Test ilościowy do badania interakcji białko-DNA, odkrywania transkrypcyjnych regulatorów ekspresji genów i identyfikowania nowych środków przeciwnowotworowych

Podsumowanie

Opracowaliśmy ilościowy test wiążący DNA, oparty na ELISA, do pomiaru interakcji czynników transkrypcyjnych z DNA. Wysoką swoistość białka RUNX2 osiągnięto dzięki oligonukleotydowi rozpoznającemu DNA i swoistemu przeciwciału monoklonalnemu. Detekcja kolorymetryczna z reakcją substratową przeciwciał sprzężoną z enzymem była monitorowana w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Wiele testów wiążących DNA, takich jak testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), testy chemiluminescencyjne, testy oparte na immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i testy oparte na wielu dołkach są używane do pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego. Jednak testy te są nieilościowe, brakuje im swoistości, mogą wiązać się z użyciem znakowanych radioaktywnie oligonukleotydów i mogą nie być przystosowane do badań przesiewowych inhibitorów wiązania DNA. Z drugiej strony, używając ilościowego testu immunoenzymatycznego związanego z enzymem wiążącym DNA (D-ELISA), wykazujemy interakcje białek jądrowych z DNA za pomocą czynnika transkrypcyjnego RUNX2, które zależą od specyficznego związku z konsensusowymi sekwencjami wiążącymi DNA obecnymi na oligonukleotydach znakowanych biotyną. Opisano przygotowanie komórek, ekstrakcję białka jądrowego i projektowanie dwuniciowych oligonukleotydów. 96-dołkowe płytki pokryte awidyną utrwala się buforem alkalicznym i inkubuje z białkami jądrowymi w buforze blokującym nukleotydy. Po intensywnym myciu płytek, po inkubacji swoistych przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych dodaje się substrat peroksydazy chrzanowej i rozwija się reakcja kolorymetryczna. Do ilościowego pomiaru interakcji białka z DNA wykorzystano tryb zatrzymania reakcji lub ciągłe monitorowanie kinetyczne. Omówiono odpowiednie kontrole swoistości, w tym leczenie nieswoistymi IgG lub bez białka lub przeciwciała pierwszorzędowego. Opisano zastosowania testu, w tym jego przydatność w badaniach przesiewowych leków oraz omówiono reprezentatywne wyniki pozytywne i negatywne.

Wprowadzenie

Testy wiążące DNA są użyteczne w pomiarze zdolności czynników transkrypcyjnych do interakcji z DNA. Testy wiązania DNA obejmują testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), które zależą od znakowanych radioaktywnie oligonukleotydów ¹ lub testów chemiluminescencyjnych ². Opisano również testy oparte na immuneprecypitacji chromatyny (ChIP) ³ oraz testy wykorzystujące formaty 96-dołkowe ⁴. Jednak EMSA jest testem nieilościowym, który wymaga użycia oligonukleotydów znakowanych radioaktywnie. Kiedy białka jądrowe łączą się ze specyficznymi sekwencjami promotora nukleotydów, kompleksy wiążące są opóźniane na żelach poliakrylamidowych, a specyficzny czynnik transkrypcyjny można zwalidować za pomocą przeciwciała "supershift". Opracowaliśmy ilościowy test wiązania DNA przy użyciu formatu immunoenzymatycznego (D-ELISA), który jest w stanie zmierzyć interakcję RUNX2 z sekwencjami wiążącymi DNA odpowiadającymi zdefiniowanym elementom promotora w docelowych genach RUNX2. Zastosowanie przeciwciała anty-RUNX2 zapewnia specyficzność testu, a brak znakowania radioaktywnego odróżnia ten test od tradycyjnego testu przesunięcia żelu ⁵. Wykrywanie kompleksów wiążących jest możliwe dzięki zastosowaniu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (HRP), które przekształca substrat HRP, tetrametylobenzydynę (TMB) w barwny produkt do analizy spektrofotometrycznej. Opisany tutaj test może obejmować wykorzystanie zmutowanych oligonukleotydów DNA jako kontroli i może być stosowany do wykrywania konkurencyjnych lub niekonkurencyjnych inhibitorów wiązania DNA. Dzięki temu testowi możliwe jest również badanie przesiewowe nowych związków przeciwnowotworowych.

