Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej

Summary

Wizualizacja danych eksperymentalnych stała się kluczowym elementem prezentacji wyników społeczności naukowej. Generowanie poklatkowych zapisów na żywo rosnących zarodków przyczynia się do lepszej prezentacji i zrozumienia złożonych procesów rozwojowych. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym znakowania komórek poprzez fotokonwersję białka kaede u danio pręgowanego.

Abstract

Paletogeneza kręgowców to wysoce choreograficzny i złożony proces rozwojowy, który obejmuje migrację komórek grzebienia nerwowego czaszki (CNC), konwergencję i rozszerzenie wypukłości twarzy oraz dojrzewanie szkieletu twarzoczaszki. Aby zbadać wpływ grzebienia nerwowego czaszki w określone regiony podniebienia danio pręgowanego, stworzono linię transgenicznego danio pręgowanego sox10: kaede. Sox10 zapewnia ograniczenie linii białka reporterowego kaede do grzebienia nerwowego, dzięki czemu znakowanie komórek jest bardziej precyzyjnym procesem niż tradycyjne wstrzyknięcie barwnika lub reporterowego mRNA. Kaede jest białkiem fotokonwertowalnym, które zmienia kolor z zielonego na czerwony po fotoaktywacji i umożliwia precyzyjne śledzenie komórek. Linia transgeniczna sox10: kaede została wykorzystana do przeprowadzenia analizy linii w celu wyznaczenia populacji komórek CNC, które dają początek elementom szczęki i żuchwy oraz zilustrowania homologii protuberancji twarzy do owodniowców. Ten protokół opisuje kroki, które należy wykonać, aby wygenerować film poklatkowy na żywo zarodka zebry sox10: kaede. Rozwój płytki sitowej posłuży jako praktyczny przykład. Protokół ten można zastosować do wykonania poklatkowego zapisu konfokalnego dowolnego kaede lub podobnego fotokonwertowalnego białka reporterowego u transgenicznego danio pręgowanego. Co więcej, może być używany do uchwycenia nie tylko normalnego, ale także nieprawidłowego rozwoju struktur twarzoczaszki u mutantów danio pręgowanego.

Introduction

Rozszczepy twarzoczaszki reprezentują najbardziej rozpowszechnioną deformację twarzoczaszki, z 1/700-1,000 dotkniętymi porodami ¹. Zaburzenie wczesnego rozwoju embriologicznego twarzoczaszki może prowadzić do powstania rozszczepu wargi i podniebienia (CL/P). Podczas gdy przyczyny rozszczepu syndromicznego zostały w dużej mierze pokazane, genetyczne i epigenetyczne podstawy niesyndromicznych form rozszczepu ustno-twarzowego nadal muszą zostać odkryte ^2-4. Aby zrozumieć etiologię i patogenezę tych wad rozwojowych, konieczne jest wyjaśnienie rozwoju struktur twarzoczaszki na bazie komórkowej.

U wszystkich gatunków kręgowców komórki grzebienia nerwowego czaszki (CNCC) migrują z grzbietowej cewy nerwowej, aby wypełnić łuki gardłowe, co przyczyni się do tworzenia struktur ustno-twarzowych. Zaburzenie wczesnego rozwoju zarodkowego grzebienia nerwowego może prowadzić do powstawania wad rozwojowych twarzoczaszki, w tym CL/P ^5-7.

Oprócz strukturalnych podobieństw między danio pręgowanym a rozwojem twarzoczaszki u ssaków (CNCC znajdują się w regionach homologicznych), sieć regulacji genów jest wysoce konserwatywna. Wykazano również, że CNCC rozwijają się w ten sam sposób u gatunków owodniowców i danio pręgowanego ⁸, co czyni danio pręgowanego potężnym organizmem do badania rozwojowych i genetycznych podstaw CL/P. Ma wiele zalet, w tym niewielkie rozmiary, szybki rozwój embrionalny i ex-utero oraz wysokie wskaźniki rozmnażania. Ponadto zarodek jest optycznie przezroczysty, dzięki czemu jest podatny na obserwację złożonych zdarzeń rozwojowych pod mikroskopem ⁹. Jest to idealny model zwierzęcy do badania migracji i różnicowania komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Rozszerzając poprzednio opublikowane prace ^{8, 10, 11}, wzorzec migracji CNCC został szczegółowo opisany za pomocą sox10: transgeniczny model ^{kaede 5}. Kaede jest białkiem fotokonwertowalnym, które zmienia kolor z zielonego na czerwony po aktywacji zdjęcia i umożliwia precyzyjne śledzenie CNCC. Podczas tej przemiany szkielet peptydowy jest rozszczepiany, co sugeruje, że konwersja jest stabilna, co oznacza, że komórki można śledzić do ich ostatecznego miejsca przeznaczenia ¹². Linie transgeniczne znakowane kaede pod kontrolą transkrypcyjną sox10 wykazały, że podniebienie owodniowe i płytka sitowa danio pręgowanego są tworzone homologicznie przez fuzję obustronnych protuberancji szczęki (MXP) z protuberancją czołowo-nosową (FNP) i że szew fuzyjny w kształcie litery Y jest analogiczny między gatunkami.

