Parabioza u myszy: szczegółowy protokół

Podsumowanie

Parabiotyczne połączenie dwóch organizmów prowadzi do rozwoju wspólnego układu krążenia. W tym protokole opisujemy kroki chirurgiczne mające na celu utworzenie parabiotycznego połączenia między myszą typu dzikiego a myszą konstytutywną z ekspresją GFP.

Streszczenie

Parabioza to chirurgiczne połączenie dwóch organizmów, które umożliwiają dzielenie krążenia krwi. Przyczepienie skóry dwóch zwierząt sprzyja tworzeniu się mikrokrążenia w miejscu zapalenia. Partnerzy parabiotyczni dzielą się krążącymi antygenami, dzięki czemu są wolni od niepożądanych reakcji immunologicznych. Po raz pierwszy opisana przez Paula w 1864^roku1, chirurgia parabiozy została udoskonalona przez Bunstera i Meyera w 1933 roku w celu poprawy przeżywalności zwierząt². W obecnym protokole dwie myszy są łączone chirurgicznie po modyfikacji techniki Bunstera i Meyera. Zwierzęta są połączone przez stawy łokciowe i kolanowe, a następnie przyczepia się do skóry, zapewniając mocne podparcie, które zapobiega obciążeniu zszytej skóry. W tym artykule szczegółowo opisujemy parabiotyczne łączenie się wszechobecnej myszy wykazującej ekspresję GFP z myszą typu dzikiego (WT). Dwa tygodnie po zabiegu para zostaje rozdzielona, a komórki GFP dodatnie można wykryć za pomocą analizy cytometrii przepływowej w krążeniu krwi myszy WT. Chimeryzm krwi pozwala na zbadanie udziału krążących komórek jednego zwierzęcia w drugim.

Wprowadzenie

Parabioza, chirurgiczne połączenie dwóch organizmów, została po raz pierwszy opisana w 1864 roku przez Paula jako sposób na opracowanie modelu do badania wspólnych układów krążenia i polegała na połączeniu skóry i ścian mięśniowych dwóch szczurów¹. Parabioza sprzyja tworzeniu się mikrokrążenia w miejscu zapalenia³ i ma kilka zastosowań w badaniach fizjologicznych, takich jak komunikacja hormonalna między przysadką mózgową a gonadami, a także rola nerek w nadciśnieniu⁴. Został on następnie wykorzystany do zbadania rekrutacji i integracji komórek progenitorowych w neowaskularyzacji⁵, migracji hematopoetycznych komórek macierzystych⁶ i transporcie limfocytów⁷, a także roli i kinetyki krążących komórek zapalnych lub macierzystych w przerzutach nowotworowych^8,9 i chorobach neurodegeneracyjnych¹⁰.

Jedną z istotnych zalet parabiozy jest to, że zwierzęta współpracujące mają wspólne krążące antygeny, co pozwala na migrację komórek i neowaskularyzację bez wywoływania reakcji immunologicznej. Co ważne, Weissman i wsp. wykazali, że parabioza między samcami i samicami myszy nie prowadzi do powstawania przeciwciał anty H-Y¹¹.

W oryginalnym protokole opisanym przez Paula, dwa zwierzęta były połączone ze sobą poprzez połączenie skóry i ścian mięśniowych¹. Metoda ta powodowała jednak znaczne obciążenie zwierząt i skutkowała wysoką śmiertelnością z powodu zakażenia rany. Od tego czasu technika parabiozy została zrewidowana przez kilka grup, z których najbardziej dominującą jest protokół zaproponowany przez Bunstera i Meyera w 1933^roku. Ich metoda obejmowała połączenie stawów łopatki, jam ciała i skóry, co pozwoliło na lepsze wsparcie i mniejszy ból dla zwierząt. Jednocześnie nowa metoda skutkowała minimalną opieką pooperacyjną i znacznie zmniejszyła śmiertelność. Opisany w niniejszym dokumencie protokół jest modyfikacją techniki Bunstera i Meyera, która jest mniej inwazyjna i pozwala na mocniejsze łączenie. Mianowicie, myszy są połączone przez stawy łokciowe i kolanowe, a także przez skórę. To połączenie zapobiega rozszerzaniu się skóry, a tym samym powoduje mniejszy ból i powikłania. W tym miejscu opisujemy łączenie dorosłej myszy typu dzikiego (WT) z konstytutywną myszą wykazującą ekspresję GFP. Pokazujemy, że dwa tygodnie po operacji możemy osiągnąć 50% chimeryzmu krwi, co świadczy o skuteczności tej procedury chirurgicznej w tworzeniu wspólnego układu krążenia.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi komitetu UCLA's animal care and use oraz National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Czas trwania opisanej poniżej procedury to około 45-60 minut od początku do końca.

