Pomiary siły mogą być użyte do pokazania zmian w funkcjonowaniu mięśni spowodowanych rozwojem, kontuzją, chorobą, leczeniem lub toksycznością chemiczną. W tym filmie pokazujemy metodę pomiaru siły podczas maksymalnego skurczu mięśnia tułowia larw danio pręgowanego.
Artykuł metodologiczny
Pomiar siły podczas skurczu w celu oceny funkcji mięśni u larw danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Larwy danio pręgowanego dostarczają modeli rozwoju mięśni, chorób mięśni i toksyczności chemicznej związanej z mięśniami, ale powiązane badania często nie mają funkcjonalnych miar zdrowia mięśni. W tym artykule wideo pokazujemy metodę pomiaru wytwarzania siły podczas skurczu mięśni tułowia larw danio pręgowanego. Pomiary siły wykonuje się poprzez umieszczenie znieczulonej larwy w komorze wypełnionej roztworem soli. Przedni koniec larwy jest przywiązany do przetwornika siły, a tylny koniec larwy jest przywiązany do regulatora długości. Izometryczny skurcz drgawkowy jest wywoływany przez stymulację polem elektrycznym, a odpowiedź siły jest rejestrowana do analizy. Wytwarzanie siły podczas skurczu jest miarą ogólnego stanu zdrowia mięśni, a w szczególności miarą funkcji mięśni. Chociaż opisujemy tę technikę do stosowania z larwami typu dzikiego, metoda ta może być stosowana z larwami modyfikowanymi genetycznie lub z larwami traktowanymi lekami lub substancjami toksycznymi, w celu scharakteryzowania modeli chorób mięśni i oceny leczenia lub do badania rozwoju mięśni, urazów lub toksyczności chemicznej.
Wprowadzenie
Młode larwy danio pręgowanego (Danio rerio), 3-7 dni po zapłodnieniu (dpf), są coraz częściej uznawane za użyteczne organizmy do badań nad mięśniami szkieletowymi. Młode larwy są wykorzystywane do modelowania chorób mięśniu ludzi 1-9, oceny leków i strategii terapeutycznych10-11, badania uszkodzeń mięśni12, zrozumienia rozwoju mięśni13-16 i badania toksyczności chemicznej związanej z mięśniami17-19. Typowe badania w tych obszarach badają stopień, w jakim zdrowe mięśnie stają się nienormalne w wyniku manipulacji genetycznej lub narażenia na toksyny, a niektóre badania badają stopień, w jakim nieprawidłowy mięsień reaguje na leczenie. Kluczowe znaczenie dla powodzenia tych badań ma zdolność do dokładnej oceny zdrowia mięśni.
Chociaż istnieje wiele metod oceny zdrowia mięśni u larw danio pręgowanego, niewiele z nich dostarcza bezpośrednich informacji na temat funkcji mięśni. Zdrowie mięśni jest zwykle oceniane na podstawie wyglądu, ocenianego za pomocą barwienia histologicznego6,8,11, barwienia immunologicznego9,15,16,18, mikroskopii świetlnej3,13, mikroskopii elektronowej3,4,14,16 lub dwójłomności7,9,11, ale techniki te dostarczają tylko informacji morfologicznych. Przemieszczenia tułowia i ogona oraz prędkość pływania4,17 oceniają funkcje motoryczne, ale nie są to bezpośrednie miary funkcji mięśni, ponieważ odzwierciedlają również bodźce nerwowe, metabolizm energetyczny i inne procesy.
Natomiast pomiar siły wytwarzania podczas skurczu zapewnia bezpośrednią ocenę funkcji mięśni i stanowi miarę ogólnego zdrowia mięśni. Dodatkowe korzyści płynące z tego podejścia obejmują prostą analizę danych i wyniki ilościowe. W tym artykule wideo przedstawiamy szczegółową procedurę pomiaru wytwarzania siły przez mięśnie larwalne, w nadziei, że więcej badaczy użyje tej metody w celu uzupełnienia istniejących pomiarów zdrowia mięśni w swoich badaniach.