Wśród innych zastosowań, model transgenicznego danio pręgowanego sox10: kaede został wykorzystany do generowania filmów z zarodkami danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju, aby pokazać tworzenie się normalnych i nieprawidłowych struktur twarzoczaszki. Fotokonwersja określonych grup komórek umożliwia śledzenie ich rozwoju. Dzięki tej metodzie wprowadzono podejście polegające na tworzeniu obrazowania na żywo rozwijających się struktur twarzoczaszki u danio pręgowanego, co ułatwia wizualne zademonstrowanie tego złożonego procesu rozwojowego.

Ten protokół ma na celu dzielenie się doświadczeniem w generowaniu tych filmów przy użyciu normalnego rozwoju płytki sitowej w sox10: na przykład transgeniczny danio pręgowany kaede. Protokół ten można następnie zastosować do tworzenia filmów poklatkowych dowolnej struktury pochodzącej z komórek grzebienia nerwowego czaszki u danio pręgowanego.

Protocol

1. Pobieranie zarodków do fotokonwersji

1. Ustaw co najmniej dziesięć par transgenicznych danio pręgowanego sox10: kaede między 17 a 18 wieczorem.
2. Następnego ranka wyciągnij przegrody i zbierz jajka około południa. Przenieść je na szalki Petriego i umieścić w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.
3. Około 24 godziny po zapłodnieniu oczyść szalki Petriego, usuwając martwe zarodki. Sprawdź stadium rozwojowe zarodków ¹³ za pomocą mikroskopii w polu świetlnym i dowolnego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP). Kaede będzie widoczna przez ten filtr.
4. Gdy zarodki osiągną 60 hpf, przenieś pięć jaskrawo fluorescencyjnych zarodków na oddzielną szalkę Petriego i w razie potrzeby dokonaj ich dekorionacji.

2. Montaż zarodka do fotokonwersji

1. Zamontuj zarodek za pomocą zwykłego mikroskopu fluorescencyjnego. Montaż zarodków pod mikroskopem konfokalnym jest niezwykle trudny.
2. Użyj standardowej wody E3 lub przygotuj świeżą wodę E3, korzystając z następującego przepisu:
   Dodaj następujące składniki na jeden litr wody destylowanej dH₂O, dodaj następujące elementy, aby uzyskać 1x E3L:
   0,292 g 5,0 mM NaCl
   0,013 g 0,17 mM KCl
   0,044 g 0,33 mM CaCl₂ (środek osuszający, 96%, odczynnik ACS)
   0,081 g .33mM MgSO₄ (bezwodniony)
   Opcjonalnie: dodać 200 μl 0,05% błękitu metylenowego do 1X E3 jako fungicydu i wymieszać.
   Pożywka utrzymuje się w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień.
3. Użyj standardowej tricainy lub przygotuj tricainę, korzystając z następującego przepisu:
   Na 5 L 0,2% tricainy wymieszaj następujące składniki:
   45 ml tris-Cl (1M pH 9,5)
   5 L H₂O
   10 g trykainy
4. Przygotować "sok filmowy" (50 ml E3, 0,015% roztwór tricainy), dodając 3,75 ml 0,2% trikainy do 46,25 ml E3.
5. Przygotować agarozę, mieszając 46,25 ml wody E3 z 46,35 mg agarozy o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w szklanej kolbie o pojemności 50 ml i rozpuścić cząstki stałe w kuchence mikrofalowej. Następnie dodać 3,73 ml 0,2% trikainy do agarozy i umieścić szklaną kolbę z agarozą w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C do czasu użycia.

3. Przygotowanie i montaż zarodka

1. Znieczulić zarodki roztworem trykainy E3/0,015% wykonanym w kroku 1.1.2 i przenieść zarodek do szkiełka komórkowego.
2. Nadmiar E3 nasącz chusteczką papierową i połóż agarozę na zarodku.
3. Ustaw zarodek idealnie grzbietowo za pomocą końcówek mikroładowacza. Upewnij się, że cały zarodek nie unosi się na agarozie, ale popycha całe ciało w dół. Następnie wlej E3/0,015% roztwór tricainy na zatopiony w agarozie zarodek, aż komora zostanie całkowicie wypełniona płynem.

4. Dostosowywanie ustawień oprogramowania w mikroskopie konfokalnym

1. Użyj obiektywu zanurzonego w powietrzu 20X (apertura numeryczna 0,75; rozmiar otworu 20) do ustawiania ostrości zarodka. Następnie naciśnij przycisk światła L100 na mikroskopie i wybierz kanały w oprogramowaniu. Otwórz widok ikon/kontrolki akwizycji/Ustawienia A1 i kliknij przycisk konfiguracji konfokalnej. Następnie kliknij 'auto' i wybierz następujące kanały przed ponownym zamknięciem okna:
   Ch1: Kanał DAPI - 403,4 nm (można stosować długości fal od 350 do 410 nm)
   Kanał 2: 488,0 nm
   Kanał 3: 561,9 nm