1. Przygotowanie pola operacyjnego

1. Zabieg należy wykonać w czystym pomieszczeniu do chirurgii dla zwierząt.
2. Wyposażenie: waporyzator izofluranowy, pompka Gaymer T z poduszką grzewczą.
3. Sterylne narzędzia: dwa zakrzywione kleszczyki, drobne nożyczki, uchwyt na igłę.
4. Podczas całego zabiegu należy używać sterylnych rękawiczek.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Umieścić dwa samce lub samice myszy o tym samym pochodzeniu genetycznym, o podobnej wadze i wielkości, w tej samej klatce i monitorować przez co najmniej dwa tygodnie, aby zapewnić harmonijne współżycie. Samice myszy są preferowane ze względu na ich mniej agresywne zachowanie.
2. Znieczulenie zwierząt za pomocą waporyzatora izofluranowego. Umieść myszy w komorze indukcyjnej Posi-Seal podłączonej do parownika izofluranu (4-5% v/v). Po wywołaniu znieczulenia przenieś zwierzę do obszaru golenia sierści i utrzymuj znieczulenie przez cały zabieg przez stożek nosowy połączony z izofluranem (1,5-2% v/v). Nałóż maść okulistyczną z patyczkiem higienicznym, aby zapobiec suchości oczu.
3. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej. Dokładnie ogol lewą stronę myszy umieszczoną po lewej i prawą stronę myszy umieszczoną po prawej stronie, zaczynając od około 1 cm powyżej łokcia do 1 cm poniżej kolana.
4. Ogolone miejsca należy przygotować w aseptyce, dokładnie przecierając (2-3x) chusteczkami nasączonymi betadine, a następnie chusteczkami nasączonymi alkoholem. Umieść myszy na podgrzewanej podkładce pokrytej sterylną podkładką.
5. W przypadku analgezji karprofen i buprenorfinę należy podawać dootrzewnowo lub podskórnie w dawkach odpowiednio 10 mg/kg mc. i 0,1 mg/kg.
6. Ułóż zwierzęta na boku, tyłem do siebie, z przylegającymi ogolonymi obszarami skierowanymi do góry. Aby uniknąć zanieczyszczenia obszaru operacyjnego, przykryj myszy sterylną serwetą, odsłaniając tylko obszar operacji. Utwórz mały otwór na zasłonę, aby zachować sterylność podczas wykonywania operacji. Sprawiliśmy, że okno zasłony jest duże, aby zapewnić lepszą widoczność podczas nagrywania wideo.

