Biosensor do wykrywania bakterii gronkowca opornego na antybiotyki

Summary

Biosensory fagów litycznych i kulki przeciwciał są w stanie odróżnić oporne na metycylinę (MRSA) od wrażliwych bakterii gronkowca. Fagi unieruchomiono metodą Langmuira-Blodgetta na powierzchni czujnika mikrowagi kryształu kwarcu i działały jako sondy gronkowca o szerokim zakresie. Kulki przeciwciał rozpoznają MRSA.

Abstract

Strukturalnie przekształcony bakteriofag lityczny z szerokim zakresem gospodarzy szczepów Staphylococcus aureus i przeciwciałem wiążącym penicylinę (PBP 2a) sprzężone kulki lateksowe zostały wykorzystane do stworzenia biosensora zaprojektowanego do dyskryminacji gatunków S. aureus opornych na metycylinę (MRSA) i wrażliwych (MSSA) ^1,2. Fagi lityczne zostały przekształcone w sferoidy fagowe przez kontakt z granicą faz woda-chloroform. Monowarstwy sferoidów fagów zostały przeniesione na powierzchnię biosensora za pomocą techniki Langmuira-Blodgetta (LB) ³. Stworzone biosensory zostały przebadane za pomocą mikrowagi kwarcowej ze śledzeniem dyssypacji (QCM-D) w celu oceny interakcji bakteria-. Interakcje bakteria-sferoidy doprowadziły do zmniejszenia częstotliwości rezonansu i wzrostu energii rozpraszania zarówno dla szczepów MRSA, jak i MSSA. Po związaniu się z bakteriami, czujniki te zostały poddane dalszej ekspozycji na kulki lateksowe przeciwciała wiążącego penicylinę. Czujniki analizowane za pomocą MRSA reagowały na kulki przeciwciała PBP 2a; chociaż czujniki sprawdzone przez MSSA nie dały żadnej odpowiedzi. To eksperymentalne rozróżnienie określa jednoznaczne rozróżnienie między szczepami S. aureus opornymi na metycylinę i wrażliwymi. Jednakowo związane i niezwiązane bakteriofagi hamują rozwój bakterii na powierzchniach i w zawiesinach wodnych. Gdy fagi lityczne zostaną przekształcone w sferoidy, zachowują swoją silną aktywność lityczną i wykazują wysoką zdolność wychwytywania bakterii. Fagi i sferoidy fagowe mogą być wykorzystywane do testowania i sterylizacji mikroorganizmów opornych na antybiotyki. Inne zastosowania mogą obejmować zastosowanie w terapii bakteriofagowej i powierzchniach przeciwdrobnoustrojowych.

Introduction

Szczepy Staphylococcus aureus oporne na metycylinę zostały zasugerowane jako czynnik niezbędnych infekcji i epidemii szpitalnych ^4-8. Powszechne sposoby rozpoznawania oporności na metycylinę, takie jak test przesiewowy oksacyliny oksacyliny z dyfuzją krążkową lub mikrorozcieńczenie bulionu, opierają się na dostosowanych warunkach hodowli w celu zwiększenia ekspresji oporności. Zmiany obejmują wykorzystanie oksacyliny, inkubację w temperaturze 30 lub 35 °C zamiast 37 °C oraz włączenie NaCl do pożywki wzrostowej. Ponadto, w celu prawidłowego wykrycia za pomocą tego typu technik, wymagany jest długi okres inkubacji wynoszący 24 godziny zamiast 16 do 18 godzin. Szybkie techniki o odpowiednim (>96%) poziomie czułości do identyfikacji oporności na metycylinę obejmują zautomatyzowane techniki mikrorozcieńczania, takie jak karta Vitek GPS-SA, system Rapid ATB Staph i system Rapid Microscan Panel, które dają wyniki po 3-11 godzinach ^9-11. System Crystal MRSA ID jest szybką metodą opartą na rozpoznaniu wzrostu S. aureus w obecności 2% NaCl i 4 mg oksacyliny na litr za pomocą czułego na tlen czujnika fluorescencji. Deklarowana czułość waha się od 91 do 100% po 4 godzinach inkubacji ^12-14. Te metody fenotypowe są ograniczone pod względem dokładności ze względu na wpływ dominujących szczepów, które wyrażają niejednorodną oporność. Dlatego najlepszą powszechnie akceptowaną metodą rozpoznawania oporności na metycylinę jest PCR lub hybrydyzacja DNA genu mecA ¹⁵. Jednak ta technika wymaga oczyszczonego DNA i jest niezwykle wrażliwa na różne domieszki (zanieczyszczenia), w tym szczątki komórkowe¹⁶.