Protokół

Kilka kroków jest wykonywanych z wyprzedzeniem, a kilka odczynników jest przygotowywanych i przechowywanych przed procedurą: (1) hodowla komórkowa i izolacja białek, (2) przygotowanie oligonukleotydu, (3) przygotowanie 96-dołkowych płytek, (4) inkubacja ekstraktu jądrowego przez noc. Zabieg trwa 2 dni ze względu na całonocną inkubację białka jądrowego z oligonukleotydami DNA.

1. Przygotowanie

1.1 Izolacja białka jądrowego

1. Bufor hipotoniczny: Aby przygotować 100 ml buforu hipotonicznego, dodać 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 μl (1 M MgCl₂), 333 μl (3 M KCl) do 98,3 ml H₂O. Stężenia końcowe: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl. Dla buforu hipotonicznego + NP40 (do użycia w kroku 2.11): Dodać 0,5 ml (10% NP40) do 9,5 ml buforu hipotonicznego dla końcowego 0,5% NP40.
2. Bufor o niskiej zawartości soli: Aby przygotować 100 ml buforu o niskiej zawartości soli (do użycia w kroku 2.15), dodać 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glicerolu, 150 μl (1 M MgCl₂), 666 μl (3 M KCl), 40 μl (0,5 M EDTA) do 73 ml H₂O. Stężenia końcowe: 10 mM HEPES, 25% glicerol, 1,5 mM MgCl₂, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
3. Bufor o wysokiej zawartości soli: Aby przygotować 100 ml buforu o wysokiej zawartości soli (do użycia w kroku 2.15), dodaj 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glicerolu, 150 μl (1 M MgCl₂), 26,7 ml (3 M KCl), 40 μl (0,5 M EDTA) do 47 ml H₂O. Stężenia końcowe: 10 mM HEPES, 25% glicerolu, 1,5 mM MgCl₂, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
4. 10% NP40 Detergent: 10 ml NP40 do 90 ml H₂O
5. Inhibitory proteazy i fosfatazy [dodawane do buforu hipotonicznego + NP40 (krok 2.11), do buforu o niskiej zawartości soli (krok 2.15) i do buforu o wysokiej zawartości soli (krok 2.15) tuż przed użyciem]: Dodać 2,5 μl (1 M DTT) i 50 μl inhibitorów proteazy (100x) do 5 ml każdego buforu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mM DTT i 1x inhibitory proteazy. W skład podstawowej mieszaniny inhibitora proteazy 100x wchodzą: fluorek sodu (Ser/Thr, fosfatazy kwaśne), ortowanaradan sodu (Tyr, fosfatazy alkaliczne), β-glicerofosforan (fosfatazy Ser/Thr), pirofosforan sodu (fosfatazy Ser/Thr), aprotynina (proteazy Ser), Bestatyna (aminopeptydazy), E64 (proteazy cysteinowe), leupeptyna (proteazy Ser/Cys), EDTA (metaloproteazy).

1.2 Przygotowanie płytek testowych

1. Roztwór utrwalający płytki: Aby przygotować 500 ml roztworu, dodać 5,25 g węglanu sodu do 500 ml H₂O, dobrze wymieszać i dostosować pH do 9,7 w celu uzyskania końcowego stężenia 0,1 M węglanu sodu.
2. Roztwór blokujący płytkę: Aby przygotować podstawowy oligonukleotyd poli dI/dC, ponownie zawiesić 1 jednostkę (~50 mg) poli dI/dC w 1 ml 10 mM Tris/HCl, pH 7,9 zawierającym 1 mM EDTA, aby uzyskać stężenie podstawowe 50 μg/μl. Zapas rozcieńcza się do 1 μg/μl przed użyciem.

1.3 płuczące i rozcieńczenia przeciwciał

UWAGA: Bufor do płukania streptawidyny służy do płukania płytek pomiędzy dodatkami oraz do rozcieńczania pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał.

1. Aby przygotować 1 l buforu do płukania streptawidyny, dodaj 2,4 g Tris/HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20) do 1 l sterylnej filtrowanej wody o pH 7,18. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Stężenia końcowe: 20 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 Bufor wiążący DNA

UWAGA: Ten bufor jest przechowywany w temperaturze -20 °C.