Ogólnym celem tej metody jest pomiar generowania siły podczas skurczu mięśni tułowia larw danio pręgowanego. Aby osiągnąć ten cel, larwa danio pręgowanego jest znieczulana i umieszczana w komorze wypełnionej roztworem soli. Przedni koniec larwy jest przywiązany do przetwornika siły, a tylny koniec larwy jest przywiązany do regulatora długości. Aktywacja mięśni odbywa się poprzez stymulację polem elektrycznym, a prąd stymulacji i długość larwy są dostosowywane tak, aby wytworzyć maksymalną siłę skurczu. Wywoływany jest izometryczny skurcz drgawkowy i rejestrowana jest reakcja siły do analizy.
Dla jasności, ta technika nie mierzy sił generowanych przez mięśnie larwalne podczas pływania. Ponieważ oba końce larwy są przywiązane do sprzętu, a larwa pozostaje znieczulona, nie może zainicjować ruchu podczas badania. Co więcej, stymulacja polowa aktywuje wszystkie włókna mięśniowe w tym samym czasie, aby wywołać obustronny skurcz, który nie jest tym, co występuje naturalnie20. Dlatego też, zamiast mierzyć rzeczywiste siły generowane podczas pływania, technika ta określa zdolność mięśni larwalnych do generowania siły.
Użyliśmy tej techniki, aby zademonstrować osłabienie mięśni w modelu miopatii nemalinowej danio pręgowanego21, a także ocenić wpływ leczenia antyoksydacyjnego na funkcję mięśni w modelu danio pręgowanego choroby wielordzeniowej22. Inni zastosowali podobną technikę23 do zbadania wpływu zanieczyszczenia środowiska na funkcjonowanie mięśni19.
Protokół
Uwaga: wszystkie procedury z udziałem danio pręgowanego powinny być wykonywane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Wszystkie procedury wykorzystywania zwierząt przedstawione w tym artykule zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Michigan (UCUCA).
1. Wykonaj pętle do szwów
- Za pomocą kleszczy oddziel niesterylny szew (nylon monofilamentowy USP 10/0, 3 warstwy) na trzy pasma.
- Zacznij wiązać podwójny węzeł od góry w jednym z pasm. Zatrzymaj się przed całkowitym zaciśnięciem węzła, aby zamiast węzła zrobić małą (o średnicy ~1 mm) pętlę.
- Użyj nożyczek, aby odciąć nadmiar szwu z ogonów pętli. Przykład gotowej pętli pokazano na rysunku 1.
- Umieść pętelkę po lepkiej stronie karteczki samoprzylepnej do późniejszego wykorzystania. Pętle do szwów będą używane do utrzymywania larw na miejscu podczas prób siłowych.
- W razie potrzeby powtórz kroki 1.1-1.4. Wykonaj dwie pętle szwów dla każdej larwy, która będzie testowana.
2. Przygotuj rozwiązanie testowe
- Przygotować roztwór Tyrodes, dodając 7,977 g chlorku sodu, 0,373 g chlorku potasu, 0,265 g dwuwodnego chlorku wapnia, 0,102 g sześciowodnego chlorku magnezu, 0,048 g jednozasadowego fosforanu sodu, 1,000 g wodorowęglanu sodu i 0,037 g dwuwodnej soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego do 1,000 ml oczyszczonej wody.
- Mieszaj roztwór, aż sole całkowicie się rozpuszczą. Roztwór ten można przechowywać przez miesiąc w temperaturze 4 °C.
- Dodać 2,1 ml 4 mg/ml tricainy, przygotowanej zgodnie z The Zebrafish Book24, do 47,9 ml roztworu Tyrodes i wymieszać. Chroń ten roztwór przed światłem, przechowując go w butelce z ciemnego szkła lub w szklanej butelce pokrytej folią aluminiową. Roztwór ten należy przechowywać w temperaturze pokojowej i codziennie przygotowywać świeży.
3. Przywiąż znieczuloną larwę do komory doświadczalnej
- Umieścić aparaturę badawczą (rysunek 2) na stoliku mikroskopu stereoskopowego.