Ponadto, te techniki wymagają dużo czasu, aby je wykonać. Strategie rozpoznawania produktu genu mecA, białka PBP 2a, mogą być wykorzystane do określenia oporności i mogą być bardziej wiarygodne w porównaniu ze standardowymi technikami testowymi ¹⁷.

Wcześniej pokazano, że bakteriofag 12600 może być używany jako sonda rozpoznawcza dla szczepów Staphylococcus aureus, w tym tych o oporności na metycylinę ^1,2,18. W niniejszej pracy zaproponowaliśmy nowatorską technikę specyficznego rozpoznawania i wykrywania MRSA, taką jak rozpoznawanie bakterii wraz z konformacją MRSA w czasie rzeczywistym. W tym konkretnym celu wykorzystano bakteriofaga S. aureus o szerokim spektrum gospodarzy (w tym szczepy MRSA) w połączeniu z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko białku (PBP 2a). PBP 2a jest białkiem ściany komórkowej i jest przyczyną oporności MRSA na antybiotyki. Jednak przeciwciało PBP 2a nie jest swoiste dla S. aureus, ponieważ niektóre inne bakterie mają białka wiążące antybiotyki o sekwencji podobnej do PBP 2a ^19,20. W związku z tym w niniejszej pracy wykorzystano bakteriofaga S. aureus i przeciwciała przeciwko białku PBP 2a. Aby móc opracować bioczujnik do specyficznego wykrywania i identyfikowania MRSA, wykorzystano urządzenie z dwuetapowym działaniem. W pierwszym etapie wykorzystano monowarstwę bakteriofaga S. aureus jako sondę czujnika, podczas gdy w drugim etapie wykorzystano przeciwciała specyficzne dla PBP 2a. Dlatego krok pierwszy pozwoli rozpoznać bakterię S. aureus, ponieważ drugi będzie wrażliwy na białko wiążące antybiotyki. Gdy sygnały odbierane z dwóch etapów są dodatnie, oznacza to specyficzne wykrycie MRSA.

Protocol

1. Przygotowanie sceny

1. Uzyskać szczep typu S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 i Bacillus subtilis ATCC 6051. Oporne na metycylinę szczepy S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; lityczny 12600.
2. Otrzymać kulki lateksowe sprzężone z przeciwciałem PBP 2a.
3. Przygotuj pożywkę NZY zgodnie z opisem ²¹.
4. Otrzymać buforowany fosforanem roztwór soli fizjologicznej (PBS).
5. Przygotuj wodę dejonizowaną jako podfazę do osadzania monowarstwowego Langmuira-Blodgetta (LB).

