Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Angiogeneza to złożony proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych, definiowany przez kiełkowanie nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejącej sieci naczyń. Angiogeneza odgrywa kluczową rolę nie tylko w prawidłowym rozwoju narządów i tkanek, ale także w wielu chorobach, w których tworzenie naczyń krwionośnych jest rozregulowane, takich jak nowotwory, ślepota i choroby niedokrwienne. W dorosłym życiu naczynia krwionośne są na ogół w stanie spoczynku, więc angiogeneza jest ważnym celem dla opracowania nowych leków, aby spróbować regulować tworzenie nowych naczyń, szczególnie w chorobie. Aby lepiej zrozumieć angiogenezę i opracować odpowiednie strategie jej regulacji, potrzebne są modele, które dokładnie odzwierciedlają różne etapy biologiczne, które są w nią zaangażowane. Siatkówka noworodka myszy stanowi doskonały model angiogenezy, ponieważ tętnice, żyły i naczynia włosowate rozwijają się, tworząc splot naczyniowy w pierwszym tygodniu po urodzeniu. Model ten ma również tę zaletę, że ma dwuwymiarową (2D) strukturę, dzięki czemu analiza jest prosta w porównaniu ze złożoną anatomią 3D innych sieci naczyniowych. Analizując splot naczyniowy siatkówki w różnym czasie po urodzeniu, można obserwować różne etapy angiogenezy pod mikroskopem. W tym artykule przedstawiono prostą procedurę analizy unaczynienia siatkówki myszy przy użyciu barwienia fluorescencyjnego izolektyną i przeciwciałami specyficznymi dla naczyń krwionośnych.
Wprowadzenie
Angiogeneza to złożony proces rozwojowy definiowany przez tworzenie nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejącej sieci naczyń krwionośnych i jest regulowany przez kilka ścieżek sygnałowych. Najbardziej znanym z nich jest szlak VEGF. VEGF jest uwalniany przez komórki niedokrwienne i prowadzi do inicjacji angiogennego kiełkowania w sąsiednich naczyniach krwionośnych. Wiodąca komórka śródbłonka z nowego kiełka naczyniowego jest komórką "wierzchołkową", która wytwarza filopodia sięgające w kierunku źródła VEGF, a następnie proliferujące komórki śródbłonka "łodygi". W ten sposób aktywowane komórki śródbłonka migrują i namnażają się w kierunku obszaru jałowego, gdzie tworzą nowe rurki naczyniowe. Aby ustabilizować te rurki w celu wsparcia przepływu krwi, komórki śródbłonka oddziałują z perycytami i komórkami mięśni gładkich, które otaczają nowe naczynia krwionośne 1. Angiogeneza jest niezbędna do unaczynienia zarodka i wzrostu tkanek. Jednak przyczynia się również do wielu zaburzeń patologicznych, takich jak rak; Natomiast defekty angiogenezy są związane z chorobami niedokrwiennymi. Opracowanie skutecznych terapii lekowych regulujących angiogenezę jako metody leczenia choroby jest zatem bardzo interesujące. Na przykład skuteczne czynniki antyangiogenne ograniczą wzrost raka, podczas gdy strategie proangiogenne mogą być stosowane w leczeniu choroby niedokrwiennej. W związku z tym modele angiogenezy są niezbędne do lepszego zrozumienia regulacji powstawania nowych naczyń krwionośnych i opracowania nowych strategii terapeutycznych w celu zwiększenia lub zmniejszenia wzrostu naczyń krwionośnych.
Podstawowym elementem badań nad angiogenezą jest wybór odpowiedniego modelu naczyniowego. Wiele modeli in vitro zaprojektowano w celu odtworzenia podstawowych etapów angiogenezy, takich jak migracja komórek śródbłonka, proliferacja i przeżycie 2,3 . Często stosowanym testem in vitro jest tworzenie rozgałęzionej sieci komórek śródbłonka na matrycy Matrigel, chociaż nie jest to specyficzne dla komórek śródbłonka, ani zwykle nie obejmuje wsparcia perycytów lub komórek mięśni gładkich. Ocena angiogenezy kiełkowania ex vivo przy użyciu hodowli narządów myszy, takich jak test ciała zarodka, test pierścienia aortalnego i test śródstopia płodu, umożliwia analizę angiogenezy komórek śródbłonka w kontekście dodatkowych komórek podporowych. Jednak główne ograniczenia tych testów obejmują brak przepływu krwi i regresję naczyń w czasie, co daje ograniczone okno na analizę. Dlatego, aby dokładniej zrozumieć regulację angiogenezy, potrzebne są modele in vivo, takie jak te opracowane u myszy przy użyciu podskórnie wszczepionych gąbek lub zatyczek matrigelowych, a także model niedokrwienia kończyn tylnych. Modele te są jednak trudne do analizy ze względu na złożoną architekturę 3D neovessels. Natomiast zarodek danio pręgowanego okazał się doskonałym modelem do wizualizacji angiogenezy w całym organizmie 4. Jednak mysz jest ewolucyjnie znacznie bliżej spokrewniona z człowiekiem niż danio pręgowany, co czyni mysz preferowanym modelem w wielu przypadkach. W związku z tym angiogeneza pourodzeniowej siatkówki myszy stanowi dobrze scharakteryzowaną metodę z wyboru w badaniach angiogenezy. Zapewnia nie tylko ustawienie fizjologiczne, ale także splot naczyniowy 2D, który można łatwo uwidocznić za pomocą odpowiednich barwników fluorescencyjnych. Za pomocą tej techniki można badać architekturę sieci naczyń, proliferację śródbłonka, kiełkowanie, rekrutację komórek okołonaczyniowych i przebudowę naczyń.