- Podłączyć przetwornika siły i regulatora długości do aparatury badawczej. Włącz przetwornik siły. Włącz kontroler długości tak, aby pozostał sztywny. (Uwaga: regulator długości zapewnia możliwość rozciągania lub skracania preparatu mięśniowego podczas skurczu. Jednak ta funkcja regulatora długości nie jest używana w metodzie opisanej w niniejszym dokumencie. Dlatego regulator długości można traktować jako sztywny punkt mocowania zamontowany do systemu pozycjonowania XYZ).
- Za pomocą jednorazowej pipety transferowej napełnij komorę doświadczalną roztworem testowym.
- Użyj kleszczy, aby podnieść pętlę szwów za jeden z ogonów i zawiesić ją na rurce przetwornika siły. Zawieś drugą pętlę do szwów na rurce przymocowanej do kontrolera długości. (Uwaga: uchwycenie pętli szwów na zakrzywionej części może zagiąć szew i spowodować jego pęknięcie podczas kolejnych kroków).
- Za pomocą jednorazowej pipety transferowej przenieś larwę danio pręgowanego na małą szalkę Petriego wypełnioną roztworem testowym. Poczekaj, aż środek znieczulający w roztworze testowym (tricaina) zacznie działać (~1 min). Kleszczami delikatnie szturchnij ogon i sprawdź, czy larwa jest znieczulona przez brak pływania wywołanego dotykiem.
- Użyj szklanej pipety, aby przenieść larwę do komory doświadczalnej.
- Delikatnie szturchając larwę zamkniętymi kleszczami, przeprowadź przednią część larwy przez pętlę szwów na rurce przetwornika siły. Przeprowadź przednią część larwy przez pętlę szwów na rurce. Chwyć oba ogony pętli szwów kleszczami i pociągnij je jednocześnie, aby zacisnąć pętlę szwów z tyłu woreczka żółtkowego lub pęcherza pławnego (ryc. 3A).
- Za pomocą kleszczy przytrzymaj jeden ogon pętli szwów i pociągnij, powodując, że larwa obraca się o 90° wokół rurki, aż boczna strona larwy będzie skierowana do góry (ryc. 3B). Jeśli pętla została wystarczająco zaciśnięta, będzie pewien opór przed pociągnięciem; Larwa nie powinna się łatwo obracać. Jeśli pętla została zbyt mocno zaciśnięta, larwa nie będzie się obracać wokół rurki.
- Za pomocą urządzenia pozycjonującego XYZ podłączonego do regulatora długości, przesuń rurkę regulatora długości wzdłuż osi X (definicje osi na rysunku 2A) oraz pod tułowiem i ogonem larwy. Pozostaw przestrzeń między końcami rurki regulatora długości a rurką przetwornika siły.
- Poprowadź pętlę szwów przez ogon larwy i zaciśnij pętlę szwów, jak opisano wcześniej (ryc. 3C). Może być konieczne obrócenie tylnej części larwy tak, aby boczna strona była skierowana do góry. Przytnij ogony pętli szwów (Rysunek 3D).
4. Umieść larwę w komorze doświadczalnej
- Przesuń larwę na odpowiednią odległość od dna komory, aby upewnić się, że larwa będzie znajdować się w "odległości roboczej" od odwróconego obiektywu mikroskopu podczas kolejnych kroków. Aby to osiągnąć, użyj urządzeń pozycjonujących XYZ, aby powoli opuścić rurki (z dołączoną larwą) wzdłuż osi Z, aż rurki dotkną dna komory. Następnie podnieś rurki, aż larwa znajdzie się w odpowiedniej odległości od dna komory (~100 μm).
- Za pomocą urządzenia pozycjonującego XYZ podłączonego do regulatora długości, wyreguluj rurkę regulatora długości wzdłuż osi Y, aby wyrównać długą oś larwy z długą osią rurki przetwornika siły.
5. Rekordowa siła podczas maksymalnego skurczu Twitcha
- Przesunąć aparaturę badawczą do stolika mikroskopu odwróconego.
- Dostosuj temperaturę komory do żądanej wartości. Aby rozpocząć, podłącz cyrkulator kąpieli wodnej, termometr i regulator temperatury do aparatury testującej. Włącz niezbędne komponenty i dostosuj ustawienie regulatora temperatury, aż termometr poda żądaną wartość. Dane zawarte w tym artykule zostały zebrane w temperaturze 25 °C, ale pomiary mogą być również wykonywane w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 28,5 °C.