2. Rozprzestrzenianie się i miareczkowanie bakteriofagów

1. Inkubować 5 ml nocnej kultury S. aureus ATCC 12600 (3,6 x 10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml) z 500 μl faga (3 x 10⁹ PFU/ml) w 500 ml pożywki NZY w 2 litrach flack na wytrząsarce-inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc.
2. Odwirować kulturę w temperaturze 4,424 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
3. Ponownie odwirowany supernatant w temperaturze 11,325 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Przefiltrować supernatant przez filtr miliporowy 0,22 μm.
5. Odwirować filtrat o stężeniu 75 395 x g przez 1,5 godziny.
6. Rozpuść osad w 100 μl wody destylowanej.
7. Przygotować 10-krotne rozcieńczenia zawiesiny fagowej w pożywce NZY.
8. Umieść 1 ml nocnej (ON) hodowli S. aureus ATCC 12600 na każdej z 2 płytek z agarem NZY, aby upewnić się, że cała powierzchnia jest pokryta. Usuń nadmiar kultury i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na 30 minut.
9. Pobrać próbkę (10 μl) o odpowiednim rozcieńczeniu fagowym na powierzchni płytki i inkubować w temperaturze 37 ^°C przez 18–24 godziny.
10. Zbadaj tworzenie się blaszek miażdżycowych i oblicz miano faga. Miana bakteriofagów (T) szacuje się na podstawie liczby blaszek (N) utworzonych na 10 μl objętości (v) zawiesiny fagowej i współczynnika rozcieńczenia (F). Miano obliczono według wzoru: T=N/(vxF). Na przykład dla liczby blaszek 75 w rozcieńczeniu ^10-7 i objętości 10 μl (10 x ^10-3 ml) miano jest równe 75 / (10 x ^10-3 x ^10-7) = 7,5 x^{10 10} jednostek tworzących płytkę (PFU) na ml zawiesiny.

3. unieruchomiony złotem

1. Oczyść pokryte złotem kawałki kwarcu (60 mm²) przez wytrawianie plazmowe w argonie przez 10 minut, a następnie sterylizuj przez 6 godzin w świetle UV w sterylnej szafce.
2. Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny fagowej 1 x 10⁹ PFU/ml do złotej powierzchni każdego kawałka na sterylnej szalce Petriego, a następnie inkubować przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
3. Usunąć pozostałą zawiesinę fagową i określić jej miano.
4. Umyj kawałki związanym fagiem 5 razy za pomocą PBS, aby usunąć niezwiązany.

4. Badanie zakaźności unieruchomionych fagów na suchej powierzchni

1. Rozprowadzić kulturę O/N S. aureus ATCC 12600 na płytce agarowej NZY i pozostawić do wyschnięcia.
2. Umieść kawałek złota z unieruchomionym fagiem na płytce zadrukowaną do dołu.
3. Po 12 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C należy obserwować strefę lizy, która wskazuje na zakaźność.
4. Używaj kawałków pokrytych złotem bez fagów w eksperymentach kontrolnych.

5. Badanie aktywności litycznej wolnego i związanego faga w cieczy

1. Dodać kulturę ON S. aureus ATCC 12600 do 10 ml NZY do każdej z czterech kolb bocznych o pojemności 300 ml (6 x 10⁶ jtk/ml w każdej kolbie).
2. Dodać w dwóch kolbach 2 x 10⁶ PFU/ml wolnego faga.
3. Użyj pozostałych dwóch kolb jako elementów sterujących.
4. Monitorować przebieg w czasie lizy komórek S. aureus przez 570 minut za pomocą pomiaru gęstości optycznej (OD₆₀₀) w odstępach 30-minutowych dla wszystkich kolb.
5. Wykonaj pomiar końcowy po 24 godzinach.
6. Powtórz kroki 5.1-5.5, ale użyj kawałków złota ze związanymi fagami zamiast wolnych fagów oraz kawałków złota bez faga w kolbach kontrolnych.

6. Utrata związanych fagów podczas inkubacji

1. Dodać 50 μl faga 1 x 10⁹ PFU/ml na powierzchnię sterylnego kawałka złota na szalce Petriego, którą umieszcza się na noc w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.
2. Usunąć zawiesinę z niezwiązanym fagiem ze złotej powierzchni i miana.
3. Przemyć kawałek złota związanym fagiem 5 razy za pomocą PBS i umieścić w 1 ml roztworu NZY w 15 ml probówce w shakerze-inkubatorze w temperaturze 37 °C na 8 godzin.
4. Określić miano oderwanego faga zgodnie z opisem w pkt 2.