5. Konwersja zdjęć

1. Wyłącz Ch1 i 3 oraz włącz Ch2 przed kliknięciem przycisku usuwania blokady i skanowaniem.
2. Skoncentruj się na interesujących komórkach do fotokonwersji, co najlepiej zrobić, zaczynając od 1 klatki / s i wysokiego napięcia (HV) 200, a następnie zwiększając liczbę klatek / s i odpowiednio obniżając HV, aż osiągniesz 1/32 klatki / s i HV około 100-120, w zależności od szumu tła.
3. Gdy zarodek jest ostry, spójrz na prawą krawędź ekranu, chwyć zieloną obwódkę i zmniejsz ją, aby pasowała do obszaru zainteresowania do fotokonwersji i kliknij prawym przyciskiem myszy. Im mniej, tym lepiej, ponieważ fotokonwersja jest nieodwracalna.
4. Ustaw klatki/s na 1 i HV na 200 i naciśnij skanowanie. Powiększony obraz obszaru fotokonwersji jest teraz widoczny.
5. Fotokonwertuj komórki, włączając Ch1 (403,4 nm). Wystaw na działanie lasera fotokonwertującego od 5 do 60 sekund, w zależności od wielkości obszaru, aż zielona kaede widziana przez kanał GFP będzie prawie nieobecna.
6. Gdy zielony sygnał kaede jest prawie nieobecny, wyłącz Ch1. Włącz Ch2 i 3. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w oknie w polu obszaru skanowania A1 i naciśnij "przywróć do oryginalnego rozmiaru", aby sprawdzić, czy żądane komórki zostały fotokonwertowane.

6. Tworzenie stosu Z

1. Znajdź ikonę "przechwytywanie serii Z" na pasku menu i ustaw górne i dolne limity stosu Z przed jego rozpoczęciem. Ustaw LUT.

7. Oprogramowanie- Ustawienia Time-lapse

1. Przejdź do pola A1Simple GUI i zaznacz następujące ustawienia:
   1/32 klatki/sek
   Rozmiar 1024
   średnio 4 lub 8X w zależności od liczby stosów Z, które należy wykonać w jednej pętli
2. Przejdź do: view/ akwizycja akwizycji/ akwizycja sekwencji ND i ustaw ramy czasowe (8-30min), kliknij ciągły i kliknij Z-stack. Ustaw obramowania zgodnie z wcześniejszymi testami i rozpocznij film.
3. Dodawaj E3/0,015% roztwór roztworu trikainy przez cały dzień. W nocy całkowicie napełnij komorę. To potrwa do następnego ranka.
4. Następnego ranka uzupełnij roztwór E3/0,015% tricainy i sprawdź, czy zarodek nadal żyje. Utrata fluorescencji oznacza śmierć. Kontynuuj uzupełnianie i kontrole przez cały dzień.
5. Kiedy struktura zakończy formowanie się lub zarodek umrze, dokończ film.

8. Przetwarzanie postprodukcyjne

1. Kliknij "pokaż projekcję maksymalnej intensywności" na pasku narzędzi, a następnie kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i utwórz nowy dokument. Wideo jest teraz widoczne w najlepszej możliwej jakości. Przejdź do usuwania ramek, które nie są potrzebne, i dostosuj LUT. Na koniec zapisz jako .avi. Ten format będzie odpowiedni dla systemu Windows. W przypadku komputerów Mac pobierz oprogramowanie, aby przekonwertować na .mov lub .wmv.

Results

W linii transgenicznej sox10: kaede, migrujące i pomigracyjne CNCC są oznaczone fluorescencyjnie na zielono. Komórki CNCC oznaczone zielonym fluorescencyjnym kaede podsumowują endogenną ekspresję mRNA sox10 ⁵.

Wśród innych zastosowań, ten model zwierzęcy został wykorzystany do lepszej wizualizacji rozwoju struktur twarzoczaszki zależnych od CNCC. Uchwycono prawidłowy rozwój określonych struktur, a także patologiczny rozwój wad rozwojowych twarzoczaszki, zwłaszcza rozszczepu wargi i ...

Discussion

W tym artykule przedstawiono nową metodę wizualizacji rozwoju twarzoczaszki w modelu danio pręgowanego. Linia transgenicznego danio pręgowanego sox10: kaede została z powodzeniem wykorzystana do szczegółowego opisania wzorca migracji CNCC i jest wykorzystywana jako organizm modelowy ⁵.

W poprzednich badaniach wykorzystano ogólne punkty orientacyjne, takie jak oko do komórek docelowych, i opierały się na wstrzyknięciu mRNA kaede, testach fotokonwersji lub dekstranie fluoresceinowym w...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede	MGH		Dostępna w laboratorium Liao
Szalki Petriego 100x15 mm	BD Falcon	351029
szalki Petriego 35 mmx10 mm	BD Falcon	351008
Ultrapure o niskiej temperaturze topnienia (LMP) Agaroza	Invitrogen	15517022
Lab Tek 2 Chamber SlideSystem	LabTek	154453
Mikroładowarki 200/pk	Fisher	E5242956003
Nikon A1R Si Confocal Ti series	Nikon	Brak numeru katalogowego
NIS Elements Software AR3.2 64-bit	Nikon	Brak numeru katalogowego