Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Podsumowanie

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Streszczenie

Właściwości mechaniczne komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odgrywają ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym w różnicowaniu komórek macierzystych, tworzeniu nowotworów i gojeniu się ran. Zmiany sztywności komórek i ECM są często oznakami zmian w fizjologii komórek lub chorób tkanek. W związku z tym sztywność komórek jest wskaźnikiem służącym do oceny stanu kultur komórkowych. Wśród wielu metod stosowanych do pomiaru sztywności komórek i tkanek, mikrowgłębienie za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) zapewnia sposób na wiarygodny pomiar sztywności żywych komórek. Metoda ta jest szeroko stosowana do charakteryzowania sztywności w skali mikro dla różnych materiałów, od powierzchni metalowych po miękkie tkanki biologiczne i komórki. Podstawową zasadą tej metody jest wcięcie komórki z końcówką AFM o wybranej geometrii i zmierzenie przyłożonej siły od zgięcia wspornika AFM. Dopasowanie krzywej siła-wgniecenie do modelu Hertz dla odpowiedniej geometrii końcówki może dać ilościowe pomiary sztywności materiału. W artykule przedstawiono procedurę charakteryzowania sztywności żywych komórek za pomocą AFM. Przedstawiono kluczowe kroki, w tym proces kalibracji AFM, akwizycję krzywej siły i analizę danych przy użyciu procedury MATLAB. Omówiono również ograniczenia tej metody.

Wprowadzenie

Właściwości mechaniczne, a w szczególności sztywność poszczególnych komórek oraz otaczających je macierzy zewnątrzkomórkowych (ECM), mają kluczowe znaczenie dla wielu procesów biologicznych, w tym dla wzrostu, ruchliwości, podziału i różnicowania komórek oraz homeostazy tkankowej.¹ Wykazano, że sztywność mechaniczna komórek jest determinowana głównie przez cytoszkielet, zwłaszcza przez sieci aktyny, filamenty pośrednie oraz inne białka z nimi powiązane.² Wyniki testów mechanicznych przeprowadzonych na sieciach aktyny i filamentów pośrednich in vitro sugerują, że mechanika komórkowa w dużym stopniu zależy od struktury cytoszkieletu oraz naprężeń wstępnych w cytoszkielecie.^3-5 Sztywność żywych komórek jest zatem uznawana za wskaźnik pozwalający ocenić strukturę cytoszkieletu⁶, aktywność miozyny⁷ oraz wiele innych procesów komórkowych. Co więcej, zmiany właściwości mechanicznych komórek często okazują się ściśle powiązane z różnymi stanami chorobowymi, takimi jak tworzenie się guzów i przerzuty.^8-10 Monitorowanie sztywności mechanicznej żywych komórek może zatem stanowić nową metodę monitorowania fizjologii komórki, wykrywania i diagnozowania chorób⁸ oraz oceny skuteczności leczenia farmakologicznego.^11,12