W siatkówce noworodków myszy, rozwój naczyń krwionośnych siatkówki następuje w pierwszym tygodniu życia po urodzeniu. Myszy, w przeciwieństwie do ludzi, rodzą się ślepe, a siatkówki unaczyniają się dopiero po urodzeniu. Naczynia siatkówki powstają ze środka siatkówki w pobliżu nerwu wzrokowego w dniu pourodzeniowym 0 (P0) i rozwijają się w drodze angiogenezy, tworząc wysoce zorganizowany splot naczyniowy, który dociera do obwodu siatkówki o około P8 5. Naczynia krwionośne rozwijają się w charakterystyczny sposób, a splot kapilarny stopniowo rośnie na zewnątrz od tarczy nerwu wzrokowego w kierunku obwodu, aby wytworzyć regularny naprzemienny wzór tętnic i żył z pośrednią siecią naczyń włosowatych. Unaczynienie siatkówki stanowi idealny model do badania angiogenezy, ponieważ naczynia można łatwo zidentyfikować, gdy rosną w płaszczyźnie 2D, co ułatwia badanie unaczynienia siatkówki w preparatach do montażu płaskiego 5. Opisano metodę izolowania siatkówki noworodka myszy w celu analizy odpowiedzi komórek wierzchołka śródbłonka w ciągu kilku godzin ex vivo 6. Alternatywnie, bardziej szczegółowe badanie całego unaczynienia siatkówki i związanych z nią markerów naczyniowych wymaga barwienia immunologicznego utrwalonych próbek siatkówki na różnych etapach rozwoju.
Tutaj podajemy szczegółowy opis niezawodnej i technicznie prostej metody, której używamy do barwienia całego mocowania mysiego splotu naczyniowego siatkówki, od początkowego wyłuszczenia oka po urodzeniu (zobacz też 7) poprzez protokoły barwienia aż do końcowego obrazowania pod mikroskopem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Wyłuszczenie i fiksacja oczu po urodzeniu
- Połóż humanitarnie zabite szczenię myszy na boku, usuń skórę zakrywającą oko nożyczkami.
- Użyj nożyczek i kleszczy, aby wyłuszczyć oko.
- Umieść nożyczki poniżej wyłuszczonego oka, przetnij nerw wzrokowy i otaczające tkanki, a następnie wyjmij oko. Przenieść na 24-dołkową płytkę zawierającą 4% paraformaldehydu (PFA) utworzonego w 2x PBS w temperaturze pokojowej.
- Pozwól każdemu oku związać się na 10 - 15 minut, a następnie przenieś do zimnego 2x PBS na lodzie na 5 - 10 minut. Najlepiej jest rozłożyć enukleacje i późniejszą fiksację, aby upewnić się, że stopień utrwalenia jest równy dla każdego oka.
2. Rozwarstwienie poporodowych mysich siatkówk
- Przenieś oczy na szalkę Petriego zawierającą 2x PBS za pomocą plastikowej pipety Pasteura, która została wycięta w celu poszerzenia otworu i umieszczona pod mikroskopem preparacyjnym.
- Usuń tłuszcz wokół oka za pomocą kleszczy i nożyczek.
- Przebij krawędź rogówki ostrymi nożyczkami i przetnij wokół rogówki i tęczówki, a następnie wyrzuć.
- Włóż kleszczyki między siatkówkę a twardówkę i usuń twardówkę, uważając, aby nie rozerwać siatkówki. Warstwę naczyniówki można również usunąć, ale jeśli istnieje ryzyko uszkodzenia siatkówki na tym etapie, warstwę naczyniówki można pozostawić, ponieważ nie powinno to znacząco wpłynąć na jakość barwienia immunologicznego.
- Usuń soczewkę i ciało szkliste za pomocą kleszczy.