- Podłączyć od stymulatora do aparatury badawczej. Włącz zasilanie stymulatora, ale nie stymuluj larwy do kroku 5.6.
- Upewnij się, że larwa jest równoległa do dna komory. Przez obiektyw 40X zobacz część larwy między końcami rurek. Jeśli jest równoległy do dna, oba końce larwy będą ostre. W razie potrzeby wyreguluj rurkę przetwornika siły wzdłuż osi Z, aż oba końce będą zogniskowane.
- Sprawdź, czy długość larwy jest krótsza niż optymalna. Włącz system długości sarkomeru wideo i obróć kamerę wideo tak, aby prążki były równoległe do boków klatki wideo. System ten monitoruje odstępy między prążkami, analizując zmiany intensywności pikseli wzdłuż każdego poziomego rzędu pikseli w zdefiniowanym przez użytkownika obszarze zainteresowania (ROI). Wyniki dla wszystkich wierszy w ROI są uśredniane i raportowane z częstotliwością odpowiadającą liczbie klatek na sekundę wideo (≥80 s-1). Odstępy prążkowane są używane jako wskaźnik długości sarkomeru.
- Ustaw mikroskop tak, aby ustawił ostrość na włóknach obwodowych i zanotuj wskazaną długość sarkomeru. W razie potrzeby należy użyć urządzenia pozycjonującego XYZ dołączonego do regulatora długości, aby wyregulować długość larwy (oś X) do momentu, gdy długość sarkomeru będzie mniejsza niż optymalna (np. 1,90 μm).
- Dostosuj prąd stymulacji, aby zoptymalizować siłę drgania. Na początek ustaw prąd wyjściowy na stymulatorze na niską wartość (np. 100 mA). Stymulator może być uruchamiany ręcznie lub przez komputer z uruchomionym niestandardowym programem LabVIEW. Wywołaj drganie mięśni larwalnych o czasie trwania impulsu prądowego o długości 0,2 ms.
- Użyj oscyloskopu, aby zarejestrować wyjściową siłę wyjściową i zmierzyć szczytową siłę drgań za pomocą kursorów oscyloskopu. Zwiększ prąd o 50 mA i zmierz szczytową siłę drgań na każdym poziomie prądu. Odczekaj 30 sekund między drgawkami, aby zapobiec zmęczeniu. Wraz ze wzrostem prądu stymulacji szczytowa siła drgania zwykle wzrasta do maksimum, a następnie stopniowo maleje. Prąd, przy którym larwa generuje największą siłę, to optymalny prąd stymulacji. Ustaw amplitudę prądu na optymalny prąd stymulacji.
- Za pomocą urządzenia pozycjonującego XYZ wyreguluj długość larwy (a tym samym długość sarkomeru), aby wywołać maksymalną siłę drgania. Larwy danio pręgowanego typu dzikiego (3-7 dpf) generują maksymalną siłę drgania przy długości sarkomeru 2,10 μm lub 2,15 μm. Jednak długość sarkomeru można ustawić na 2,08 μm, aby uniknąć nadmiernego obciążenia larwy.
- Wywołaj drgnięcie mięśni larwalnych. Użyj oscyloskopu, aby zarejestrować reakcję siły i zapisać zapis do późniejszej analizy.
6. Zmierz wymiary muskulatury z larwą na optymalnej długości
- Przenieś aparaturę testującą z powrotem do mikroskopu stereoskopowego.
- Za pomocą skali okularu zmierz wysokość mięśni patrząc z boku. Następnie, uważając, aby nie zmienić długości larwy, obróć larwę o 90° za pomocą ogonów pętli szwów, aby zobaczyć larwę od dołu. Zmierz szerokość muskulatury patrząc od dołu. Pomiary należy wykonać w anatomicznym punkcie orientacyjnym (np. ujściu układu moczowo-płciowego) (ryc. 4).
- Przetnij pętle szwów za pomocą mikroostrza, aby uwolnić larwę ze sprzętu testującego.
