Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Podsumowanie

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Streszczenie

Właściwości mechaniczne komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w różnicowaniu komórek macierzystych, tworzeniu nowotworów i gojeniu się ran. Zmiany sztywności komórek i ECM są często oznakami zmian w fizjologii komórek lub chorób tkanek. W związku z tym sztywność komórek jest wskaźnikiem służącym do oceny stanu kultur komórkowych. Wśród wielu metod stosowanych do pomiaru sztywności komórek i tkanek, mikrowgłębienie za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) zapewnia sposób na wiarygodny pomiar sztywności żywych komórek. Metoda ta jest szeroko stosowana do charakteryzowania sztywności w skali mikro dla różnych materiałów, od powierzchni metalowych po miękkie tkanki biologiczne i komórki. Podstawową zasadą tej metody jest wcięcie komórki z końcówką AFM o wybranej geometrii i zmierzenie przyłożonej siły od zgięcia wspornika AFM. Dopasowanie krzywej siła-wgniecenie do modelu Hertz dla odpowiedniej geometrii końcówki może dać ilościowe pomiary sztywności materiału. W artykule przedstawiono procedurę charakteryzowania sztywności żywych komórek za pomocą AFM. Przedstawiono kluczowe kroki, w tym proces kalibracji AFM, akwizycję krzywej siły i analizę danych przy użyciu procedury MATLAB. Omówiono również ograniczenia tej metody.

Wprowadzenie

Właściwości mechaniczne, zwłaszcza sztywność, pojedynczych komórek i otaczających je macierzy zewnątrzkomórkowych (ECM) są kluczowe dla wielu procesów biologicznych, w tym wzrostu komórek, ruchliwości, podziału, różnicowania i homeostazy tkanek. ¹ Wykazano, że sztywność mechaniczna komórki zależy głównie od cytoszkieletu, a zwłaszcza sieci aktyny i włókien pośrednich oraz innych białek z nimi związanych. ² Wyniki testów mechanicznych sieci in vitro filamentów aktynowych i pośrednich sugerują, że mechanika komórki jest w dużej mierze zależna od struktury cytoszkieletu i naprężenia wstępnego w cytoszkielecie. ^3-5 Sztywność żywych komórek jest następnie traktowana jako wskaźnik do oceny struktury cytoszkieletu⁶, aktywności miozyny⁷ i wielu innych procesów komórkowych. Co ważniejsze, często okazuje się, że zmiany właściwości mechanicznych komórek są ściśle związane z różnymi stanami chorobowymi, takimi jak powstawanie guzów i przerzuty. ^8-10 Monitorowanie sztywności mechanicznej żywych komórek może zatem zapewnić nowy sposób monitorowania fizjologii komórek; wykrywanie i diagnozowanie chorób⁸ ; oraz do oceny skuteczności leczenia farmakologicznego. ^{Pytania z dnia 11,12}

