Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Podsumowanie

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Streszczenie

3D DNA FISH stało się głównym narzędziem do analizy trójwymiarowej organizacji jądra, a kilka wariantów tej techniki zostało opublikowanych. W tym artykule opisujemy protokół, który został zoptymalizowany pod kątem solidności, powtarzalności i łatwości użycia. Jaskrawo fluorescencyjne, bezpośrednio znakowane sondy są generowane przez translację nacięcia z amino-allilUTP, a następnie chemiczne sprzężenie barwnika. 3D DNA FISH przeprowadza się przy użyciu etapu zamrażania i rozmrażania w celu przenikania komórek oraz etapu ogrzewania w celu jednoczesnej denaturacji sondy i jądrowego DNA. Protokół ma zastosowanie do wielu typów komórek i różnych sond (BAC, plazmidy, fosmidy lub farby całych chromosomów) i pozwala na automatyczne obrazowanie o wysokiej przepustowości. Za pomocą tej metody rutynowo badamy lokalizację jądrową do trzech regionów chromosomowych.

Wprowadzenie

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (DNA FISH) pozwala na trójwymiarową wizualizację pojedynczych loci genów, domen subchromosomalnych, a nawet całych chromosomów na wszystkich etapach cyklu komórkowego. 2D FISH jest używany do badań metafazowych, podczas gdy 3D FISH jest szeroko stosowany do badania związku między organizacją przestrzenną genomu a jego funkcją podczas interfazy (^1,2 i zawarte w nich odniesienia). Historycznie rzecz biorąc, badania koasocjacyjne prowadzono poprzez badanie dziesiątek do setek indywidualnych loci za pomocą FISH. Niedawno^opracowano potężne, wysokoprzepustowe techniki oparte na 3C, takie jak 4C i Hi-C3, które pozwalają na badanie wzajemnych przesłuchów molekularnych między wieloma tysiącami różnych loci. Chociaż techniki oparte na 3C i DNA FISH mogą być metodami uzupełniającymi, niekoniecznie odpowiadają na te same pytania. Metody oparte na 3C zapewniają całościowy odczyt mieszanych populacji komórek, co skutkuje prawdopodobieństwem koasocjacji. W przeciwieństwie do tego, mimo niskiej przepustowości, techniki oparte na projekcie FISH oferują możliwość analizy przestrzennego rozmieszczenia loci lub chromosomów w poszczególnych komórkach zgodnie z ich etapami rozwoju lub cyklu komórkowego. W związku z tym FISH będzie nadal ważnym narzędziem do badania zależności między strukturą jądrową a funkcją.