Opracowano wiele metod pomiaru elastyczności komórek, w tym mikrorheologię śledzenia cząstek,^13-16 magnetyczną cytometrię skrętnej,¹⁷ aspirację mikropipetą^18,19 oraz mikroindentację.^20-22 Mikrorheologia śledzenia cząstek polega na śledzeniu drgań termicznych wstrzykniętych do komórek fluorescencyjnych cząstek submikronowych lub znaczników referencyjnych wewnątrz cytoszkieletu komórkowego.²³ Właściwości sprężyste i lepkie komórek oblicza się z pomiarów przemieszczeń cząstek przy użyciu twierdzenia o fluktuacjach i dyssypacji.^14,23 Metoda ta umożliwia jednoczesny pomiar lokalnych właściwości mechanicznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną w różnych miejscach komórki. Jednakże wstrzykiwanie cząstek fluorescencyjnych do komórek może prowadzić do zmian w funkcjach komórkowych, strukturze cytoszkieletu, a w konsekwencji do zmiany mechaniki komórki. Metoda aspiracji mikropipetą polega na przyłożeniu podciśnienia w mikropipecie o średnicy od 1 do 5 μm, aby wciągnąć niewielki fragment błony komórkowej do wnętrza pipety. Sztywność komórki oblicza się na podstawie przyłożonego podciśnienia i deformacji błony komórkowej.¹⁸ Metoda ta nie pozwala jednak na wykrycie heterogenicznego rozkładu sztywności w obrębie komórki. Magnetyczna cytometria skrętna (MTC) wykorzystuje pole magnetyczne do wytworzenia momentu obrotowego na superparamagnetycznych kuleczkach przyczepionych do błony komórkowej.¹⁷ Sztywność komórki wyznacza się w tej metodzie z zależności między przyłożonym momentem obrotowym a deformacją skrętną błony komórkowej. W metodzie MTC trudno jest kontrolować lokalizację kuleczek magnetycznych, a wyzwanie stanowi również charakterystyka deformacji skrętnej z wysoką rozdzielczością. Mikroindentacja polega na wciskaniu w komórkę indentora o określonej geometrii. Siła wciskania i wynikająca z niej indentacja w komórkach często odpowiadają przewidywaniom modelu Hertza. Moduły Younga komórek można obliczyć z krzywych siła-indentacja poprzez dopasowanie ich do modelu Hertza. Metoda ta jest szeroko stosowana do badania właściwości mechanicznych tkanek i komórek, pomimo takich ograniczeń jak niepewność w określaniu punktu styku, stosowalność modelu Hertza oraz ryzyko fizycznego uszkodzenia komórek. Wśród wielu urządzeń do mikroindentacji²⁰, mikroskop sił atomowych (AFM) jest dostępny komercyjnie i jest powszechnie wykorzystywany do charakterystyki właściwości mechanicznych żywych komórek i tkanek^21,24-27.

Niniejsza praca prezentuje procedurę wykorzystania AFM Asylum MFP3D-Bio do charakterystyki mechaniki komórek. AFM nie tylko zapewnia topografię komórek o wysokiej rozdzielczości, ale jest również szeroko stosowany do charakterystyki właściwości mechanicznych komórek tkankowych. Zasada indentacji AFM została przedstawiona na Rysunku 1. Cantilever AFM zbliża się do komórki z odległości kilku mikrometrów; nawiązuje kontakt z komórką; wgniata komórkę tak, aby ugięcie cantilevera osiągnęło wcześniej wybrany punkt nastawy (set point); a następnie odsuwa się od komórki. Podczas tego procesu ugięcie cantilevera jest rejestrowane jako funkcja jego położenia, co pokazano na Rysunku 1. Przed nawiązaniem kontaktu z komórką cantilever porusza się w medium bez żadnego widocznego ugięcia. Podczas indentacji komórki cantilever ugina się, a sygnał ugięcia wzrasta. Cantilevery są modelowane jako belki sprężyste, dzięki czemu ich ugięcie jest proporcjonalne do siły przyłożonej do komórki. Poprzez ustawienie maksymalnego ugięcia cantilevera, maksymalna wartość siły przyłożonej do próbki jest ograniczona, aby uniknąć uszkodzenia komórek. Odcinek krzywej siły od punktu b do punktu c na Rysunku 1, w którym końcówka wgniata się w komórkę, jest dopasowywany do modelu Hertza w celu wyznaczenia sztywności komórki.

Rysunek 1. Ilustracja mikroindentacji AFM i interpretacja krzywej siły. Górny panel przedstawia ruch wspornika AFM sterowanego przez skaner piezoelektryczny. Podczas procesu rejestrowane są pionowa pozycja wspornika z oraz sygnał ugięcia wspornika d. Wspornik startuje z punktu a, kilku mikrometrów nad komórką. Podczas zbliżania się do komórki wgniecenie próbki δ pozostaje równe zeru, aż do osiągnięcia punktu b, w którym końcówka styka się z komórką. Współrzędne punktu b na wykresie są wartościami krytycznymi dla analizy danych, oznaczonymi jako (z₀, d₀>). Od punktu b do c wspornik wnika w komórkę, aż ugięcie wspornika osiągnie wartość zadaną, która jest określona jako stosunek docelowej maksymalnej siły wgniecenia do stałej sprężystości wspornika. Gdy sygnał ugięcia osiągnie zadaną wartość maksymalną, wspornik jest wycofywany z komórki do punktu d, w którym często jest przyciągany w dół z powodu adhezji końcówki do próbki, następnie odrywa się od komórki i powraca do położenia początkowego w punkcie e. Prawy panel ilustruje zależność między wgnieceniem a rejestrowanym sygnałem z i d . Na dolnym lewym panelu znajduje się wykres reprezentatywnej krzywej siły; maksymalne wgniecenie wspornika, którego zmierzona stała sprężystości wynosi 0,07N/m, zostało ustawione na 17 nm, tak aby maksymalna siła wgniecenia przyłożona do próbki wynosiła 1,2 nN. Zaznaczono kluczowe położenia podczas procesu indentacji.