Wiele metod, w tym mikroreologia śledzenia cząstek, ^13-16 magnetyczna cytometria ^{skręcająca,17} aspiracja mikropipet^18,19 i mikroindentacja^20-22 zostały opracowane do pomiaru elastyczności komórek. Mikroreologia śledzenia cząstek śledzi drgania termiczne submikronowych cząstek fluorescencyjnych wstrzykiwanych do komórek lub markerów odniesienia wewnątrz cytoszkieletu komórki. ²³ Właściwości sprężyste i lepkie komórek oblicza się na podstawie zmierzonych przemieszczeń cząstek za pomocą twierdzenia o fluktuacji-dyssypacji. ^14,23 Metoda ta pozwala na jednoczesne pomiary lokalnych właściwości mechanicznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną w różnych miejscach komórki. Jednak wstrzykiwanie cząstek fluorescencyjnych do komórek może prowadzić do zmian w funkcji komórki, strukturze cytoszkieletu, a tym samym w mechanice komórki. Metoda aspiracji mikropipet polega na zastosowaniu podciśnienia w mikropipecie o średnicy od 1 do 5 μm w celu zassania małego kawałka błony komórkowej do pipety. Sztywność komórki oblicza się na podstawie przyłożonego podciśnienia i deformacji błony komórkowej. ¹⁸ Metoda ta nie jest jednak w stanie wykryć niejednorodnego rozkładu sztywności w komórce. Magnetyczna cytometria skręcająca (MTC) wykorzystuje pole magnetyczne do generowania momentu obrotowego na super paramagnetycznych kulkach przymocowanych do błony komórkowej. ¹⁷ Sztywność komórki określa się w tej metodzie na podstawie zależności między przyłożonym momentem obrotowym a odkształceniem skrętnym błony komórkowej. Trudno jest kontrolować położenie kulek magnetycznych w metodzie MTC, a także trudno jest scharakteryzować odkształcenie skręcania z wysoką rozdzielczością. Mikrowgłębienie polega na zastosowaniu wgłębnika o dobrze zdefiniowanej geometrii, który wbija się w komórkę. Siła wcięcia i wynikające z niej wgłębienie w komórkach często są zgodne z przewidywaniami modelu Hertza. Moduły komórek Younga można obliczyć na podstawie krzywych siła-wgłębienie, dopasowując je do modelu Hertza. Metoda ta jest szeroko stosowana do badania właściwości mechanicznych tkanek i komórek pomimo jej ograniczeń, takich jak niepewność w określaniu punktu kontaktu, możliwość zastosowania modelu Hertz i możliwość fizycznego uszkodzenia komórek. Wśród wielu urządzeń do mikrowgłębień²⁰, mikroskop sił atomowych (AFM) jest dostępny na rynku i jest szeroko stosowany do charakteryzowania właściwości mechanicznych żywych komórek i tkanek^21,24-27.

Ten artykuł demonstruje procedurę korzystania z AFM Asylum MFP3D-Bio do scharakteryzowania mechaniki komórek. AFM nie tylko zapewnia topografię komórek w wysokiej rozdzielczości, ale jest również szeroko stosowany do charakteryzowania właściwości mechanicznych komórek tkankowych. Zasada wcięcia AFM jest zilustrowana na rysunku 1. Wspornik AFM zbliża się do komórki z wysokości kilku mikrometrów; nawiązuje kontakt z komórką; wcina komórkę w taki sposób, że ugięcie wspornika osiąga wstępnie wybraną wartość zadaną; i odsuwa się od komórki. Podczas tego procesu ugięcie wspornika jest rejestrowane jako funkcja jego położenia, jak pokazano na rysunku 1. Przed zetknięciem się z ogniwem wspornik porusza się w ośrodku bez widocznego ugięcia. Podczas wciskania w ogniwo, wspornik wygina się, a sygnał ugięcia wzrasta. Wsporniki są modelowane jako belki sprężyste, dzięki czemu ich ugięcie jest proporcjonalne do siły przyłożonej do ogniwa. Ustawiając maksymalne ugięcie wspornika, maksymalna siła przyłożona do próbki jest ograniczona, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Część krzywej siły od punktu b do punktu c na rysunku 1, w której końcówka wcina się w komórkę, jest dopasowana do modelu herców w celu wyodrębnienia sztywności komórki.

Rysunek 1. Ilustracja mikrowgłębienia AFM i interpretacja krzywej siły. Górny panel pokazuje ruch wspornika AFM napędzanego przez skaner piezoelektryczny. Pionowe położenie wspornika z i sygnał ugięcia wspornika d są rejestrowane podczas procesu. Wspornik zaczyna się od punktu a, kilka mikrometrów nad komórką. Zbliżając się do komórki, δ wgłębienia próbki pozostaje zerowa, dopóki nie dotrze do punktu b, w którym końcówka styka się z celą. Współrzędne punktu b na wykresie są wartościami krytycznymi dla analizy danych, oznaczonymi przez (z₀, d₀). Od b do c wspornik wcina się w komórkę, aż ugięcie wspornika osiągnie wartość zadaną, która jest ustawiona jako stosunek docelowej maksymalnej siły wcięcia do stałej sprężystości wspornika. Gdy sygnał odchylenia osiągnie ustawioną wartość maksymalną, wspornik jest następnie wycofywany z komórki do punktu d, gdzie często jest ciągnięty w dół z powodu przylegania końcówki do próbki, odłącza się od ogniwa i powraca do swojego początkowego położenia w punkcie e. Prawy panel ilustruje zależność między wcięciem a zarejestrowanym sygnałem z i d. W lewym dolnym panelu znajduje się wykres reprezentatywnej krzywej siły, maksymalne wcięcie wspornika, dla którego mierzona jest stała sprężystości wynosząca 0,07 N / m, jest ustawione na 17 nm, tak że maksymalna siła wcięcia przyłożona do próbki wynosi 1,2 nN. Zaznaczone są kluczowe miejsca podczas wcięcia.

