Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Podsumowanie

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.

Streszczenie

Tutaj opisujemy procedurę obrazowania struktur subkomórkowych u żywych gryzoni, która opiera się na użyciu konfokalnej mikroskopii przyżyciowej. Jako narząd modelowy używamy gruczołów ślinowych żywych myszy, ponieważ mają one kilka zalet. Po pierwsze, można je łatwo naświetlić, aby umożliwić dostęp do optyki, i ustabilizować, aby ułatwić redukcję artefaktów ruchu spowodowanych biciem serca i oddychaniem. To znacznie ułatwia obrazowanie i śledzenie małych struktur subkomórkowych. Po drugie, większość populacji komórek gruczołów ślinowych jest dostępna z powierzchni narządu. Pozwala to na zastosowanie mikroskopii konfokalnej, która ma wyższą rozdzielczość przestrzenną niż inne techniki stosowane do obrazowania in vivo, takie jak mikroskopia dwufotonowa. Wreszcie, gruczołami ślinowymi można łatwo manipulować farmakologicznie i genetycznie, zapewniając w ten sposób solidny system do badania procesów biologicznych na poziomie molekularnym.

W tym badaniu skupiamy się na protokole zaprojektowanym do śledzenia kinetyki egzocytozy granulek wydzielniczych w komórkach groniastych oraz dynamiki wierzchołkowej błony plazmatycznej, gdzie granulki wydzielnicze łączą się po stymulacji receptorów beta-adrenergicznych. W szczególności użyliśmy transgenicznej myszy, która wykazuje współekspresję cytozolowego GFP i peptydu ukierunkowanego na błonę połączonego z białkiem fluorescencyjnym tandem-Tomato. Jednak procedury, które zastosowaliśmy do stabilizacji i obrazowania gruczołów ślinowych, można rozszerzyć na inne modele myszy i połączyć z innymi podejściami do znakowania składników komórkowych in vivo, umożliwiając wizualizację różnych struktur subkomórkowych, takich jak endosomy, lizosomy, mitochondria i cytoszkielet aktynowy.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad pojawienie się mikroskopii na żywo i użycie białek fluorescencyjnych doprowadziło do przełomu w każdym procesie komórkowym, jaki można sobie wyobrazić, pogłębiając tym samym nasze zrozumienie biologii komórki ¹. Dziedzina ta odniosła ogromne korzyści dzięki wykorzystaniu kultur komórek ssaków, które są niezwykle potężnymi systemami modelowymi, szczególnie jeśli chodzi o manipulacje eksperymentalne. Jednak często nie zapewniają one prawdziwej reprezentacji biologii złożonych organizmów wielokomórkowych ². Kwestia ta zaczęła być rozwiązywana poprzez rozwój mikroskopii przyżyciowej (IVM), która otworzyła drzwi do badania kluczowych pytań biologicznych w dziedzinach takich jak neurobiologia, immunologia i biologia nowotworów ³. Do tej pory większość badań opartych na IVM przeprowadzono na poziomie tkanek i pojedynczych komórek, nie dostarczając żadnych informacji na temat dynamiki kompartmentów subkomórkowych. Ostatnio nasze laboratorium i inne opracowały techniki IVM zdolne do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych gryzoni ^{4-7, 13-15} i umożliwiające manipulacje farmakologiczne i genetyczne in vivo. Podejście to zostało przez nas wykorzystane do badania transportu błonowego in vivo, a dokładniej endocytozy i regulowanej egzocytozy ^6,7.

Nasz eksperymentalny system modelowy opiera się na ekspozycji, stabilizacji i obrazowaniu podżuchwowych gruczołów ślinowych (SG) znieczulonych gryzoni. Wybór SG jako narządu modelowego dla IVM wynika z faktu, że gruczoły są łatwo dostępne po wykonaniu drobnej operacji, mogą być eksternalizowane bez uszczerbku dla ich fizjologii i stabilizowane w celu zmniejszenia artefaktów ruchowych spowodowanych biciem serca i oddychaniem. Ponadto SG mogą być selektywnie manipulowane genetycznie poprzez wstrzykiwanie wektorów wirusowych lub niewirusowych przez przewód ślinowy ^8,9. Wreszcie, SG to gruczoły zewnątrzwydzielnicze zbudowane ze spolaryzowanych komórek nabłonkowych, które tworzą acini i przewody, komórki mioepitelialne i złożoną populację komórek zrębu. Z tego powodu są doskonałym modelem do badania egzocytozy, endocytozy, dostarczania genów i cytoszkieletu aktynowego, jak podkreślono w naszych ostatnich badaniach ¹⁰, a także oferują możliwość badania aspektów biologii komórki, takich jak polaryzacja komórki, podział komórki, połączenia komórka-komórka i kanały jonowe.