Wyniki
W zdrowych larwach zebrafish typu dzikiego włókna mięśniowe powinny przebiegać równolegle do siebie, bez dużych przerw pomiędzy nimi, i wykazywać wyraźne prążkowanie (Rysunek 5A). Larwy zebrafish typu dzikiego, które nie wykazują tych cech lub posiadają widoczne uszkodzenia, takie jak oddzielone włókna (Rysunek 5B), powinny zostać odrzucone.
Reprezentatywny wykres szczytowej siły skurczu w zależności od prądu stymulacji dla pojedynczej larwy danio pręgowanego przedstawiono na Rysunku 6. Dla larw danio pręgowanego typu dzikiego w wieku od 3 do 7 dpf optymalny prąd stymulacji wynosi zazwyczaj od 400 do 600 mA, przy czym larwy w wieku 3 dpf zazwyczaj wymagają większego prądu stymulacji niż larwy w wieku 6-7 dpf.
Surowe dane dotyczące siły (zebrane w kroku 5.8) muszą zostać przetworzone i przeanalizowane za pomocą oprogramowania do analizy danych. Po pierwsze, linię bazową zapisu siły ustawia się na zero. Po drugie, napięcie wyjściowe przetwornika siły przelicza się na siłę (mN) (należy zapoznać się z instrukcją producenta w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej dla przetwornika siły). Reprezentatywna odpowiedź siły zebrana podczas maksymalnego skurczu tężcowego pojedynczej larwy została przedstawiona na Rysunku 7. Oprogramowanie do analizy danych może zostać wykorzystane do pomiaru siły szczytowej oraz innych parametrów odpowiedzi siły.
Reprezentatywny zestaw danych dotyczących siły szczytowej maksymalnych skurczów drgawkowych przedstawiono na Rysunku 8A. Typowe wartości szczytowej siły skurczu dla larw typu dzikiego w 3–7 dpf mieszczą się w zakresie od 0,9 do 1,7 mN, przy czym starsze larwy generują większą siłę niż larwy młodsze. Różnice w szczytowej sile skurczu mogą wynikać z normalnych procesów, takich jak wzrost i rozwój (Rysunek 8), lub procesów nieprawidłowych, takich jak patologie związane z mutacjami genów21,22.
Normalizację według pola przekroju poprzecznego mięśnia (CSA) można wykorzystać do określenia, w jakim stopniu różnice w szczytowej sile skurczu pojedynczego wynikają po prostu z różnic w wielkości muskulatury21,22. CSA mięśnia można oszacować za pomocą wzoru: CSA = π(A/2)(B/2), gdzie A to wysokość muskulatury widziana z boku, B to szerokość muskulatury widziana od dołu, a przekrój poprzeczny przyjmuje się za eliptyczny. Typowe wartości CSA dla larw typu dzikiego w wieku 3-7 dpf wahają się od 0,027 do 0,034 mm2, przy czym larwy 3-4 dpf zazwyczaj wykazują mniejsze wartości CSA niż larwy 5-7 dpf. Reprezentatywny zestaw znormalizowanych danych dotyczących szczytowej siły maksymalnych skurczów pojedynczych przedstawiono na Rysunku 8B. Typowe znormalizowane wartości szczytowej siły skurczu pojedynczego dla larw typu dzikiego w wieku 3-7 dpf mieszczą się w zakresie od 34 do 51 mN/mm2, przy czym larwy 4-7 dpf zazwyczaj wykazują wyższe wartości niż larwy 3 dpf.
Rycina 1. Pętla szewna. Strzałki wskazują końce pętli szewnej.
Rysunek 2. (A) Aparatura testowa z opisanymi elementami. (B) Widoki z bliska komory eksperymentalnej. (a) Komora eksperymentalna z przezroczystym dnem. (b) Przetwornik siły. (c) Kontroler długości. (d) Urządzenia pozycjonujące XYZ. Osie X, Y i Z są zdefiniowane w prawym górnym rogu. (e) System kontroli temperatury wykorzystujący moduły termoelektryczne. Przewody umożliwiają przepływ wody do chłodzenia modułów termoelektrycznych. (f) Rurka ze stali nierdzewnej przymocowana do przetwornika siły. (g) Rurka ze stali nierdzewnej przymocowana do kontrolera długości. (h) Mikrosonda termometryczna. (i) Platynowe elektrody płytowe równoległe, rozciągające się na całej długości komory. Płytki platynowe mają wysokość 2.5 mm i grubość 0.255 mm.