Są dwie główne kwestie, które należy wziąć pod uwagę przy przeprowadzaniu udanych eksperymentów 3D FISH. To są; 1. Uzyskanie optymalnie oznakowanych sond i 2. wybór leczenia komórkowego, w tym utrwalanie, etapy przed i po hybrydyzacji, w celu zachowania morfologii jądrowej w jak największym stopniu, przy jednoczesnym zapewnieniu wystarczającej dostępności DNA do hybrydyzacji sondy. Wydajne etykietowanie sond ma kluczowe znaczenie dla FISH. Tradycyjnie, translacja nicków była używana do wprowadzania nukleotydów sprzężonych z haptenem lub fluoroforem⁴. Podobnie, dostępne są komercyjne zestawy do translacji nacięć do bezpośredniej indukcji haptenów lub fluoroforów, ale także do dwuetapowego znakowania przy użyciu nukleotydów aminoallilowych i barwników reagujących z aminami. To ostatnie sprawia, że wprowadzanie barwnika jest bardziej wydajne, dając polimerazie DNA mniej masywną cząsteczkę do pracy. Niedawno opracowano zestawy do nieenzymatycznego znakowania DNA, które wykorzystują koordynacyjne wiązanie platyny z kwasami nukleinowymi. Sondy FISH można nawet kupić już oznaczone^{jako 5}. Chociaż zestawy i sondy produkowane komercyjnie bez wątpienia zapewniają łatwość użytkowania, są one znacznie droższe niż kupowanie pojedynczych komponentów i produkcja sond we własnym zakresie. Zoptymalizowaliśmy tani protokół translacji nicków, aby bezpośrednio oznaczyć wiele różnych sond BAC w wielu kolorach. Odkryliśmy, że uzyskanie wysoce czystego DNA BAC ma kluczowe znaczenie i skutkuje wymaganiem tylko 10-20 ng sondy na szkiełko FISH, w porównaniu do 10-20 razy więcej, gdy stosuje się zanieczyszczone matrycowe DNA, co skutkuje znacznymi oszczędnościami kosztów i czasu. Zastosowanie amino-allyldUTP pozwala na elastyczne znakowanie sond dostępnymi barwnikami aminowo-reaktywnymi (np. Alexa Fluor lub Cy-dyes) lub haptenami (np. biotyna, digoksygenina). Sondy znakowane haptenem są wykrywane przez przeciwciała sprzężone z fluoroforem lub streptawidynę w celu wzmocnienia i wizualizacji sygnału. Jasne, bezpośrednio znakowane sondy na ogół wykazują mniejsze zabarwienie tła i unikają nadmiernego wzmacniania sygnałów, co skutkuje dokładniejszym odwzorowaniem lokalizacji jądrowej i morfologii locus.

Istnieje kilka różnych technik FISH, które wykorzystują różne utrwalacze, obróbkę wstępną i płukanie po hybrydyzacji, ale zazwyczaj dzielą się one na następujące kategorie: utrwalanie aldehydu glutarowego z denaturacją NaOH, wiązanie formaldehydu z denaturacją HCl i wiązanie formaldehydu z denaturacją termiczną^6-9. Każdy z nich ma zalety i wady. Wiązanie aldehydu glutarowego powoduje dobrą konserwację struktury jądrowej, ale wymaga traktowania środkami redukującymi w celu zminimalizowania powstałej autofluorescencji, a obróbka NaOH musi być dokładnie kontrolowana, aby zrównoważyć wystarczającą denaturację DNA i potencjalne uszkodzenie struktury jądrowej⁶. Wiązanie formaldehydu jest mniej silne, co zwiększa prawdopodobieństwo zaburzeń architektury jądrowej, ale także zazwyczaj daje silniejsze i bardziej wiarygodne sygnały oraz niższą autofluorescencję⁹. Leczenie HCl oczyszcza DNA i usuwa białka, zapewniając dobry dostęp do DNA dla sond, ale może również powodować pęknięcia DNA. Ogrzewanie fizycznie oddziela dwie nici DNA, co skutkuje dobrą hybrydyzacją docelową i silnymi sygnałami, ale może powodować pewne zaburzenia struktury jądrowej⁸. Stopień, w jakim każda z tych technik wpływa na epitopy białek, jest bardzo zróżnicowany^6,9 , co powoduje konieczność eksperymentalnego określenia dla każdego białka optymalnego protokołu do zastosowania w eksperymentach immuno-FISH.

Chociaż nie ma 'idealnej' techniki DNA FISH, wszystkie mogą być użyteczne, jeśli są dobrze kontrolowane. Naszym celem była optymalizacja protokołu dla solidnego i powtarzalnego DNA FISH w celu zbadania przestrzennego pozycjonowania wielu loci w różnych typach komórek¹⁰, koncentrując się na metodzie ogrzewania w celu uzyskania najbardziej wiarygodnych sygnałów. Dzięki temu oraz zastosowaniu zautomatyzowanego systemu obrazowania dążyliśmy do zwiększenia przepustowości analizy pojedynczych komórek w układach jądrowych.