7. Przygotowanie sferoidów fagowych

1. Łącząc 400 μl zawiesiny faga podstawowego 12600 (10¹¹ PFU/ml) z równą objętością chloroformu spektrofotometrycznego w 1 ml fiolce w temperaturze pokojowej.
2. Delikatnie zmieszaj zawiesinę faga-chloroformu 5-6 razy (w odstępach 5 sekund) w ciągu jednej minuty.
3. Pozostawiono zawiesinę do ustabilizowania się przez 30 sekund, a następnie pipetowano pipetę górnej fazy zawierającej sferoidy w celu przygotowania jednowarstwowego.
4. Weź kilka mikrolitrów zawiesiny sferoid do transmisji i skaningowej mikroskopii elektronowej.
5. Użyj pozostałej zawiesiny sferoidalnej do produkcji bioczujników.

8. Przygotowanie biosensora

1. Wyczyść czujniki QCM-D przez wytrawianie plazmowe w argonie przez 10 minut Czyścicielka plazmowa PDC-32G Harrick.
2. Przepłucz czujnik heksanem, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia organiczne.
3. Przygotować i oczyścić koryto z pozostałej warstwy folii zgodnie z opisem w ^{pkt 22}.
4. Napełnić koryto LB roztworem podfazowym i oczyścić je barierą korytową i ustabilizować koryto w temperaturze 20±0,1 °C
5. Rozprowadzić 300 μl podwielokrotności faga 12600 w zawiesinie wodnej (10¹¹ PFU/ml) na podfazę LB.
6. Przygotować monowarstwę fagową na roztworze podfazy LB, pozwalając, aby 300 μl podwielokrotności wodnej zawiesiny faga 12600 (10¹¹ PFU/ml) spłynęło po nachylonym szklanym prętze zwilżalnym, który jest częściowo zanurzony w podfazie ^22,23.
7. Przygotować monowarstwę ustabilizować przez 10 min, a następnie ścisnąć ją z prędkością 30 mm/min (45 cm²/min), aż do osiągnięcia stałego ciśnienia 19 N/m.
8. Wykonaj pionowe osadzanie folii na prostopadle ustawionym czujniku QCM-D z prędkością 4.5 mm/min, kolejno zanurzając czujnik w monowarstwie siedem razy. Mikroskopia elektronowa zdeponowanych monowarstw fagów przed ekspozycją na próbki bakteryjne wykazała, że warstwy były ciągłe, jednorodne i jednolite (dane nie pokazane).
9. Powtórzyć kroki 4.5-4.8 z zawiesiną sferoidalną faga, która jest przygotowana w 3.
10. Użyj sfabrykowanych bioczujników fagowych do wykrywania MRSA, mikroskopii elektronowej i elipsometrii.