Rycina 3. Przymocowywanie larwy w komorze eksperymentalnej. (A) Larwa przymocowana na końcu przednim, ale jeszcze nie obrócona o 90°. (B) Larwa po obrocie o 90°. (C) Larwa przymocowana na końcu tylnym, ale jeszcze nie obrócona. (D) Larwa po obrocie i przycięciu końców pętli szwu.
Rysunek 4. Pomiary do szacowania powierzchni przekroju poprzecznego. Muskulatura widziana od (A) boku i od (B) dołu. Położenie czerwonych pasków wskazuje lokalizację otworu urogenitalnego. Długość czerwonych pasków wskazuje odpowiednio wysokość i szerokość muskulatury widzianej z boku i od dołu.
Rysunek 5. Widok boczny muskulatury tułowia larw zebrafish. (A) Tkanka zdrowa. (B) Tkanka z widocznymi uszkodzeniami. Kontraktury wynikające z odrywania się włókien są zaznaczone gwiazdkami.
Rycina 6. Reprezentatywny wykres szczytowej siły skurczu w zależności od prądu stymulacji. Optymalny prąd stymulacji wynosi 500 mA.
Rysunek 7. Reprezentatywny zapis siły dla pojedynczego skurczu drgającego. Skurcz ten został wywołany impulsem stymulującym w czasie 0 msec. Siła szczytowa wynosi 1,56 mN.
Rycina 8. Reprezentatywne dane dotyczące siły u larw w wieku 3–7 dpf. (A) Dane dotyczące siły szczytowej podczas maksymalnych skurczów pojedynczych. (B) Dane dotyczące siły szczytowej podczas maksymalnych skurczów pojedynczych znormalizowane do CSA. Starsze larwy (6–7 dpf) były karmione Hatchfry Encapsulon Grade 0 ze Spiruliną (Argent Laboratories) począwszy od 5 dpf. Podano średnie + odchylenia standardowe przy N=5 w każdej grupie. Oznaczono grupy istotnie różniące się od larw 3 dpf (*) i larw 4 dpf (#) (ANOVA, P<0.05). Istotny wzrost siły znormalizowanej między 3 a 4 dpf (B) wskazuje na zwiększenie wewnętrznej zdolności generowania siły w tym okresie, natomiast wzrost siły między 4 a 6–7 dpf (A) przypisuje się wzrostowi organizmu, co wynika z braku zmian w sile znormalizowanej od 4 do 7 dpf.
Dyskusja
Metoda ta mierzy wytwarzanie siły podczas skurczu w celu oceny funkcji mięśni tułowia larw danio pręgowanego. Chociaż skurcze tężcowe mogą być wywołane u larw danio pręgowanego (np. przez 200 impulsów stymulacyjnych/s przez czas trwania 0,2 sekundy), maksymalna siła tężcowa jest tylko o 10-15% większa niż maksymalna siła skurczu. Dlatego siła generowana podczas drgania jest rozsądną miarą zdolności generowania siły. Drgawki są preferowane w stosunku do skurczów tężcowych, ponieważ drgawki rzadziej powodują rozdarcie lub zsunięcie się szwów.
Aby wygenerować miarodajne dane za pomocą tej techniki, należy osiągnąć maksymalną siłę drgania dla każdej larwy, a zmienność między grupami eksperymentalnymi powinna być zminimalizowana. Mając na uwadze te cele, proponujemy następujące propozycje. Po pierwsze, należy zachować ostrożność podczas przywiązywania larwy do przetwornika siły i rurek regulatora długości. Jeśli pętle szwów zostaną zbyt mocno zaciśnięte, szew przetnie tkankę mięśniową. Jeśli pętle szwów nie są wystarczająco napięte, siła generowana przez larwę nie zostanie w pełni przeniesiona na przetwornik siły. Obie sytuacje, a zwłaszcza ta druga, nie doceniają maksymalnej siły drgania. Po drugie, ponieważ testowanie wielu grup eksperymentalnych może zająć kilka godzin (20-30 minut/larwę), należy zmieniać grupy, ponieważ larwy będą się nadal rozwijać w okresie testowania.