Protokół

1. Kalibracja stałej sprężystości wspornika

1. Załaduj wspornik do AFM zgodnie z instrukcjami producenta. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów konieczne jest oczyszczenie uchwytu wspornika etanolem. Pomoże to ograniczyć kontaminację bakteriami kultury podczas pomiarów AFM.
2. skalibruj InvOLS (Inverse Optical Lever Sensitivity – odwrotna czułość optycznego dźwigniowego układu pomiarowego). Parametr ten opisuje odpowiedź fotodiody (w woltach) na nanometr ugięcia wspornika.
3. Umieść czyste szkiełko przedmiotowe na stoliku z próbką, następnie zainstaluj głowicę AFM i ustaw wiązkę lasera oraz wyrównanie zgodnie z instrukcjami producenta. Przystaw końcówkę AFM do szkiełka przedmiotowego.
4. Przy wycofanym piezoelektryku ponownie ustaw lustro tak, aby odczyt z fotodiody wynosił -2 V. Przeprowadź pomiar spektroskopii sił z punktem wyzwalającym (maksymalna odpowiedź fotodiody) wynoszącym +2 V.
5. Przy wycofanym piezoelektryku ponownie ustaw lustro tak, aby odczyt z fotodiody wynosił -2 V. Przeprowadź pomiar spektroskopii sił z punktem wyzwalającym (maksymalna odpowiedź fotodiody) wynoszącym +2 V. Uwaga: Wartości napięć podane tutaj są specyficzne dla AFM marki Asylum. Wartość ta powinna być ustawiona zgodnie ze specyfikacją dostarczoną przez producenta.
   Po zakończeniu akwizycji danych powiększ obszar kontaktu sztywnego na krzywej siły. Przeprowadź dopasowanie liniowe do tego obszaru, aby wyznaczyć nachylenie, które będzie wyrażone w V/nm. Odwrotność tej wartości opisuje czułość optyczną układu wspornik-fotodioda.
6. Zresetuj ustawienie lustra do ugięcia swobodnego wynoszącego 0 V.
7. Skalibruj stałą sprężystości wspornika. Do wyznaczenia stałej sprężystości wspornika stosowana jest metoda dostrojenia termicznego ²⁸.
8. Po skalibrowaniu InvOLS podnieś skaner nad stolik z próbką w taki sposób, aby nie występowały oddziaływania między końcówką a próbką.
9. Rozpocznij rejestrację danych termicznych. Podczas tego procesu rejestrowane są wibracje termiczne belki wspornika. Oprogramowanie AFM analizuje widmo mocy takich wibracji termicznych i wyświetla je w oknie danych.
10. Po kilku sekundach akwizycji danych wykonaj dopasowanie do segmentu danych skupionego wokół piku o najniższej częstotliwości (rezonans podstawowy), aby wyznaczyć stałą sprężystości.