Protokół

1. Kalibracja stałej sprężystości wspornika

1. Załaduj wspornik do AFM zgodnie z instrukcjami producenta. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek eksperymentów konieczne jest oczyszczenie uchwytu wspornikowego etanolem. Pomoże to ograniczyć zanieczyszczenie bakteryjne hodowli podczas pomiarów AFM.
2. Kalibracja InvOLS (Inverse Optical Lever Sensitivity). Ten parametr opisuje wielkość odpowiedzi fotodiody (woltów) na nanometr ugięcia wspornika.
3. Załaduj czyste szkło szkiełkowe na stolik na próbkę, a następnie zainstaluj głowicę AFM i wyreguluj wiązkę laserową i wyrównanie zgodnie z instrukcjami producenta. Zamocuj końcówkę AFM na szklanym szkiełku.
4. Po wyjęciu piezoelektrycznego ustaw lustro na odczyt fotodiody -2 V. Wykonaj pomiar spektroskopii sił z punktem spustowym (maksymalna odpowiedź fotodiody) +2 V.
5. Po wyjęciu piezoelektrycznego ustaw lustro na odczyt fotodiody -2 V. Wykonaj pomiar spektroskopii sił z punktem spustowym (maksymalna odpowiedź fotodiody) +2 V. Uwaga: Wartości napięcia w tym miejscu są specyficzne dla AFM Azylu. Wartość tę należy ustawić zgodnie ze specyfikacją dostarczoną przez manufacturer.
   Po zakończeniu zbierania danych powiększ obszar twardego kontaktu krzywej siły. Wykonaj dopasowanie liniowe do tego obszaru, aby znaleźć nachylenie, które będzie w V/nm. Odwrotność tej wartości opisuje czułość optyczną zespołu wspornikowo-fotodiodowego.
6. Zresetować ustawienie lusterka do swobodnego odchylenia 0 V.
7. Skalibruj stałą sprężystości wspornikowej. Do określenia stałej sprężystości wspornika ²⁸ stosuje się metodę strojenia termicznego.
8. Po skalibrowaniu InvOLS podnieś skaner z dala od stolika na próbkę, tak aby nie było interakcji między końcówką a próbką.
9. Rozpocznij rejestrowanie danych termicznych. Podczas tego procesu rejestrowane są drgania termiczne belki wspornikowej. Oprogramowanie AFM analizuje widmo mocy takich drgań termicznych i wykreśla je w oknie danych.
10. Po kilku sekundach od zebrania danych wykonaj dopasowanie do segmentu danych wyśrodkowanego na szczycie najniższej częstotliwości (rezonansu podstawowego), aby określić stałą sprężystości.