9. Testowanie biosensorów, dyskryminacja opornych na metycylinę i wrażliwych bakterii gronkowca

1. W tym protokole przygotowywane są biosensory z niezmodyfikowanymi i zmodyfikowanymi fagami i sferoidami fagowymi. Mikrowaga kwarcowa z czterema komorami przepływowymi czujnika służy do monitorowania wiązania bakterii z fagiem unieruchomionym na powierzchni czujnika QCM. Kulki lateksowe sprzężone z przeciwciałem PBP 2a są wykorzystywane do rozróżniania między opornymi na metycylinę (MRSA) a wrażliwymi bakteriami gronkowca. Wszystkie pomiary prowadzone są w trybie przepływowym (50 μl/min) przy częstotliwości 5 MHz.
2. Ustal podstawową częstotliwość rezonansową czujnika QCM w wodzie (~30 min).
3. Narysować zawiesinę żywych komórek bakteryjnych gronkowca wrażliwego na metycylinę w wodzie (^10-9 jtk/ml) przez komórkę badaną.
4. Stale monitoruj zmiany częstotliwości rezonansowej czujników i rozpraszania energii dla pierwszego alikwotu, korzystając z oprogramowania Q-Soft.
5. Gdy zmiany częstotliwości rezonansowej i rozproszenia czujników osiągną poziomy nasycenia, dodaj zawiesinę kulek lateksowych sprzężonych z przeciwciałem PBP (6,77^{x10 10} kulek / ml) do przepływu podczas ciągłego monitorowania częstotliwości i rozpraszania.
6. Powtórz kroki 9.2-9.5 dla komórek bakteryjnych gronkowca opornego na metycylinę (MRSA).
7. Zdefiniuj zmianę częstotliwości poprzez zmianę masy spowodowaną wiązaniem bakterii za pomocą równania Sauerbreya ^24,25 Δf = -Δm xn/C, gdzie C jest stałą czułości masy (C = 17,7 ng x ^cm-2 x ^Hz-1 przy 5 MHz), m jest masą, a n jest liczbą alikwotową (n = 1).
8. Zdefiniuj zmianę rozpraszania energii (ΔD) z zapisu wykładniczego zaniku oscylacji (tłumienie częstotliwości i amplitudy, co pozwoliło na ilościowe określenie energii rozproszonej i zmagazynowanej w jednym okresie oscylacji, E_rozproszone i E_{zmagazynowane}, odpowiednio: ΔD = E_rozproszone / 2πE_{zmagazynowane}. ΔD mierzy się w jednostkach rozproszenia (DU), jeden DU = ^10-6 jednostek względnych).

Results

wykazał aktywność lityczną przeciwko wszystkim testowanym szczepom S. aureus, w tym szczepom MRSA, jak wykazał test plamkowy faga. Rozmiary blaszek nazębnych wahały się na ogół od 5 do 15 mm. Nie stwierdzono żadnej aktywności w stosunku do innych badanych kultur (Tabela 1).

Normalny wzrost S. aureus ATCC 12600 w pożywce NZY na wytrząsarce-inkubatorze w temperaturze 37 °C jest pokazany na rysunku 1A (krzywa oznaczona pustymi kółkami). Liczba b...

Discussion

Powszechnie wiadomo, że fagi mogą być wykorzystywane jako sondy biosensoryczne dla patogenów bakteryjnych ²⁸. W tej pracy wykazano, że wraz z przeciwciałami PBP 2a może być wykorzystany do rozwiązania starego problemu: szybkiej dyskryminacji szczepów opornych na antybiotyki i wrażliwych.

Stwierdzono jednak, że te normalne, niezmodyfikowane fagi gronkowcowe nie nadają się do wykrywania bakterii za pomocą urządzeń QCM, mimo że wiążą bakterie. Ogon faga jest tak długi, że fale akustycz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
odczynniki
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
chloroform spektrofotometryczny	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	99,8% S.A.)
Heksan-bezwodny	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Alkohol etylowy	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a skoniugowane kulki lateksowe z przeciwciałem	Denka Seiken Co., Ltd, Tokio, Japonia	Test
przesiewowy MRSAS. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 i Bacillus subtilis ATCC 6051 z	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; lityczny 12600	Kolekcja kultur Uniwersytetu Auburn, Auburn, AL
Wirówka	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Wirówka
KSV 2200 LB balans folii	KSV Chemicals, Finlandia
System optyczny mikroskopu	świetlnego CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Vä stra Frö lunda, Szwecja	E4
Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μ m, Membranowa
miska do biotestów	NUNC A/S, Dania	240835	Wymiary (mm), 245 x 245 x 25
Pipety	Gilson, Pipetman, Francja	Wytrząsarka inkubatora P100, P200, P1000
C24	Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Kawałki kwarcu pokryte złotem	Uniwersytet Auburn, AL		Domowe
szalki	PetriegoFisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Kolby do uprawy kultur	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Kolby Erlenmeyera
Spektrometr optyczny	Genesys 20. Thermo Spectronic, Stany Zjednoczone.	4001
Myjka plazmowa	Harrick Plasma, Stany Zjednoczone	PDC-32G
System oczyszczania wody	Millipore	Direct-Q
	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Oprogramowanie	Q-Sense AB, Szwecja	QSoft, QTools