2. Nakładanie próbki

1. Zainstaluj akcesorium w postaci podgrzewacza do szalek na stole AFM, jeśli nie jest on jeszcze zamontowany.
2. Ustaw temperaturę na 37 °C i odczekaj 20 min, aż system osiągnie stabilną równowagę termiczną.
3. Umieść szalkę hodowlaną na stole AFM i zabezpiecz ją za pomocą zacisku dołączonego do podgrzewacza. Ważne jest, aby zminimalizować czas między wyjęciem szalki z inkubatora a umieszczeniem jej na stole, aby uniknąć uszkodzenia komórek. W przypadku pomiarów trwających dłużej niż 30 min, w miejsce standardowej pożywki hodowlanej należy zastosować pożywkę niezależną od CO₂.
4. Nanieś małą kroplę pożywki hodowlanej o temperaturze 37 °C na wierzchołek dźwigara AFM i obniż głowicę AFM, aż wierzchołek zostanie zanurzony w cieczy.
5. Używając kamery CCD z widokiem z góry, ponownie ustaw wiązkę lasera na dźwigarze (ustawienie w cieczy będzie różnić się od ustawienia w powietrzu ze względu na zmianę współczynnika załamania światła ośrodka).
6. Przyłoż głowicę AFM do czystego obszaru szalki hodowlanej.
7. Przeprowadź kalibrację InvOLS zgodnie z powyższym opisem w celu określenia czułości dźwigara w środowisku ciekłym.

Uwaga: a) Jeśli komórki są hodowane na hydrożelach, kalibrację InvOLS należy przeprowadzić wcześniej względem dolnej powierzchni naczynia hodowlanego wypełnionego pożywką do hodowli komórkowej. Przy przejściu do próbek komórkowych należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie zmienić ustawienia wiązki lasera względem wspornika. b) InvOLS musi zostać ponownie skalibrowany przy każdej zmianie ustawienia lasera. c) Zaleca się również przyjmowanie wartości InvOLS jako średniej z kilku krzywych kalibracyjnych, ponieważ każda kalibracja generuje inną wartość InvOLS. Zmienność InvOLS jest jednak niewielka w porównaniu do wartości średniej. Na przykład 100-krotna kalibracja wspornika Bruker DNP-10 o stałej sprężystości 0,06 N/m w cieczy daje średnią wartość InvOLS wynoszącą 66,3 nm/V, przy odchyleniu standardowym wynoszącym zaledwie 0,5 nm/V.

3. Gromadzenie krzywych siły wklęśnięcia komórki

1. Wybierz komórkę do wcięcia. Za pomocą mikroskopu optycznego przesuń stolik tak, aby umieścić wspornik nad komórką w taki sposób, by końcówka znajdowała się w regionie okołojądrowym. Precyzyjna regulacja pozycji wspornika może być osiągnięta poprzez zastosowanie przesunięć (offsets) skanerów X i Y.
   Uwaga: Podczas przesuwania stolika z próbką w celu wyboru docelowej komórki, wspornik AFM musi zostać wycofany z powierzchni próbki. Zapobiega to uderzeniu wspornika w próbkę, ponieważ jej powierzchnia może nie być płaska.
2. Przełącz urządzenie w tryb spektroskopii sił (Force Spectroscopy). Ustaw szybkość wcięcia (Indentation rate) w zakresie 1-10 μm/sec, na tyle niską, aby uniknąć efektów hydrodynamicznych.
3. Ustaw punkt wyzwalania ugięcia (deflection trigger point), który ogranicza maksymalną siłę wcięcia w celu uniknięcia uszkodzenia komórek. Wybierz opcję wyzwalania względnego (Relative triggering), która skoryguje ewentualny dryft sygnału ugięcia. Maksymalna siła 2 nN jest dobrym punktem wyjścia dla większości próbek. Wartość ta powinna być jednak dostosowana do sztywności próbki. W przypadku próbek miękkich należy zastosować niższą wartość, aby uniknąć nadmiernego wcięcia w próbkę. W przypadku próbek sztywnych należy zastosować wyższą wartość, aby uzyskać mierzalne wcięcie.
4. Ustaw dystans siły na tyle duży, aby zapewnić całkowite oddzielenie końcówki od komórki pomiędzy pomiarami siły. Zazwyczaj dystans siły ustawia się na 5 μm.
5. Wydaj polecenie do AFM w celu wykonania pojedynczej krzywej siły.
6. Zbierz co najmniej trzy krzywe siły w różnych miejscach regionu okołojądrowego każdej komórki. Chociaż pobieranie wielu krzywych z każdej komórki jest korzystne dla uzyskania wiarygodnych danych statystycznych, wykonanie zbyt wielu pomiarów może prowadzić do zmian sztywności komórki z powodu stresu wywołanego przez sondę AFM.
7. Po zakończeniu zbierania danych wycofaj końcówkę i powtórz kroki 3.1-3.6 dla tak wielu komórek, jak jest to konieczne do uzyskania dobrych danych statystycznych dotyczących sztywności komórek w określonych warunkach próbki. Zazwyczaj mierzy się 30 komórek dla każdego stanu.

