. Izolacja komórek śródbłonka
- Przepuść roztwór kolagenazy komorowej przez filtr 70 μm, aby usunąć pozostałe grudki komórek.
- Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut. Odrzucić supernatant, zastąpić około 200 μl 10% FBS w DMEM i pipetować w górę i w dół, aby oddzielić komórki.
- Powtórz poprzedni krok raz. Odwirować komórki przy 400 x g przez 10 minut po drugim 10% płukaniu FBS/DMEM. Ponownie zawiesić komórki w 50 μl 10% FBS/DMEM.
- Podczas ostatniego etapu wirowania przygotuj kulki.
- Umieść probówkę Eppendorfa zawierającą przeciwciało i kulki na magnesie na 1 minutę.
- Gdy rurka jest umieszczona na magnesie, usuń supernatant. Wyjmij rurkę z magnesu i dodaj około 100 μl 10% FBS/DMEM.
- Umieść probówkę na magnesie na 1 minutę. Usuń supernatant i ponownie przemyj 10% FBS/DMEM. Powtórz w sumie 3 prania.
- Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić kulki sprzężone z przeciwciałami w 10% FBS/DMEM (5 μl na próbkę).
- Do każdej próbki komórki dodaj 5 μl kulek sprzężonych z przeciwciałami. Umieścić zawiesiny komórek perełkowych w temperaturze 4 °C z kołysaniem przez 30 minut.
- W okapie z przepływem laminarnym umieść probówki Eppendorfa zawierające komórki i kulki sprzężone z przeciwciałami na magnesie na 1 minutę. Usuń supernatant, wyjmij probówki z magnesu i przemyj około 100 μl 10% FBS/DMEM. Powtórz dla 5 prań.
- Po ostatnim praniu umieść probówki na magnesie na 1 minutę, usuń supernatant i wyjmij rurki z magnesu. Dodać około 100 μl DMEM.
- Umieść probówki na magnesie na 1 minutę, usuń supernatant i wyjmij rurki z magnesu. Dodaj 100-200 μl podgrzanej 0,25% trypsyny-EDTA. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 5 minut.
- Umieść probówki na magnesie na 2 minuty. Ostrożnie przenieś supernatant zawierający komórki do świeżych probówek Eppendorfa. Wirować przez 5 minut przy 400 x g.
- Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej o objętości 80-100 μl i umieścić na płytce w naczyniu hodowlanym poddanym działaniu 96 lub 384 dołków, w zależności od oczekiwanej wydajności (około 450-600 komórek z komór zarodków E14,5-E16,5). W przypadku komórek śródbłonka należy użyć pożywki do hodowli wzrostu śródbłonka (zdefiniowanej poniżej).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przy użyciu przeciwciała specyficznego dla śródbłonka rozpoznającego CD31 wyizolowano komórki śródbłonka z komór przybrzusznymi zarodków w dniach embrionalnych (E) 13,5 (Ryc. 1A) i 18,5 (Ryc. 1B-1D). Podczas hodowli na nieprzetraktowanej płytce hodowlanej komórki te pozostają okrągłe i tworzyłyby wzór brukowany w stanie bliskim konfluencji (Ryc. 1A). Do pokrycia dołków stosowano również rozcieńczony kolagen; choć komórki śródbłonka przylegają do niego (Ryc. 1B
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Praca z pierwotnymi komórkami embrionalnymi pozwala na przeprowadzanie nowatorskich eksperymentów w celu zbadania krytycznych etapów rozwoju in vitro . Procedura izolacji nie jest jednak trywialna. Kluczowe kroki izolowania dowolnego rodzaju komórek obejmują upewnienie się, że komórki są dobrze oddzielone po trawieniu kolagenazy, a następnie, że są dobrze zawieszone podczas etapów mycia. Mechaniczna sekcja przez pipetowanie znacznie pomaga oddzielić komórki na etapie kolagenazy, a etap filtrowania usuwa grudki...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Andrei Portbury za krytyczne przeczytanie manuskryptu, Laboratorium Serwisowemu Mikroskopu UNC za pomoc w obrazowaniu poklatkowym oraz NIH (grant # R01HL061656) za wsparcie finansowe.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| myszy w ciąży | Do przeprowadzenia na etapie embrionalnym będącym przedmiotem zainteresowania | ||
| Anty-mysie CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Kolagenaza, typ I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka | (wykonana w laboratorium, jak opisano w notatkach) | DMEM zawierający 20% FBS, 5 i mu; M β-mercapt– Tanol, 50 μ g/ml EKG i 1x penicylina/streptomycyna | |
| β-mercapt– tanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| EKG | Technologie biomedyczne, Inc. | BT-203 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-dołkowa płytka hodowlana | Greiner | T-3037-6 | Płytka została przygotowana z cienkim żelem kolagenowym, zgodnie z opisem w 6; powierzchnia robocza 10 mm2 |
| Kolagen typu I | BD | 354236 | Stosować w momencie końcowym stężenie 1,5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Używany zgodnie z zaleceniami w 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Mikroskop stereoskopowy | Nikon | SMZ645 | |
| Inkubator kultur komórkowych | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Wirówka stołowa | Thermo | 75002430 |
Bibliografia
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