- Usuń naczynia hialoidowe, zbierając je razem w środku oka za pomocą drobnych kleszczy, a następnie szybko odciągnij od środka siatkówki (alternatywnie odetnij podstawę naczyń hialoidalnych drobnymi nożyczkami).
- Opłucz siatkówkę w kształcie miseczki za pomocą PBS na czystej szalce Petriego.
- Wykonaj od 4 do 5 promieniowych nacięć sięgających około 2/3 promienia siatkówki za pomocą nożyczek sprężynowych, aby uzyskać kształt "płatka".
- Odciągnij PBS za pomocą pipety Pasteura, aby spłaszczyć siatkówkę, a następnie usuń nadmiar PBS za pomocą małego kawałka chłonnego papieru.
- Powoli pipetować zimny (-20 °C) metanol kropla po kropli na powierzchnię siatkówki, aż do całkowitego pokrycia, a następnie zalać dodatkowym metanolem. Pomoże to naprawić siatkówki i ułatwi przepuszczalność. Siatkówki zmienią kolor na biały.
- Przenieść do probówki o pojemności 2 ml za pomocą plastikowej pipety Pasteura, która została przycięta w celu poszerzenia otworu.
- Pozostaw siatkówkę w zimnym metanolu na co najmniej 20 minut przed przystąpieniem do barwienia immunologicznego. Spośród zastosowanych tutaj przeciwciał tylko VE-Cadherin nie może być z powodzeniem stosowana na siatkówkach utrwalonych metanolem. W takim przypadku siatkówki muszą przejść bezpośrednio do barwienia immunologicznego po kroku 9.
- W razie potrzeby siatkówki mogą być przechowywane w metanolu w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy przed barwieniem.
3. Barwienie układu krwiodawczego siatkówki metodą immuno/izolektyny
- Ostrożnie wyjąć/wylać metanol i delikatnie przepłukać siatkówki krótko w PBS (na tym etapie siatkówka jest nadal w tej samej probówce o pojemności 2 ml z kroku 11 powyżej).
- Usunąć PBS i przykryć siatkówki 100 μl roztworu do trwałej ondulacji/bloku (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% odpowiedniej surowicy (patrz Tabela 1) i delikatnie wstrząsać przez 1 godzinę.
- Usunąć trwałą ondulację/blok i inkubować siatkówki, delikatnie wstrząsając przez noc w temperaturze 4 °C ze 100 μl wybranych przeciwciał pierwszorzędowych (patrz tabela 1) i/lub izololektyny B4, przygotowanych przez rozcieńczenie w trwałym ondulacji/bloku.
- Usunąć przeciwciało/izolektynę i przemyć siatkówki 4 x 10 min w PBS + 0,3% Triton (PBSTX).
- W niektórych przypadkach, np. po barwieniu IsolectinB4-Alexa488 lub bezpośrednio sprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym, przeciwciało drugorzędowe nie jest wymagane, a siatkówki można montować bezpośrednio (krok 7). Jeżeli w kroku 3 użyto niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego, dodaje się 100 μl odpowiedniego fluorescencyjnego przeciwciała drugorzędowego (rozcieńczonego w stosunku 1:200 w PBSTX) i pozostawia do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej.
- Usunąć przeciwciało wtórne i przemyć siatkówki 4 x 15 min w 2 ml PBSTX.
- Przenieść siatkówki na szkiełka za pomocą plastikowej pipety Pasteura o szerokim otworze i usunąć nadmiar PBSTX za pomocą chłonnej tkanki. Zamontuj siatkówkę, dodając 50 μl Prolong mountant na szkiełko nakrywkowe i delikatnie umieść na siatkówce.
- Przenieś szkiełka do lodówki na noc w temperaturze 4 °C, upewniając się, że są płaskie i chronione przed światłem, aby umożliwić ustawienie mocowania Prolong.