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół obrazowania do osiągnięcia subkomórkowej rozdzielczości w nabłonku SG żywej myszy. W szczególności pokazujemy, jak obrazować ziarnistości wydzielnicze w komórkach groniastych SG podczas regulowanej egzocytozy. Jak wykazano wcześniej, po stymulacji agonistami receptora beta-adrenergicznego, ziarnistości wydzielnicze łączą się z wierzchołkową błoną plazmatyczną i stopniowo zapadają się, uwalniając swoją zawartość do kanalików groniastych ⁶. Naszym celem jest dostarczenie podstawowych narzędzi badaczom z minimalnym doświadczeniem w zabiegach chirurgicznych i obchodzeniu się ze zwierzętami, tak aby mogli z powodzeniem wykonywać IVM w rozdzielczości subkomórkowej. Ponieważ najtrudniejszą częścią IVM jest przygotowanie zwierzęcia, tutaj skupiamy się na opisie podstawowych procedur chirurgicznych, które są wykorzystywane do odsłonięcia i unieruchomienia SG bez uszczerbku dla ich funkcji. Jeśli chodzi o procedury znakowania struktur subkomórkowych, kilka strategii, takich jak ogólnoustrojowe dostarczanie sond fluorescencyjnych, wykorzystanie zwierząt transgenicznych lub kombinacja obu, zostało opisanych w innym miejscu ^7,11.

Protokół

Część 1: Mikroskop i przygotowanie zestawu do obrazowania

1. Każdy odwrócony mikroskop konfokalny powinien być odpowiedni do IVM. W pracy wykorzystano mikroskop odwrócony Olympus IX81, wyposażony w laserowy skaningowy zespół konfokalny Fluoview-1000. Aby osiągnąć najlepszą możliwą rozdzielczość, zaleca się stosowanie obiektywów o wysokiej NA, takich jak zanurzenie w wodzie UPLSAPO 60x/1.20 NA i zanurzenie w oleju Plan-Apo 60x/1.42 NA. Obiektywy immersyjne z olejkiem mają wyższą skuteczność zbierania i chociaż wymagają użycia szkiełka nakrywkowego między tkanką a obiektywem, zapewniają lepszą jakość obrazowania, gdy są używane do obrazowania obszarów w odległości 15-20 μm od powierzchni. Dodatkowo zastosowanie oleju eliminuje obawy o parowanie wody podczas dłuższych sesji obrazowania. Aby utrzymać temperaturę i wilgotność, mikroskop powinien być całkowicie zamknięty i zasilany ciepłym i nawilżonym powietrzem. Alternatywnie, zwierzę, stolik mikroskopowy i obiektyw muszą być ogrzane w inny sposób. Na przykład chemiczne poduszki grzewcze mogą być używane do zwierzęcia i sceny, a specjalnie zaprojektowane grzejniki obiektywowe mogą być używane do obiektywu (rysunek 1A). Grzałka obiektywu powinna być włączona na 30 minut przed rozpoczęciem zabiegu. Uwaga: gdy poduszki grzewcze są używane do utrzymywania zwierzęcia w cieple, gaza musi zostać umieszczona między podkładką a skórą. Skóra musi być monitorowana pod kątem oparzeń.
2. Standardowe stoliki w większości dostępnych na rynku mikroskopów konfokalnych mają otwór, który służy do wkładania różnych uchwytów, które są używane do pasowania szkiełek, szalek Petriego i płytek o różnych rozmiarach. W celu wykonania IVM standardowa wkładka stolika dla szalek Petriego o średnicy 35 mm jest odwrócona do góry nogami, przykryta szkiełkiem o średnicy 40 mm, która jest następnie zabezpieczana wysokopróżniowym smarem silikonowym lub taśmą maskującą (rysunek 1A). Wkładka niestandardowa może być również wykonana z płyty aluminiowej o grubości 3 mm. Szklana powierzchnia jest następnie czyszczona 70% etanolem i przecierana za pomocą Kimwipe.
3. Wyprodukuj niestandardowy uchwyt do unieruchomienia SG (stabilizatora). Zadaniem uchwytu jest ustabilizowanie SG na miejscu i sztywne połączenie ich ze stolikiem i szkiełkiem nakrywkowym. Uchwyt może być wykonany z plastikowej szalki Petriego o średnicy 60 mm. Najpierw dno naczynia odłamuje się od ścianek i kroi na prostokąty o wymiarach około 15 x 10 mm. Następnie krawędzie są zaokrąglane i polerowane za pomocą drobnego papieru ściernego. Cztery przekładki (1,5-2 mm) są budowane poprzez usunięcie gumowych końcówek tłoków strzykawek o pojemności 1 ml. Za pomocą drobnego papieru ściernego powierzchnia przekładek i cztery rogi plastikowego elementu są polerowane. Przekładki są następnie klejone za pomocą galaretowatego kleju superglue, a następnie wygładzane drobnym papierem ściernym na płaskiej powierzchni. Należy pamiętać, że w przypadku starszych zwierząt może być konieczne zwiększenie rozmiaru uchwytów i przekładek, aby pomieścić nieco większe gruczoły.
4. Przygotowanie żelu do sprzęgania optycznego. 0,3% żelu Carbomer-940 (Tabela 2) przygotowuje się przez podgrzanie 100 ml ultraczystej wody i rozpuszczenie 5,47 g D-Sorbitolu. Następnie dodaje się 0,3 g Carbomer-940. Zlewkę należy przykryć i umieścić na mieszającej płycie grzejnej (najniższe ustawienie grzania) na kilka godzin lub do momentu, gdy wszystkie grudki karbomeru całkowicie się rozpuszczą. Na koniec trietanolaminę dodaje się kroplami, delikatnie mieszając, aż do osiągnięcia pH około 7,4. Żel jest przechowywany w temperaturze 4 °C ¹³.