W celu charakterystyki rozkładu sztywności w obrębie pojedynczej komórki stosowany jest tryb mapowania sił (force-map). W trybie Force-map należy ustawić rozmiar skanowania obejmujący badany obszar, dobrać odpowiednią rozdzielczość oraz zdefiniować parametry wgłębienia analogicznie do tych wybranych dla pojedynczych krzywych siły; następnie AFM przeskanuje zdefiniowany obszar próbki, rejestrując pojedyncze krzywe siły dla każdego piksela w regionie próbki.

4. Analiza danych

Zarejestrowane krzywe siły są analizowane przy użyciu niestandardowej procedury w programie MATLAB w celu obliczenia sztywności komórki. Poniżej znajduje się krótki opis procedury MATLAB:

1. Program MATLAB identyfikuje współrzędne punktu styku z0 i d0 (patrz Rysunek 1) przy użyciu algorytmu przyjętego z opublikowanej metody Lin et al. ²⁹:
2. Dla każdego punktu danych na krzywej siły wykonuje się dopasowanie liniowe danych po lewej stronie punktu zainteresowania oraz dopasowanie do modelu Hertza po prawej stronie (przyjmując wybrany punkt jako początkowy punkt styku), aż do ustawionego maksymalnego wgniecenia (zalecane 200-300 nm).
3. Dla każdego punktu oblicza się względny błąd RMS obu dopasowań i sumuje te wartości.
4. Punkt, który osiąga minimalny całkowity błąd dopasowania, jest wybierany jako początkowy punkt styku.
   Uwaga: Czas obliczeń można skrócić, implementując przeszukiwanie złotym podziałem zamiast liniowego skanowania całej krzywej siły.
5. Deformację próbki δ oraz siłę wgniecenia F oblicza się jako:
   
6. Do dopasowania danych F w funkcji δ w obszarze po kontakcie, z ≥ z₀, do modelu Hertza w celu wyznaczenia modułu Younga E komórki stosuje się metodę najmniejszych kwadratów:
   
   , gdzie v to liczba Poissona.
   Uwaga: Gdy δ przekracza 10% grubości próbki (wysokości komórki), zmierzona sztywność komórki jest wpływana przez sztywność podłoża. Grubość obszaru okołojądrowego wynosi zazwyczaj rzędu kilku mikrometrów. Dlatego do modelu Hertza dopasowuje się tylko pierwsze 200-300 nm krzywej F-δ.

Wyniki

Rysunek 2a przedstawia trzy reprezentatywne krzywe siły uzyskane z fibroblastów 3T3 hodowanych odpowiednio na powierzchni plastikowej oraz na żelach poliakrylamidowych o modułach Younga 3 000 Pa i 17 000 Pa. Po dokładnym zidentyfikowaniu punktów styku na krzywych, siła wciskania jako funkcja deformacji komórki została naniesiona na Rysunek 2b. Przy sile o wartości mniejszej niż 0,3 nN, końcówka o kształcie piramidy wnika na głębokość 3 micrometers do wnętrza komórki hodowanej na żelu pol...

Dyskusja

Metoda wgłębiania AFM ma zalety w charakterystyce właściwości mechanicznych żywych komórek. Chociaż jest mniej czuły niż magnetyczna cytometria skręcająca i pęseta optyczna, które mogą mierzyć siły na poziomie pikonewtonu³², AFM może wykryć siłę oporu od próbek od dziesiątek pikoniutonów do setek nanoniutonów, porównywalną z zakresem siły, którą można przyłożyć do komórek za pomocą mikropipety¹⁹. Ten zakres siły odpowiada potrzebom tworzenia mierzalnych deformacji we wszystkich typach komórek^19...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop sił atomowych	Azyl badawczy	MFP3D-BIO