Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Podsumowanie

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Streszczenie

Właściwości mechaniczne komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w różnicowaniu komórek macierzystych, tworzeniu nowotworów i gojeniu się ran. Zmiany sztywności komórek i ECM są często oznakami zmian w fizjologii komórek lub chorób tkanek. W związku z tym sztywność komórek jest wskaźnikiem służącym do oceny stanu kultur komórkowych. Wśród wielu metod stosowanych do pomiaru sztywności komórek i tkanek, mikrowgłębienie za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) zapewnia sposób na wiarygodny pomiar sztywności żywych komórek. Metoda ta jest szeroko stosowana do charakteryzowania sztywności w skali mikro dla różnych materiałów, od powierzchni metalowych po miękkie tkanki biologiczne i komórki. Podstawową zasadą tej metody jest wcięcie komórki z końcówką AFM o wybranej geometrii i zmierzenie przyłożonej siły od zgięcia wspornika AFM. Dopasowanie krzywej siła-wgniecenie do modelu Hertz dla odpowiedniej geometrii końcówki może dać ilościowe pomiary sztywności materiału. W artykule przedstawiono procedurę charakteryzowania sztywności żywych komórek za pomocą AFM. Przedstawiono kluczowe kroki, w tym proces kalibracji AFM, akwizycję krzywej siły i analizę danych przy użyciu procedury MATLAB. Omówiono również ograniczenia tej metody.

Wprowadzenie

Właściwości mechaniczne, a w szczególności sztywność poszczególnych komórek oraz otaczających je macierzy zewnątrzkomórkowych (ECM), mają kluczowe znaczenie dla wielu procesów biologicznych, w tym dla wzrostu, ruchliwości, podziału i różnicowania komórek oraz homeostazy tkankowej.¹ Wykazano, że sztywność mechaniczna komórek jest determinowana głównie przez cytoszkielet, zwłaszcza przez sieci aktyny, filamenty pośrednie oraz inne białka z nimi powiązane.² Wyniki testów mechanicznych przeprowadzonych na sieciach aktyny i filamentów pośrednich in vitro sugerują, że mechanika komórkowa w dużym stopniu zależy od struktury cytoszkieletu oraz n....

Protokół

1. Kalibracja stałej sprężystości wspornika

1. Załaduj wspornik do AFM zgodnie z instrukcjami producenta. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów konieczne jest oczyszczenie uchwytu wspornika etanolem. Pomoże to ograniczyć kontaminację bakteriami kultury podczas pomiarów AFM.
2. skalibruj InvOLS (Inverse Optical Lever Sensitivity – odwrotna czułość optycznego dźwigniowego układu pomiarowego). Parametr ten opisuje odpowiedź fotodiody (w woltach) na nanometr ugięcia wspornika.
3. Umieść czyste szkiełko przedmiotowe na stoliku z próbką, następnie zainstaluj głowicę AFM i ustaw wiązkę lasera oraz wyrównanie zgodnie z instrukcjami producenta.....

Wyniki

Rysunek 2a przedstawia trzy reprezentatywne krzywe siły uzyskane z fibroblastów 3T3 hodowanych odpowiednio na powierzchni plastikowej oraz na żelach poliakrylamidowych o modułach Younga 3 000 Pa i 17 000 Pa. Po dokładnym zidentyfikowaniu punktów styku na krzywych, siła wciskania jako funkcja deformacji komórki została naniesiona na Rysunek 2b. Przy sile o wartości mniejszej niż 0,3 nN, końcówka o kształcie piramidy wnika na głębokość 3 micrometers do wnętrza komórki hodowanej na żelu pol.......

Dyskusja

Metoda wgłębiania AFM ma zalety w charakterystyce właściwości mechanicznych żywych komórek. Chociaż jest mniej czuły niż magnetyczna cytometria skręcająca i pęseta optyczna, które mogą mierzyć siły na poziomie pikonewtonu³², AFM może wykryć siłę oporu od próbek od dziesiątek pikoniutonów do setek nanoniutonów, porównywalną z zakresem siły, którą można przyłożyć do komórek za pomocą mikropipety¹⁹. Ten zakres siły odpowiada potrzebom tworzenia mierzalnych deformacji we wszystkich typach komórek^19.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop sił atomowych	Azyl badawczy	MFP3D-BIO