2. Ładowanie próbki

1. Zamontuj akcesorium do podgrzewacza do naczyń na AFM stage, jeśli nie jest jeszcze na wyposażeniu.
2. Ustaw temperaturę na 37 °C i odczekaj 20 minut, aż system osiągnie stabilną równowagę termiczną.
3. Umieść naczynie hodowlane na AFM stage i zabezpiecz je za pomocą clamp dostarczony z podgrzewaczem do naczyń. Ważne jest, aby zminimalizować czas między wyjęciem szalki z inkubatora a umieszczeniem jej na stoliku, aby uniknąć urazu komórek. W przypadku pomiarów dłuższych niż 30 minut należy użyć pożywki niezależnej od CO₂ w celu zastąpienia normalnej pożywki hodowlanej.
4. Nałóż niewielką kroplę pożywki hodowlanej o temperaturze 37 °C na końcówkę wspornika AFM i opuść głowicę AFM, aż końcówka zostanie zanurzona w płynie.
5. Korzystając z kamery CCD z widokiem z góry, wyrównaj wiązkę laserową na wsporniku (wyrównanie w cieczy będzie inne niż w powietrzu, ze względu na zmianę współczynnika załamania światła).
6. Załóż końcówkę AFM na czysty obszar naczynia hodowlanego.
7. Przeprowadzić kalibrację InvOLS zgodnie z powyższym opisem, pod kątem czułości wspornika w środowisku ciekłym.

Uwaga: a) Jeżeli komórki są hodowane na hydrożelach, kalibrację InvOLS należy przeprowadzić z wyprzedzeniem na dolnej powierzchni naczynia hodowlanego wypełnionego pożywką do hodowli komórkowych. Podczas przełączania na próbki komórek należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie zmieniać ustawienia wiązki laserowej z wspornikiem. b) InvOLS musi być ponownie kalibrowany za każdym razem, gdy następuje zmiana w ustawieniu lasera. c) Zaleca się również przyjęcie InvOLS jako średniej wartości z kilku krzywych kalibracyjnych, ponieważ każda kalibracja generuje inny InvOLS. Różnica w InvOLS jest jednak niewielka w porównaniu z wartością średnią. Na przykład 100-krotna kalibracja wspornika Bruker DNP-10 ze stałą sprężystości 0,06 N/m w cieczy daje średnią wartość InvOLS wynoszącą 66,3 nm/V, przy odchyleniu standardowym wynoszącym zaledwie 0,5 nm/V.

3. Zbieranie krzywych siły wcięć komórek

1. Zaznacz komórkę, w której chcesz dodać wcięcie. Za pomocą mikroskopu optycznego przesuń stolik, aby ustawić wspornik nad komórką tak, aby końcówka znajdowała się w obszarze okołojądrowym. Precyzyjną regulację położenia wspornika można uzyskać poprzez zastosowanie przesunięć do skanerów X i Y.
   nuta: Wspornik AFM musi zostać wycofany z powierzchni próbki podczas przesuwania stolika próbki w celu wybrania komórki docelowej. Chroni to wspornik przed wbijaniem się w próbkę, ponieważ powierzchnia próbki może nie być płaska.
2. Przełącz na tryb spektroskopii sił. Ustaw szybkość wgłębienia w zakresie 1-10 μm/s, wystarczająco niską, aby uniknąć efektów hydrodynamicznych.
3. Ustaw punkt wyzwalania odchylenia, który ogranicza maksymalną siłę wcięcia, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Wybierz opcję Wyzwalanie względne, która skoryguje wszelkie odchylenia sygnału odchylenia. Maksymalna siła 2 nN jest dobrym punktem wyjścia dla większości próbek. Wartość tę należy jednak dostosować do sztywności próbki. W przypadku próbek miękkich należy stosować niższą wartość, aby uniknąć nadmiernego wgniecenia próbki. W przypadku próbek sztywnych należy użyć wysokiej wartości w celu wygenerowania mierzalnego wcięcia.
4. Ustaw odległość siły na tyle dużą, aby upewnić się, że końcówka zostanie całkowicie odłączona od ogniwa między pomiarami siły. Zwykle odległość siły jest ustawiona na 5 μm.
5. Wydaj polecenie AFM, aby wykonał pojedynczą krzywą siły.
6. Zbierz co najmniej trzy krzywe siły w różnych miejscach w obszarze okołojądrowym każdej komórki. Chociaż korzystne jest wykonanie wielu krzywych na każdej komórce w celu uzyskania wiarygodnych danych statystycznych, przyjęcie zbyt wielu krzywych siły może prowadzić do zmian sztywności komórki z powodu naprężeń spowodowanych przez sondę AFM.
7. Po zakończeniu zbierania danych wyjmij końcówkę i powtórz kroki 3.1-3.6 dla tylu komórek, ile potrzeba, aby uzyskać dobre dane statystyczne dotyczące sztywności komórek w określonych warunkach próbki. Zwykle dla każdego stanu mierzy się 30 komórek.