Protokół

1. Generowanie bezpośrednio znakowanych sond DNA przez Nicka Tłumaczenie

Uwaga: Bezpośrednio oznaczone sondy wykonane z BAC (100-250 kb) konsekwentnie wytwarzają jasne sygnały. Jeśli wymagane są mniejsze sondy, użyj fosmidów (40-50 kb) lub nawet plazmidów zawierających wstawki 5-10 kb. Zidentyfikuj klony BAC lub fosmid odpowiadające określonym genomom za pomocą przeglądarek genomów Ensemble lub UCSC. Przygotuj wysokiej jakości DNA BAC przez wielokrotne wytrącanie lub użyj dostępnych na rynku zestawów. Im mniej preparat jest zanieczyszczony bakteryjnym genomowym DNA, tym mniej sondy jest wymagane na szkiełko. Znakowanie należy wykonać w dwóch etapach: translacja nicków wprowadzająca aminoallil-dUTP oraz chemiczne sprzężenie barwnika reagującego aminie.

1.1. Tłumaczenie Nicka

Podczas translacji nicków, DNase I jest używana do tworzenia jednoniciowych podziałów. Polimeraza DNA I wydłuża 3' końce tych "nacięć", zastępując istniejące nukleotydy nowymi, "translując" w ten sposób nacięcie, a tym samym dając możliwość włączenia znakowanych nukleotydów. Aminoallyl-dUTP jest wybierany ze względu na efektywną inkorporację przez polimerazę DNA I i jej potencjał do późniejszego sprzężenia chemicznego z barwnikami lub haptenami reagującymi z aminami. Kluczowe znaczenie ma osiągnięcie właściwej równowagi między nacinaniem DNazy I a translacją polimerazy DNA I; zbyt duża ilość DNazy I spowoduje nadmierne trawienie DNA, dając niską wydajność i krótkie rozmiary fragmentów, zbyt mała nie wytworzy wystarczającej ilości nacięć, aby polimeraza mogła zainicjować translację, dając duży rozmiar fragmentu i słabe włączenie aminoallilo-dUTP. Poniższy protokół działa dobrze, ale może być konieczne miareczkowanie DNAzy I z różnych partii lub różnych producentów.

1. Ustawić reakcję etykietowania na lodzie i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 16 °C. Powinno to wytworzyć 0,5-1 μg DNA z translacją nicków i można je skalować. Rozcieńczyć DNazę I w stosunku 1:30 w buforze DNazy I (tj. 0,3 U/μl).

składnik Koncentracja zapasów Objętość lub ilość DNA BAC (komórka BAC)   5-10 μg Bufor NTB 10x 5 μl Naziemna telewizja cyfrowa 0,1 mln 5 μl Mieszanie dNTP 10x 5 μl Aminoallil-dUTP 0,5 mM 6 μl Polimeraza DNA I 10 U/μl 1 μl DNaza I 10 U/μl 1 μl (w rozcieńczeniu 1:30) H₂O   do 50 μl

2. Uruchom 1 μl na 2% żelu agarozowym, aby sprawdzić wielkość oznaczonych fragmentów. Podczas uruchamiania żelu utrzymuj reakcję na lodzie. Udana translacja nicków spowoduje rozmazanie z większością fragmentów o długości od 150 do 700 pz z niektórymi większymi fragmentami o wielkości ~1 kb (KROK KRYTYCZNY: patrz Reprezentatywne wyniki). W razie potrzeby dodać kolejny 1 μl świeżego rozcieńczenia DNazy I w stosunku 1:30 i inkubować w temperaturze 16 °C przez 15-30 minut. Czas inkubacji będzie się różnił w zależności od ilości i jakości DNA BAC.
3. Dezaktywować DNazę I przez ogrzewanie do 75 °C przez 10 min.
4. Oczyść DNA zmodyfikowane aminami za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Eluować w 100 μl H₂O.
5. Etanol wytrąca DNA przez dodanie 10 μl 3 M NaOAc (pH 5,2) i 275 μl etanolu. Pozostawić w temperaturze -20 °C na co najmniej 1 godzinę lub na noc. Wirować z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Umyć granulat 500 μl 70% etanolu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Ten krok usuwa aminy śladowe, które będą zakłócać reakcję znakowania. Zawiesić osad w 6 μl H₂O na 1x początkowa reakcja.
6. Użyj 1 μl, aby oznaczyć stężenie DNA zmodyfikowanego aminami za pomocą mikroobjętościowej spektroskopii UV.