Podczas gdy niektóre z wymienionych urządzeń są niezbędne do pomiaru maksymalnej siły drgania (np. przetwornik siły, stymulator prądu), inne elementy nie są absolutnie konieczne. System długości sarkomeru wideo jest pożądany, ale nie jest wymagany. Alternatywnie można zastosować serię drgań w celu znalezienia optymalnej długości, podczas których długość larwy jest dostosowywana, aż do osiągnięcia maksymalnej siły skurczu. System kontroli temperatury również nie jest absolutnie konieczny. Kontrola temperatury ma kluczowe znaczenie przy pomiarze kinetyki drgania, która jest bardzo wrażliwa na temperaturę, podczas gdy maksymalna siła drgania nie jest szczególnie wrażliwa na niewielkie zmiany temperatury i może być mierzona w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że niezależnie od temperatury w komorze podczas próby siłowej, larwy powinny być utrzymywane w optymalnej temperaturze wzrostu 28,5 °C24 przed próbą siły w celu dokładnej oceny stopnia.
Larwy są badane w roztworze Tyrodes zawierającym trikainę. Używamy 0,02% (w/v) tricainy, stężenia zalecanego do znieczulenia24, w celu wyeliminowania spontanicznych skurczów wywołanych przez układ nerwowy, a tym samym zapobiegania zmęczeniu podczas próby siłowej. Tricaine ułatwia również etap wiązania i skraca całkowity czas testowania. Obserwujemy jednak, że włączenie trikainy do roztworu testowego konsekwentnie zmniejsza maksymalną siłę drgania o około 30%. Podobny efekt zaobserwowano również w mięśniu ogona kijanki, gdzie tricaina zmniejszyła wytwarzanie siły po zablokowaniu transmisji nerwowo-mięśniowej, co sugeruje, że trikaina ma bezpośredni wpływ na mięśnie25. Trikaina może zmniejszać pobudliwość komórek mięśniowych poprzez zmniejszenie przewodnictwa sodu przez błonę komórkową, tak jak ma to miejsce w komórkach nerwowych26. Inne opcje blokowania aktywacji przez neurony ruchowe to d-tubokuraryna i α-bungarotoksyna, ale w przeciwieństwie do tricainy, związki te nie są przepuszczalne dla skóry i muszą być wstrzykiwane bezpośrednio do głowy, rdzenia kręgowego lub serca27. Poszczególni badacze będą musieli ocenić, czy trikaina jest pożądana dla ich konkretnego zastosowania. Jeżeli trikaina jest zawarta w roztworze do badań, stężenie powinno być spójne między doświadczeniami, a badacze powinni sprawdzić, czy działanie trikainy nie różni się między grupami doświadczalnymi.
Opisujemy tę metodę dla larw w wieku od 3 dpf do 7 dpf. Chociaż włókna mięśniowe wydają się być funkcjonalne już po 17 godzinach od zapłodnienia, kiedy zaczynają się spontaniczne ruchy ogona27, krótka długość ogona przed 3 dpf utrudnia przywiązanie larwy do sprzętu testowego. Zazwyczaj nie badamy larw po 7 dpf, ponieważ wiele modeli chorobowych nie przeżywa znacznie dłużej niż ten czas. W przypadku badania larw powyżej 5 dpf, larwy należy karmić. Zaobserwowaliśmy, że niekarmione larwy mają mniejsze mięśnie i generują mniejszą maksymalną siłę skurczu niż karmione larwy, prawdopodobnie z powodu zmniejszającego się woreczka żółtkowego. W związku z tym pożądane może być badanie larw w zakresie od 3 do 5 dpf, aby uniknąć dodatkowej zmiennej w postaci żerowania zewnętrznego.
Podsumowując, opisano ilościową i wiarygodną metodę pomiaru wytwarzania siły podczas maksymalnego skurczu skurczowego mięśnia tułowia larw danio pręgowanego. Metoda ta może być stosowana do oceny ogólnego stanu zdrowia mięśni larw danio pręgowanego, a w szczególności dostarcza informacji na temat funkcji mięśni. Oprócz dostarczania informacji o wielkości generowania siły, technika ta może być wykorzystana do badania kinetyki generowania siły lub dostosowana do badania zmęczenia mięśni22. Chociaż opisujemy tę technikę do stosowania z larwami typu dzikiego, metoda ta może być stosowana w przypadku larw modyfikowanych genetycznie lub larw leczonych lekami lub substancjami toksycznymi, w celu scharakteryzowania modeli chorób mięśni i oceny leczenia lub do badania rozwoju mięśni, uszkodzenia mięśni lub toksyczności chemicznej związanej z mięśniami.