Aby scharakteryzować rozkład sztywności w pojedynczej komórce, stosuje się tryb mapy sił. W trybie mapy sił ustaw rozmiar skanowania tak, aby obejmował obszar zainteresowania; ustawić odpowiednią rozdzielczość; ustawić parametry wcięcia jako wybrane dla krzywych pojedynczej siły; AFM następnie zrastruje w zdefiniowanym obszarze próbki i utworzy pojedyncze krzywe siły dla każdego piksela w obszarze próbki.

4. Analiza danych

Zarejestrowane krzywe siły są analizowane przy użyciu niestandardowej procedury MATLAB do obliczania sztywności komórki. Poniżej znajduje się krótki opis procedury MATLAB:

1. Program MATLAB identyfikuje współrzędne punktu kontaktowego z0 i d0 (patrz rysunek 1) za pomocą algorytmu zaczerpniętego z opublikowanej metody przez Lina i wsp. ²⁹:
2. Dla każdego punktu danych na krzywej siły wykonaj liniowe dopasowanie danych na lewo od punktu zainteresowania i dopasowanie modelu Hertz po prawej stronie (używając wybranego punktu jako początkowego punktu kontaktu), aż do ustawionego maksymalnego wcięcia (zalecane 200-300 nm).
3. Dla każdego punktu oblicz względny błąd RMS obu pasowań i zsumuj te wartości.
4. Punkt, który osiąga minimalny całkowity błąd dopasowania, jest wybierany jako początkowy punkt styczności.
   nuta: Czas obliczeń można skrócić, wdrażając wyszukiwanie złotego przekroju, a nie liniowo skanując całą krzywą siły.
5. Odkształcenie próbki δ i siła wgniecenia F są obliczane jako:
   
6. Dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów jest stosowane w celu dopasowania danych F w stosunku do δ w obszarze po kontakcie, z ≥ z₀ , do modelu Hertz w celu wyodrębnienia modułu Younga, E komórki:
   
   , gdzie v jest współczynnikiem Poissona.
   nuta: Gdy δ jest większa niż 10% grubości próbki (wysokości komórki), na zmierzoną sztywność komórki ma wpływ sztywność podłoża. Grubość obszaru okołojądrowego jest zwykle rzędu kilku mikrometrów. Dlatego tylko pierwsze 200-300 nm krzywej F-δ jest dopasowane do modelu Hertz.

Wyniki

Rysunek 2a pokazuje trzy reprezentatywne krzywe siły pobrane z fibroblastów 3T3 hodowanych na powierzchni plastiku, żelu poliakrylamidowego o modułach Younga odpowiednio 3,000 Pa i 17,000 Pa. Po dokładnym zidentyfikowaniu punktów styku na krzywych, siła wcięcia w funkcji deformacji komórki jest wykreślana na rysunku 2b. Pod wpływem siły mniejszej niż 0,3 nN końcówka w kształcie piramidy wcina się na 3 mikrometry w komórkę hodowaną na żelu poliakrylamidowym o natężeniu 3 kPa. Natomiast si...

Dyskusja

Metoda wgłębiania AFM ma zalety w charakterystyce właściwości mechanicznych żywych komórek. Chociaż jest mniej czuły niż magnetyczna cytometria skręcająca i pęseta optyczna, które mogą mierzyć siły na poziomie pikonewtonu³², AFM może wykryć siłę oporu od próbek od dziesiątek pikoniutonów do setek nanoniutonów, porównywalną z zakresem siły, którą można przyłożyć do komórek za pomocą mikropipety¹⁹. Ten zakres siły odpowiada potrzebom tworzenia mierzalnych deformacji we wszystkich typach komórek^19...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop sił atomowych	Azyl badawczy	MFP3D-BIO