- Obraz siatkówki za pomocą mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu epifluorescencyjnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po wypreparowaniu siatkówka powinna wyglądać jak płaski kwiat (Rycina 1). Stosując opisany powyżej protokół, komórki śródbłonka można uwidocznić za pomocą barwienia izolektyną B4-Alexa488, natomiast wspierające komórki mięśni naczyniowych wizualizuje się przy użyciu przeciwciał przeciwko alfa-aktynie mięśni gładkich (Rycina 2). Obraz przy niskim powiększeniu z użyciem obiektywu 5X na Rycynie 2 umożliwia uzyskanie ogólnego wglądu w organizację naczyniową siatkówki. Ponadt...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiona tutaj metoda oferuje prosty i skuteczny sposób uzyskiwania obrazów barwionych preparatów z całego wierzchowca siatkówki noworodków myszy, dzięki czemu jest łatwo mierzalnym i fizjologicznie istotnym modelem angiogenezy. Początkowo oko myszy może być dość trudne do wypreparowania ze względu na jego mały rozmiar i kształt kuli, więc aby uzyskać wiarygodne wyniki, potrzebna jest pewna praktyka i dobre narzędzia do preparowania. Wypreparowanie oczu przygotowane w 2x stężeniu PBS jest o tyle istotne, że powoduje...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Wellcome Trust i British Heart Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Materiał | |||
| Plastikowe pipety 3 ml | Naukowe materiały laboratoryjne | PIP4210 | Usuń końcówkę nożyczkami, aby utworzyć 24-dołkowe |
| płytki BD Falcon o szerokim otworze | Materiały do laboratoriów naukowych | 353226 | |
| Wybierz szalki Petriego TV 90 mm | Materiały do laboratorium naukowego | SLS2002 | |
| Szkiełka Histobond | VWR | 631-0624 | |
| Szkiełka nakrywkowe 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Pęseta Dumont #5 | Światowe instrumenty precyzyjne | 14095 | |
| Nożyczki sprężynowe o długości 10,5 cm, z prostymi ostrzami 8 mm Światowe | instrumenty precyzyjne | 501235 | Służy do enukleacji |
| Nożyczki Vannas o długości 8,5 cm, z prostymi ostrzami 7 mm i bardzo cienkimi końcówkami 0,025 x 0,015 mm | Światowe instrumenty precyzyjne | 500086 | Służy do preparowania siatkówki |
| Bardzo drobne nożyczki vannas o długości 8 cm z prostymi ostrzami 3 mm i bardzo cienkimi końcówkami 0,015 x 0,015 mm | Światowe instrumenty precyzyjne | 501778 | Używany do preparowania siatkówki |
| krystalicznie czyste’ probówki 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Odczynniki | |||
| Fosforan sodu dwuzasadowy | odczynnik Sigma | S0876 | PBS Odczynnik |
| jednozasadowy fosforan potasu | Sigma | P5655 | PBS |
| Chlorek sodu | Sigma | S9625 | PBS odczynnik |
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | Uzupełnić w 2x PBS i przechowywać w temperaturze -20 ° C |
| BSA | Sigma A7638 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Serum osła | Sigma | D9663 | |
| Serum kozie | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu | Invitrogen | P36930 | Odczynnik montażowy |
| Izolektyna GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Stosować w Rozcieńczenie 1:200 |
| Izolektyna GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Stosować w rozcieńczeniu 1:200 |
| Przeciwciała pierwotneAnty-NG2 (poliklonalne króliki) Millipore AB5320 Wykrywa perycyty Anty-GFAP (klon GA5, mysz monoklonalny)Millipore MAB360 Wykrywa astrocyty Anti-Desmin (klon Y66, | |||
| królik monoklonalny) | Millipore | 04-585 | Wykrywa perycyty |
| Anti-Collagen IV (poliklonalny królik) | Chemicon | AB756P | Wykrywa błonę podstawną naczyń krwionośnych |
| Anty-alfa mięśnie gładkie aktyna-Cy3 (klon 1A4, mysz monoklonalna) | Sigma | C6198 | Wykrywa komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych. |
| Anti-Endoglin (klon MJ7/18, szczur monoklonalny) | BD Pharmingen | 550546 | Wykrywa komórki śródbłonka |
| Anti-CD31 (klon MEC13.3, monoklonalny szczur) | BD Pharmingen | 553370 | Wykrywa komórki śródbłonka |
| Anti-VE-Cadherin (klon 11D4.1, monoklonalny szczur) | BD Pharmingen | 550548 | Wykrywa połączenia komórek śródbłonka |
| Anti-Alk1 (koza poliklonalna) | R& D Systems | AF770 | Wykrywa komórki |
| Przeciwciała drugorzędowe | |||
| Goat anty-królicza-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 °C. |
| Kozia anty-szczura-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 °C. |
| Kozia anty-szczura-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 °C. |
| Kozia anty-mysza-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 °C. |
| Osioł anty-koza-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | Wszystkie przeciwciała drugorzędowe są podawane natychmiast po przybyciu i przechowywane w temperaturze -20 °C. |
| mikroskopy | |||
| Mikroskop preparacyjny | Aparat Zeiss | Stemi SV6 | |
| Aparat | Zeiss | Axiocam HRc | do mikroskopu preparacyjnego |
| Mikroskop epifluorescencyjny | Zeiss | Axioimager z kamerą Apotome | |
| Kamera Zeiss | Axiocam HRm | Axioimager | |
| Nikon | A1R | ||
Bibliografia
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184(2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7 (9), e39336(2012).
- Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).
- Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