Część 2: Zwierzęta i znieczulenie

1. Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek eksperymentów na zwierzętach protokoły powinny zostać zatwierdzone przez lokalną komisję ds. opieki nad zwierzętami i etyki. Co ważne, badacze powinni być odpowiednio przeszkoleni w zakresie wykonywania zabiegów chirurgicznych i przed przystąpieniem do zabiegu powinni skonsultować się z lokalną komisją ds. opieki nad zwierzętami lub lekarzem weterynarii.
2. W tym badaniu wykorzystano model mysi (GFP / mTomato-mouse) uzyskany przez skrzyżowanie myszy FVB z ekspresją rozpuszczalnego GFP (GFP-mouse) z myszami C57B6 wykazującymi ekspresję ukierunkowanego na błonę peptydu połączonego z fluorescencyjnym białkiem tandem-Tomato (mTomato-mouse) ⁶. Uwaga: zwykle potrzeba 20-30 minut, aby zwierzę zostało w pełni znieczulone i przygotowane do obrazowania
3. Myszy są trzymane w kontrolowanym środowisku w pomieszczeniu dla zwierząt i mogą się zaaklimatyzować przez tydzień przed eksperymentem. Ten krok jest konieczny do obrazowania SG, ponieważ każdy niepokój powoduje zwiększoną aktywność wydzielniczą¹². Woda i jedzenie są dostarczane ad libitum. Do eksperymentów obrazowych wykorzystuje się samce w wieku od 2 do 5 miesięcy (20-30 g).
4. Przed znieczuleniem należy zważyć zwierzęta, aby określić odpowiednią dawkę środka znieczulającego.
5. Ponieważ stres wywołany podawaniem środków znieczulających do wstrzykiwań może upośledzać aktywność wydzielniczą SG, należy wywołać znieczulenie wstępne przez inhalację izofluranu, a następnie wstrzyknięcie środków znieczulających. W tym celu należy bardzo delikatnie umieścić myszy w komorze parownika i włączyć przepływ tlenu (800-900 mmHg). Ustaw poziom izofluranu na 3%, aby rozpocząć indukcję przed znieczuleniem.
6. Gdy zwierzęta stracą przytomność, wstrzyknąć mieszaninę 100 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny do jamy otrzewnowej (igła 25 G). Środki znieczulające są świeżo przygotowywane przez rozcieńczenie 100 mg/ml ksylazyny do 20 mg/ml w soli fizjologicznej, a następnie zmieszanie jej z ketaminą. Mieszaninę tę rozcieńcza się następnie w stosunku 1:1 solą fizjologiczną i wstrzykuje odpowiednią ilość w zależności od masy ciała zwierzęcia. To rozcieńczenie pomaga w zapobieganiu przypadkowemu przedawkowaniu. Należy pamiętać, że mieszanina traci swoją skuteczność po 20 minutach.
7. Należy obserwować zwierzęta pod kątem oznak czuwania i wstrzykiwać większą ilość mieszanki znieczulającej, jeśli wychodzą z narkozy (około 75% dawki początkowej w ciągu 45 minut po pierwszym wstrzyknięciu i 50% co godzinę po wstrzyknięciu). Sprawdzaj głębokość znieczulenia co 15 minut, szczypiąc łapę i obserwując reakcję. Uwaga: Zawsze podawaj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
8. Środki znieczulające wywołują hipotermię, która może wpływać na powtarzalność eksperymentów i zdrowie zwierzęcia. Dlatego myszy powinny być trzymane pod lampą grzewczą lub na podgrzewanej podkładce przez cały czas trwania eksperymentu. Uwaga: lampa grzewcza powinna znajdować się co najmniej 12-18 cali od zwierzęcia, aby zapobiec poparzeniu
9. Temperatura ciała zwierząt musi być monitorowana za pomocą termometru wyposażonego w sondę temperatury w odbycie.