1. Aby przygotować 15 ml buforu wiążącego DNA, dodać 180 μl (1 M HEPES, pH 7,9), 300 μl (3 M KCl), 12 μl (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 μl (1 M DTT), 3,0 ml (60% glicerolu), 300 μl (50 μg/μl poli dI/dC) rozcieńczonych dejonizowanym/destylowanym_H2O(12 ml). Stężenia końcowe: 12 mM HEPES/pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% glicerol, 1 μg/μl poly dI/dC.

2. Hodowla komórkowa i izolacja białek jądrowych

UWAGA: Przygotowanie wymaga około 3 godzin. Stymulacja komórek będzie zależała od eksperymentu. Liczba komórek używanych w każdym eksperymencie będzie się różnić, a wszystkie objętości odzwierciedlają typowy eksperyment z użyciem 3 x 10⁷ komórek na punkt. Dostosuj głośność, aby dostosować się do liczby komórek faktycznie użytej w eksperymencie ⁶.

1. Aby przygotować białko jądrowe do testów wiązania DNA, należy wyhodować komórki ludzkie, które wyrażają RUNX2 (śródbłonek, kostniakomięsak, komórki raka piersi) w odpowiednich pożywkach ⁶.
2. Traktuj komórki subkonfluentne nokodazolem (0,2 μg/ml przez 16 godzin) w celu zatrzymania komórek na granicy cyklu komórkowego G2/M ⁶. W tych warunkach białko RUNX2 jest stabilizowane i osiągane jest maksymalne wiązanie DNA. W ten sposób dostępna jest wystarczająca ilość białka jądrowego do wielu testów, a inhibitory mogą być porównywane z tego samego preparatu.
3. Na każdym etapie należy wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C, przygotować i schłodzić przez 20 minut w temperaturze 4 °C przed pobraniem komórek.
4. Schłodzić komórki (4 °C) i przeprowadzić zabiegi na lodzie.
5. Odwirować komórki z prędkością 1 000 obr./min przez 5 minut w okrągłodennej probówce z polipropylenu o pojemności 15 ml.
6. Przemyć 1x lodowatym PBS (bez Ca²⁺ i Mg²⁺).
7. Ponownie odwirować i odrzucić supernatant PBS.
8. Dodać 500 μl buforu hipotonicznego bez inhibitorów proteazy, uważając, aby całkowicie zawiesić osad komórkowy.
9. Przenieść zawartość do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 ml.
10. Natychmiast odwirować z prędkością 5 500 obr./min przez 5,5 minuty; wyrzucić supernatant i ZACHOWAĆ osad komórkowy.
11. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu hipotonicznego zawierającego 0,5% NP40. Dodać inhibitory proteazy i fosfatazy oraz 0,5 mM DTT (zgodnie z opisem w kroku 1.1.5).
12. Pozostawić próbkę na lodzie przez 30 minut.
13. Wirować z prędkością 13 000 obr./min przez 10 min.
14. Odrzucić supernatant (zawiera białka cytozolowe).
15. Zawiesić ponownie osad jądrowy w 60 μl każdego buforu o niskiej zawartości soli (do którego dodano inhibitory proteazy i 0,5 mM DTT z kroku 1.1.5) i bufor o wysokiej zawartości soli (do którego dodano inhibitory proteazy i 0,5 mM DTT z kroku 1.1.5), co daje w sumie 120 μl. Najpierw dodać 60 μl buforu o niskiej zawartości soli do osadu i ponownie zawiesić, Następnie dodać 60 μl buforu o wysokiej zawartości soli. Zwiruj granulkę, aby pomóc w ponownym zawieszeniu.

UWAGA: Ten krok pomaga pozbyć się niektórych białek błony jądrowej i przygotować się do etapu lizy: najpierw niska zawartość soli (resuspend pellet, vortex), a następnie wysoka zawartość soli (vortex) optymalizuje ten krok. Trzymaj ekstrakt na lodzie przez 30 minut, z wirowaniem po pierwszych 10 minutach.

16. Wirować z prędkością 12 000 obr./min przez 15 minut; zachować supernatant zawierający białko jądrowe.
17. Zmierzyć stężenie białka (starać się utrzymywać próbki w temperaturze 2-5 mg/ml), porcjować w odpowiednich ilościach (10 μl/probówkę) i przechowywać w temperaturze -80 °C.

UWAGA: Szacowana wydajność: 30 x 10⁶ komórek da 5 μg/μl białka w 120 μl. 5 x 10⁶ komórek da 2,2 μg/μl białka w 40 μl.