3. Parabioza

1. Za pomocą ostrych nożyczek wykonaj podłużne nacięcia skóry na ogolonych bokach każdego zwierzęcia, zaczynając od 0,5 cm powyżej łokcia aż do 0,5 cm poniżej stawu kolanowego (ryc. 1). Po nacięciu delikatnie oderwij skórę od powięzi podskórnej, przytrzymując skórę parą zakrzywionych kleszczy i oddziel powięź drugą parą, aby utworzyć 0,5 cm wolnej skóry. Wykonaj tę separację wzdłuż całego nacięcia.
2. Rozpocznij łączenie od przyczepienia lewego łokcia jednego zwierzęcia do prawego łokcia drugiego. Zarówno oleczrany, jak i stawy kolanowe są wyraźnie rozróżnialne po nacięciu skóry. Aby ułatwić łączenie, zegnij łokieć pierwszej myszy i przełóż igłę niewchłanialnego szwu 3-0 pod olekranon. Podobnie zegnij łokieć drugiej myszy i przełóż pod nią ten sam szew. Przymocuj stawy mocno za pomocą podwójnego węzła chirurgicznego.
3. Połącz stawy kolanowe zgodnie z tą samą procedurą.
4. Po przyczepieniu stawów połącz skórę obu zwierząt za pomocą ciągłego wchłanialnego szwu Vicryl 5-0, zaczynając brzusznie od łokcia w kierunku kolana. Aby zapobiec pękaniu i oddzielaniu się skóry, wykonaj szczelne zamknięcie szwu skóry w okolicy łokci i kolan. Po zakończeniu przyczepiania skóry brzusznej wykonaj podwójny węzeł chirurgiczny. Umieść myszy w pozycji leżącej i kontynuuj szew grzbietowo, kończąc podwójnym węzłem chirurgicznym. Sprawdź ciągłość szwu i potwierdź brak otworów.
5. Podawaj 0,5 ml 0,9% NaCl podskórnie każdej myszy, aby zapobiec odwodnieniu.

4. Rekonwalescencja pooperacyjna

1. Trzymaj zwierzęta na podgrzewanej podkładce do czasu wyzdrowienia.
2. Po wyzdrowieniu należy podać leki przeciwbólowe karprofen i buprenorfinę. Powtarzać dootrzewnowo lub podskórnie odpowiednio co 24 i 12 godzin przez 48 godzin w tych samych dawkach opisanych powyżej (krok 2.5). Monitoruj zwierzęta pod kątem oznak bólu i niepokoju, takich jak drżenie, letarg, gryzienie ogona, wygięty grzbiet, brak pielęgnacji itp. codziennie przez dwa tygodnie.
3. Profilaktycznie należy leczyć myszy zawiesiną doustną Sulfametoksazol / trimetoprim w butelce z wodą 2 mg sulfa/ml +0,4 mg trim/ml przez 10 dni, aby zapobiec infekcjom bakteryjnym.
4. Umieść każdą parę parabiotyków w czystej klatce z monolitycznym materiałem ściółkowym (np. ręcznikiem papierowym lub chłonną sterylną wkładką), aby zapobiec aspiracji materiału ściółkowego. Zwierzęta należy umieścić w klatce wypełnionej ściółką, gdy są w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka z głową do góry. Aby zminimalizować wysiłek związany z sięganiem po pokarm podczas przystosowywania się do życia parabiotycznego, umieść zwilżone granulki żywności na podłodze klatki. Zapewnij materiał do zagnieżdżania. W ciągu 1-2 tygodni myszy parabiotyczne mają zdolność normalnego poruszania się na chirurgicznie sparowanych kończynach przednich i tylnych.
5. Chimeryzm krwi występuje 10-14 dni po zabiegu.