Część 3: Chirurgia zwierząt i pozycjonowanie w mikroskopii przyżyciowej

1. Przygotuj miejsce pracy ze wszystkimi narzędziami chirurgicznymi (Tabela 1), które powinny być czyste i sterylne.
2. Ogol obszar szyi myszy za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Przetrzyj brzuszną stronę szyi znieczulonej myszy gąbką z gazy nasączoną 70% etanolem. Osusz nadmiar chusteczką Kimwipe.
3. Za pomocą zakrzywionej pęsety podnieś mały kawałek skóry w linii środkowej (mniej więcej na dolnym końcu mięśni żwaczy) i wykonaj małe nacięcie (ryc. 1B).
4. Włóż nożyczki do otworu i oddziel skórę od leżącej pod nią tkanki, otwierając ostrza nożyczek. Unikaj uszkadzania leżącej poniżej tkanki gruczołowej, kierując nożyczki w górę w kierunku spodu skóry. Powtórz ten krok kilka razy, aż skóra zostanie oddzielona od głębszych tkanek (ryc. 1B).
5. Za pomocą nożyczek wytnij pasek poluzowanej skóry o szerokości około 3 mm i długości 10 mm. Skórę należy przeciąć tak, aby otwór zaczynał się w pobliżu podstawy SG, gdzie nerw, przewód i naczynia krwionośne łączą gruczoł z resztą ciała. Po oczyszczeniu obszaru rany, powstały otwór będzie miał owalny kształt i wymiary około 8 x 12 mm. Oba SG będą widoczne po otwarciu (Rysunek 1B).
6. Za pomocą strzykawki nałóż żel sprzęgający optyczny na środek nacięcia i wytrzyj go na zewnątrz sterylną gazą. Do każdej chusteczki należy używać czystych kawałków gazy, aby zapobiec przedostawaniu się włosów lub krwi do odsłoniętej tkanki. Powtarzaj ten krok, aż cała krew i luźne włosy zostaną usunięte.
7. Za pomocą pęsety #7 oddziel tkankę łączną od prawego gruczołu podżuchwowego aż do podstawy gruczołu (alternatywnie ten protokół można zastosować na lewym SG). Najpierw znajdź końcówkę SG i chwyć tkankę łączną kilka milimetrów powyżej czubka gruczołu. Rozerwij tkankę łączną wokół gruczołu, nie uszkadzając miąższu. (Rysunek 1B). Po odsłonięciu gruczołu delikatnie oddziel tkankę łączną od gruczołu. Jeśli wystąpi krwawienie, zmyj krew solą fizjologiczną. Upewnij się, że wszystkie tkanki łączne są oddzielone, a gruczoł jest całkowicie odsłonięty. Utrzymuj gruczoł wilgotny, regularnie nakładając żel do sprzęgania optycznego.
8. Przed przyniesieniem zwierzęcia do mikroskopu należy umieścić gruby kawałek gazy i pakiet grzewczy na stoliku mikroskopu, aby utrzymać temperaturę 38 ± 2 °C. Temperaturę chemicznego pakietu grzewczego można regulować w zależności od wielkości nacięć, które wystawiają wewnętrzną torebkę na działanie atmosfery. Gaza zapewnia pewną izolację pakietu grzewczego od etapu metalowego. Przykryj również górną część opakowania grzewczego cienkim kawałkiem gazy.
9. Ułóż zwierzę na boku (prawa strona dla prawego gruczołu) i na gazie. Umieść zwierzę tak, aby gruczoł ślinowy podżuchwowy znajdował się pośrodku szkiełka nakrywkowego (ryc. 1C).
10. Zwierzę powinno być zabezpieczone i ustabilizowane w tej pozycji przed unieruchomieniem gruczołu. Umieść kawałek taśmy maskującej po brzusznej stronie przedniej prawej łapy myszy. Zaczep siekacze myszy jedwabnym szwem (ryc. 1C, wstawka). Stwórz pewne napięcie między jedwabną nicią a łapą i przymocuj je do sceny za pomocą taśmy maskującej. SG powinien spoczywać naturalnie w środku szkiełka nakrywkowego. Głowa i klatka piersiowa powinny być dodatkowo stabilizowane plastikowymi klinami, które można połączyć ze sceną.
11. Umieść mały kawałek chusteczki do czyszczenia soczewek na gruczole (Rysunek 1C). Lekko rozciągnij dławik i umieść niestandardowy uchwyt na dławiku. Mocno przymocuj stabilizator do sceny za pomocą taśmy maskującej. Sprzężenie można poprawić za pomocą metalowego zacisku podłączonego do stolika (rysunek 1C). Należy unikać napięć i ostrych kątów, ponieważ mogą one utrudniać przepływ krwi. Natychmiast po ustabilizowaniu należy sprawdzić przepływ krwi, badając gruczoł wizualnie (powinien zachować różowe zabarwienie) lub przez epifluorescencję. U myszy z GFP/m-pomidorem można łatwo ocenić poważne zmiany w przepływie krwi, ponieważ zarówno naczynia krwionośne, jak i kilka komórek krwi są oznaczone m-pomidorem.
12. Przykryj zwierzę gazą i podgrzewaną podkładką. Zmierz temperaturę odsłoniętego dławika za pomocą termometru wyposażonego w małą elastyczną sondę termopary umieszczoną w kontakcie z jedną stroną odsłoniętego dławika.