3. Przygotowanie dwuniciowego oligonukleotydu

1. Zaprojektuj komplementarne oligonukleotydy z kompatybilnymi półmiejscami na końcach. Dla RUNX2 są to: 5'-CGTATTAACCACAATACTCGCGTATTAACCACAATACTCGCGTATTAACCACAATAC TCG -3'-Biotyna (sens) i 5'CGAGTATTGTGGTTAATACGCGAGTATTGTGGTTAATACGCGAGTATT GTGGTTAATACG -3'-Biotyna (antysens).

UWAGA: Eksperymenty pilotażowe wykazały, że trzy miejsca wiązania RUNX2 i biotyna znakowana jednym końcem dały najbardziej powtarzalne wyniki.

2. Przygotować 5x bufor do wyżarzania: Dodać 300 μl (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 μl (1 M MgCl₂), 10 μl (1 M DTT) do 260 μl H₂O (ostatecznie 600 μl).
3. Do 200 pmol każdego jednoniciowego oligonukleotydu (3 μl) dodać 12 μl 5x buforu do wyżarzania i 45 μl H₂O, co daje w sumie 60 μl (200 pmol/60 μl).
4. Podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5-10 minut w bloku grzewczym.
5. Schłodzić powoli do temperatury 65 °C (ustawiając temperaturę na 65 °C, trwa to 15 minut), a następnie powoli schłodzić do temperatury pokojowej, wyłączając zasilanie bloku grzewczego (lub umieszczając w 50 ml wody o temperaturze 65 °C w zlewce na lodzie; trwa to 15-20 minut).

4. Przygotowanie płytek 96-dołkowych

UWAGA: Nie używaj białek mleka w do mycia.

1. Płytkę utrwalającą z roztworem utrwalającym (0,1 M węglan sodu): dodać 300 μl/basenik.
2. Inkubować przez 2 godziny, kołysząc w temperaturze pokojowej (RT) lub nie kołysząc w temperaturze 4 °C (O/N).
3. Przemyć płytkę 3x buforem do płukania streptawidyny (WB): za każdym razem dodawać 300 μl/studzienkę.
4. Dodaj dwuniciowy oligonukleotyd znakowany biotyną (3 zgodne miejsca wiązania na nukleotyd) przez 2 godziny z kołysaniem (1,25 nmol / dołek; 100 μl / dołek).
5. Umyj 3x zimnym WB: dodaj 300 μl/studzienkę, a następnie natychmiast odwróć talerz do zlewu i po każdym dodaniu osusz brzegi ręcznikiem papierowym.

UWAGA: Nie używaj końcówek pipet do usuwania płynu z płytek, ponieważ może to spowodować zeskrobanie kompleksów avidin:biotyna:DNA ze studzienek. Zrób to dla wszystkich kolejnych etapów prania.

5. Inkubacja z ekstraktem jądrowym

UWAGA: Nie zastępuj DNA plemników łososia lub śledzia buforem blokującym poli dI/dC. Unikaj zatykania talerzy białkami mleka. Oba te czynniki blokujące powodują wysokie wartości tła.

1. Inkubować ze specyficznym czynnikiem transkrypcyjnym przygotowanym z ekstraktu jądrowego (90 μl/basenik). Przygotować mieszankę główną zawierającą ekstrakt jądrowy (białko wiążące DNA; 3-9 μg / dołek) + poli dI / dC (1 μg / μl z 50 μg / ul podstawy) w 1x bufor wiążący DNA. Objętość jest potrzebna dla całkowitej wymaganej liczby studzienek (90 μl/studzienkę).
2. Na tym etapie dodaje się dowolny potencjalny inhibitor, taki jak witamina D3 (rysunek 2) lub 5221975 związku CADD (rysunek 3), lub odpowiednie rozcieńczenie kontrolnego rozpuszczalnika, takiego jak etanol.
3. Umieść talerz na platformie bujanej, O/N w temperaturze 4 °C.
4. Przemyć 3x z WB: dodać 300 μl/basenik

6. Dodanie przeciwciała pierwotnego

UWAGA: Pierwotne roztwory przeciwciał powinny być przygotowywane świeże - przechowywanie nie jest zalecane.

1. Rozcieńczyć przeciwciało monoklonalne specyficzne dla RUNX2 (podstawowe 1 μg/μl) 1/5 000 w buforze do płukania streptawidyny. Przygotować wystarczającą ilość do dodania do każdego dołka płytki 96-dołkowej (90 μl/basenik) w trzech egzemplarzach.
2. Inkubuj przez 1 godzinę w RT na kołyszącej się platformie.
3. Przemyć 3x z WB; dodać 300 μl/dołek.