Oświadczenia
Opłaty za otwarty dostęp zostały opłacone przez Aurora Scientific.
Podziękowania
Autorzy dziękują Angeli Busta za pomoc w hodowli danio pręgowanego. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (AG-020591 dla S.V.B. i 1K08AR054835 dla J.J.D.).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZNIKI | |||
| Tricaina w proszku | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Chlorek sodu | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Chlorek potasu | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Dwuwodny chlorek wapnia | Sigma-Aldrich | 223506 | |
| Sześciowodny chlorek magnezu | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Fosforan sodu jednobazowy | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Węglan sodu | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Dwuwodny disodowy sól kwasu etylenodiaminotetraoctowego | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| SPRZĘT | |||
| Niesterylna nić chirurgiczna | Ashaway Line Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
| Pinceta | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| Nożyczki sprężynowe | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
| Stereomikroskop | Leica Microsystems | MZ8 | Oświetlony źródłem światła Fostec EKE ACE I |
| Przetwornik siły |  Aurora Scientific | 400A | |
| Kontroler długości | Aurora Scientific | 318B | |
| Urządzenia pozycjonujące XYZ | Parker Hannifin | 3936M | |
| Termometr | Physitemp | BAT-12 | |
| Jednorazowa pipeta transferowa | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Odciąć koniec, aby poszerzyć otwór i ułatwić transfer larw |
| Szalka Petriego | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Pipeta szklana | Fisher Scientific | 13-678-8B | Odciąć koniec (i wypalić krawędzie), aby poszerzyć otwór i ułatwić transfer larw |
| Mikroskop odwrócony | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
| Cyrkulator łaźni wodnej | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Kontroler temperatury | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
| Stymulator | Aurora Scientific | 701C | Wysokiej mocy, stymulator podążający |
| System wideo długości sarkomerów | Aurora Scientific | 900B-5A | |
| Oprogramowanie LabVIEW | National Instruments | ||
| Oscyloskop | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
| Mikroostrze | Fine Science Tools | 10050-00 | |
| Uchwyt do mikroostrza | Fine Science Tools | 10053-13 | |
| Oprogramowanie do analizy danych (Signo) | Alameda Applied Sciences |
Bibliografia
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Nixon, S. J., Wegner, J., et al. Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning. Hum. Mol. Genet. 14 (13), 1727-1743 (2005).
- Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. PNAS. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Hirata, H., Watanabe, T., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134, 2771-2781 (2007).
- Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).
- Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology. Neuromuscul. Disord. 20 (12), 826-832 (2010).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum. Mol. Genet. 19 (4), 623-633 (2010).
- Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo. Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum. Mol. Genet. , (1093).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. PNAS. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J. Cell Mol. Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease. Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).
- Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Knöll, R., Bakkers, J. Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex. Dev. Biol. 318 (1), 92-101 (2008).
- Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development. J. Cell Biol. 181 (2), 381-394 (2008).
- Kim, H. R., Ingham, P. W. The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo. Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).
- Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function. J. Cell Sci. 123 (7), 1141-1150 (2010).
- Huang, H., Huang, C., et al. Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS). Aquat. Toxicol. 98 (2), 139-147 (2010).
- Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers. Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).
- Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish. Neurotoxicol. Teratol. 33 (6), 752-764 (2011).
- Buss, R. R., Drapeau, P. Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish. J. Neurophysiol. 87 (3), 1244-1251 (2002).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135 (4), 1115-1127 (2012).
- Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae. J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , Univ. of Oregon Press. Eugene, Oregon. (2000).
- Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. Muscle weakness during tricaine anesthesia. Comp Biochem Physiol Part C. 110 (3), 289-296 (1995).
- Frazier, D. T., Narahashi, T. Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes. Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
Przedruki i uprawnienia