5. Potwierdzenie i procedura odwrotna

1. Po dwóch tygodniach pobierz krew z żył ogonowych każdej myszy do analizy cytometrycznej przepływowej, aby potwierdzić chimeryzm krwi (ryc. 3).
2. Przetwarzanie krwi do analizy cytometrii przepływowej: rozcieńczyć 2-3 krople krwi w 500 μl 10 mM EDTA. Dodać 500 μl 2% dekstranu (rozcieńczonego w PBS), dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Przenieść supernatant do nowej probówki, wirować z prędkością 1 200 obr./min przez 5 minut i ponownie zawiesić granulowane komórki w PBS (lub innym buforze) do analizy metodą cytometrii przepływowej.
3. W zależności od projektu eksperymentalnego, para parabiotyków może zostać rozdzielona w późniejszych punktach czasowych. Z naszego doświadczenia wynika, że utrzymywaliśmy parabiozę par przez okres do 9 miesięcy bez żadnych komplikacji.
4. Wykonaj odwrotną procedurę na sterylnej powierzchni chirurgicznej. Znieczulij myszy, umieszczając je w komorze indukcyjnej podłączonej do parownika izofluranu (4-5%) i utrzymuj znieczulenie 1,5-2% izofluranem, jak opisano powyżej (krok 2.2).
5. Usunąć włosy z obszaru otaczającego początkowy szew i aseptycznie przygotować ogolone miejsca, jak opisano powyżej (kroki 2.3, 2.4).
6. W przypadku analgezji karprofen i buprenorfinę należy podawać dootrzewnowo lub podskórnie w dawkach odpowiednio 10 mg/kg i 0,1 mg/kg.
7. Przykryj obszar operacyjny sterylną serwetą, jak opisano powyżej (krok 2.6).
8. Za pomocą ostrych nożyczek oddziel myszy przez podłużne nacięcie wzdłuż szwu bocznego i delikatnie odłącz nowo utworzoną powięź między dwiema myszami za pomocą pary zakrzywionych kleszczy. Aby rozdzielić stawy, odetnij węzły łączącego je szwu. Odetnij skórę wzdłuż nacięcia, aby uzyskać gładkie krawędzie i ponownie przymocuj skórę za pomocą wchłanialnego, ciągłego szwu Vicryl z powłoką 5-0.
9. Aby zapobiec odwodnieniu, podawaj 0,5 ml 0,9% NaCl podskórnie każdej myszy. Trzymaj zwierzęta na podgrzewanej podkładce do czasu wyzdrowienia.
10. Po wyzdrowieniu należy powtórzyć podawanie leku przeciwbólowego, karprofenu (10 mg/kg) co 24 godziny i buprenorfiny (0,1 mg/kg) co 12 godzin przez 48 godzin.
11. Aby zapobiec infekcjom bakteryjnym, należy leczyć myszy zawiesiną doustną sulfametoksazolu/trimetoprimu (2 mg sulfa/ml +0,4 mg trim/ml) w butelce z wodą przez 10 dni.

Wyniki

Oczekiwanym wynikiem parabiozy dwóch organizmów jest równy wkład układu krwionośnego każdego z zwierząt do wspólnego krwiobiegu (Rysunek 2). Prawidłowe wyrównanie krwi parabiozowanych myszy WT i GFP-dodatnich można łatwo zweryfikować za pomocą analizy cytometrycznej. W tym przypadku krew żylną pobrano z ogonów obu parabiontów 2 tygodnie po operacji, a następnie poddano frakcjonowaniu w celu wyizolowania komórek krwi obwodowej (aby wykluczyć erytrocyty). Wyizolowaną frakcję komórek pochodzenia hematopoety...

Dyskusja

Omawiana tutaj metoda parabiozy przedstawia minimalne trudności techniczne i skutkuje niską śmiertelnością. Przyczep stawów kolanowych i łokciowych jest znaczącym ulepszeniem techniki Bunstera i Meyera. Zabieg pozostaje jednak inwazyjny, dlatego konieczne jest utrzymanie sterylnych warunków przez cały czas trwania zabiegu. Aby dodatkowo zapobiec zakażeniu miejsca operowanego, ważne jest, aby zwierzęta poddane parabiozie otrzymywały kombinację antybiotyków i były regularnie monitorowane. Aby zapewnić mocne podparcie i zap...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Maszynka do strzyżenia	Isoflurane-Phoenix	NDC 57319-559-06
Komora indukcyjna Posi-Seal	Produkty do obrazowania molekularnego	AS-01-0530-SM
Przenośny system anestezjologiczny	Produkty do obrazowania molekularnego	AS-01-0007
Pompa Gaymer	T Gaymar Industries, Inc	TP650
(poduszka grzewcza)	Kent Scientific Corp	TP-22G
Kleszcze zakrzywione	Roboz	RS-5101
Nożyczki	Narzędzia do nauki (FST)	FST 14063-09
Uchwyt na igły		FST FST 12501-13
Golarka elektryczna	Oster	Golden A5

Koc ocieplający