Część 4: Parametry obrazowania

1. Korzystając z oświetlenia epifluorescencyjnego, skoncentruj się na powierzchni gruczołu za pomocą GFP lub zestawu filtrów RFP. Znajdź powierzchnię SG i oceń przepływ krwi w naczyniach włosowatych oraz ogólną morfologię tkanki. Oznaki uszkodzenia tkanek obejmują pęcherzenie błony lub pojawienie się dużych wakuoli.
2. Oceń stabilność tkanki za pomocą epifluorescencji lub wstępnego skanowania wybranego obszaru. Stabilne przygotowanie jest niezbędne, ponieważ większości artefaktów ruchu nie można usunąć ani skorygować w analizie danych po przetworzeniu. Jeśli preparat nie jest stabilny, wymagane są regulacje.
3. Aby znaleźć właściwy obraz płaszczyzny ogniskowej, gruczoły są w trybie wstępnego skanowania (1-krotny zoom) i stopniowo przesuwaj obiektyw w kierunku szkiełka nakrywkowego, aż struktury groniaste, granulki wydzielnicze i błona plazmatyczna staną się wyraźnie widoczne (ryc. 2).
4. Parametry obrazowania dla filmu poklatkowego zależą od indywidualnego eksperymentu. Aby zobrazować dynamikę granulek wydzielniczych, należy użyć prędkości skanowania 0,5-2 sek./klatkę i 256 x 256 pikseli ze skalą przestrzenną 0,2 μm/piksel (pole widzenia około 50 μm x 50 μm). W celu optymalnego uwidocznienia granulek i błony plazmatycznej, grubość optyczną należy ustawić w zakresie 0,9-1,2 μm. Aby wzbudzić GFP i tandem-Tomato, można użyć długości fali odpowiednio 488 nm i 561 nm. Moc szczytowa wynosi około 0,5 mW dla długości fali 488 nm i 1 mW dla długości fali 561 nm. Zapewnia to minimalne fotowybielanie.
5. Ustawienia detektora muszą być dostosowane, aby utrzymać sygnał w zakresie dynamicznym i zależeć od jasności próbki.
6. Po ustawieniu wszystkich parametrów można rozpocząć obrazowanie. Najpierw zrób migawkę pola widzenia, które ma być używane jako punkt odniesienia. Podczas obrazowania poklatkowego może wystąpić dryf tkanki w XY i Z. Można to skompensować ręcznie, dostosowując obszar skanowania i pozycję Z. Korekty powinny być dokonywane stopniowo i małymi krokami, aby uniknąć artefaktów. Co więcej, obraz referencyjny może być wykorzystany do określenia, czy występuje fotowybielanie. W przypadku wykrycia znacznego fotowybielania (zmniejszenie fluorescencji o ponad 15-20%) należy zmniejszyć moc lasera o 0,1 mW.
7. W celu pobudzenia egzocytozy należy wstrzyknąć podskórnie 0,1 mg/kg świeżo przygotowanego roztworu izoproterenolu w roztworze soli fizjologicznej. Egzocytoza jest wywoływana po około 1 minucie od wstrzyknięcia. Granulki wydzielnicze łączące się z błoną plazmatyczną zostaną wykryte przez wzrost fluorescencji GFP wokół granulek i dyfuzję peptydów tandemowych pomidorów do ich błon ograniczających (ryc. 3). Zalecamy wykonanie 3-4 sekwencji poklatkowych w tym samym obszarze, każda po 10 minut.
8. Po sesji obrazowania należy poddać znieczulone zwierzę eutanazji poprzez wdychanie CO₂ w komorze eutanazyjnej (10-12 mmHg przez 10 min).