7. Dodanie przeciwciała drugorzędowego

UWAGA: Drugorzędowe rozcieńczenia przeciwciał mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez noc, jeśli zajdzie taka potrzeba następnego dnia.

1. Rozcieńczyć przeciwciało sprzężone ze sprzężonym z HRP swoiste dla swoistości F_ab (7,1 mg / ml zapasów) do 1:1,400 w buforze do płukania streptawidyny: 3,5 μl przeciwciała/5,0 ml buforu do płukania. Przygotować wystarczającą ilość do dodania do każdego dołka płytki 96-dołkowej (90 μl/basenik) w trzech egzemplarzach.
2. Inkubuj przez 30 minut w RT na bujanej platformie.
3. Umyć 6x z WB, odwracając talerz do zlewu (300 μl/studzienkę).

8. Rozwój podłoża HRP i produktu

1. Dodać 50 μl substratu TMB do dołka bezpośrednio z butelki bulionowej.
2. Inkubować 10-20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności (metoda zatrzymania reakcji) lub bezpośrednio mierzyć absorbancję (ciągłe monitorowanie kinetyczne).

9. Pomiar reakcji

1. Metoda zatrzymania reakcji: Aby uzyskać wizualną reakcję zatrzymania, sprawdź, czy kolor zmienił się z przezroczystego na niebieski i zatrzymaj reakcję za pomocą 50 μl kwasu siarkowego.
2. Pomiar absorbancji przy długości fali 450 nm za pomocą spektrofotometru Biotrak II z czytnikiem płytek widzialnych (Amersham Biosciences; GE Healthcare Biosciences Corp. Piscataway, NJ, USA) lub podobnym instrumentem.
3. Metoda ciągłego monitorowania kinetycznego: Dodać substrat po ostatnim praniu i tuż przed umieszczeniem w spektrofotometrze (nie przerywać reakcji).
4. Pomiar absorbancji przy długości fali 635 nm za pomocą spektrofotometru Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) lub podobnym instrumentem.

Wyniki

Metoda D-ELISA jest wysoce specyficzna dla wyznaczonego białka wiążącego DNA, o ile używany jest specyficzny dla sekwencji, dwuniciowy oligonukleotyd zawierający trzy kopie miejsca wiązania konsensusu RUNX2 (ACACCA). Pierwotne przeciwciało rozpoznające czynnik białkowy również zwiększa swoistość. Przeciwciało drugorzędowe zawiera kowalencyjnie połączoną peroksydazę chrzanową (HRP), która przekształca przezroczysty substrat (tetrametylobenzydynę) w kolorowy produkt w celu ułatwienia wykrycia (ryc. 1). Z t...

Dyskusja

Testy wiązania DNA służą do pomiaru zdolności czynników transkrypcyjnych do interakcji z DNA. Testy wiązania DNA obejmują przesunięcie ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) ¹ i testy oparte na immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) ³ , a także testy wykorzystujące formaty 96-dołkowe ⁴ , takie jak testy chemiluminescencyjne ². EMSA jest nieilościowa i wykorzystuje oligonukleotydy znakowane radioaktywnie (³²P). Są one inkubowane z białkami jądrowymi, a kompleksy wiążące ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
Przeciwciało RUNX2	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg / ml
Przeciwciało sprzężone z peroksydazą specyficzną dla Fab	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7,1 mg / ml
TMB Substrat (tetrametylobenzydyna)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Węglan sodu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	do mocowania płytek
	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Roztwór zatrzymujący
Płytki wielodołkowe	Greiner Bio-One, Bazylea, Szwajcaria	655996	Powlekane Avidin, czarne strony
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Inhibitory proteazy i fosfatazy
Chemikalia	Różni producenci	Klasa
Tabela 1. Odczynniki
Spektrofotometr: Biotrak II Czytnik płytek widzialnych	Amersham Biosciences		Do użytku z metodą reakcji zatrzymania
Spektrofotometr: Bio-Tek Synergy HT Czytnik mikropłytek wieloreakcyjnych	Bio-Tek Instruments, Inc.		Do użytku z ciągłym monitorowaniem kinetycznym
Tabela 2. Sprzęt