Wyniki

U myszy GFP/mTomato, acini pojawiają się jako wyraźnie odrębne struktury, które wyrażają cytozolowy GFP i ukierunkowany na błonę peptyd tandem-Tomato (Rysunek 2, linia przerywana). W poszczególnych acinach komórki groniaste są wyznaczane przez peptyd tandemowy pomidorowy. GFP wykrywa się również w jądrach, które są wyraźnie widoczne wewnątrz komórek groniastych (ryc. 2, strzałki). Cytozolowy GFP jest wykluczony z granulek wydzielniczych, które pojawiają się jako ciemne okrągłe pęcherzyki...

Dyskusja

Do tej pory struktury subkomórkowe były obrazowane głównie w systemach modelowych in vitro (tj. hodowle komórkowe) lub ex vivo (tj. hodowle narządów, wycinki tkanek, preparaty groniaste), które często nie oddają cech nienaruszonych żywych tkanek ⁶. Pod tym względem przedstawione tutaj podejście stanowi duży przełom, ponieważ umożliwia obrazowanie dynamiki określonego etapu transportu błonowego (tj. regulowanej egzocytozy) u żywych myszy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
odczynnik
Isoflourane (Forane)	Baxter	101936-40	Uchwyt pod kapturem chemicznym
Ketamina (ketaved)	Fort Dodge Animal Health	57457-034-10	Roztwór podstawowy 100 mg/ml
Ksylazyna (Anased)	Akorn, Decatur	61311-481-10	Roztwór podstawowy 100 mg/ml
Neomycyna/Polimyksyna B	Bausch i Lomb	24208-785-55	Służy do smarowania oka myszy
Carbomer-940	Ashalnd, Inc.	4607-1
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
Trietanoloamina	Sigma-Aldrich	90279	Dodawać kroplami, aby zapobiec zestaleniu się roztworu
Isoproternol	Sigma-Aldrich	16504	W razie potrzeby przygotować świeże roztwory w soli fizjologicznej. Zapasy mogą być przechowywane w temperaturze -20 ° C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (waporyzator)	Braintree Scientific	190AF
Przenośny stół zstępujący wyposażony w filtr HEPA	Hazard Technology	PDDT
Lampa grzewcza, model HL1	Braintree Scientific	HL-1 US
MicroTherma 2T Termometr	Braintree Scientific	TW2
Nożyczki operacyjne (11,5 cm proste	World Precision Instruments	5003708-12
#7 pęseta z zakrzywioną końcówką	World Precision Instruments	14187
Mikronożyczki	World Precision Instruments	503365
pleciony jedwabny szew #4.0	George Tiemann Co	160-1219-4
Gąbki z gazy 2 "x 2"	Tyco Healthcare	9022
Chusteczka do czyszczenia soczewek	Olympus	CL-TISSUE (M97) AX6476