1.2. Sprzężenie barwnika fluorescencyjnego

Fluorescencyjne oznakowanie sondy odbywa się poprzez chemiczne sprzężenie barwnika. Barwniki estrowe sukcynimidylowe Alexa Fluor reagują z aminami zmodyfikowanego DNA amino-allildUTP, tworząc wiązanie kowalencyjne, wytwarzając w ten sposób bezpośrednio znakowane sondy. Barwniki Alexa Fluor 488, 555 i 647 okazały się skuteczne w tym procesie.

1. Dodać 4 μg DNA zmodyfikowanego aminoallilem do objętości 5 μl, podgrzać do 95 °C przez 5 minut, schłodzić na lodzie i dodać 3 μl 0,2 M NaHCO₃.
2. Rozpuścić jedną podwielokrotność barwnika reagującego z aminami w 2 μl bezwodnego DMSO w temperaturze pokojowej. Dodać 8 μl zmodyfikowanego DNA z NaHCO₃, wirować, wirować pulsacyjnie i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.

Uwaga: Barwniki reagujące aminami mogą być używane do oznaczania więcej niż jednej sondy w oparciu o następujący schemat. Ponieważ na etykietowanie szkiełek używa się tylko 10-20 ng sondy, 1 μg wystarcza na 50-100 szkiełek. Możliwe jest również przechowywanie DNA modyfikowanego aminami do przyszłych reakcji znakowania w temperaturze -20 °C.

Ilość DNA Objętość DNA 0,2 mln NaHCO₃ Objętość barwnika łączny Wystarcza na 4 x 1 μg 1,25 μl każdy 0,75 μl każdy 0,5 μl każdy 2,5 μl (1/4) 50-100 slajdów każdy 3 x 1,35 μg 1,67 μl każdy 1 μl każdy 0,67 μl każdy 3,34 μl (1/3) 65-130 zjeżdżalni każdy 2 x 2 μg 2,5 μl każdy 1,5 μl każdy 1 μl każdy 5 μl (1/2) 100-200 slajdów każdy 1 x 4 μg 5 μl 3 μl 2 μl 10 μl (pełny) 200-400 slajdów

3. Dodać 90 μl_H2Oi oczyścić znakowaną sondę za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Elutować w 100 μl 10 mMTris-Cl (pH 8,5).
4. Określ stężenie sondy i skuteczność etykietowania za pomocą mikroobjętościowej spektroskopii pełnego spektroskopii (patrz rysunek 2) przy użyciu równań Beera-Lamberta (instrukcje znajdują się w karcie katalogowej dołączonej do barwników reaktywnych Alexa Fluor lub można je znaleźć w Internecie). Dobrze sprawdzają się sondy zawierające 3-6 barwników na 100 pz. Sondy o niższym stopniu wbudowania mogą dawać słabe sygnały FISH. Alternatywnie, przelej 5 μl na 2% żel agarozowy bez barwienia DNA i sprawdź zawartość barwnika fluorescencyjnego za pomocą fosfoimagera. Po wybarwieniu żelu bromkiem etydyny lub alternatywami do barwienia DNA i porównać znakowane DNA z całkowitym DNA.

2. DNA RYBA

Poprzez następujące kroki, interesujące komórki są przytwierdzane do slajdów i przenikane. DNA komórkowe i bezpośrednio znakowane sondy są następnie denaturowane razem na gorącej płycie i hybrydyzowane przez noc w szczelnej, wilgotnej komorze.

2.1. Dzień 1

1. Sonda Opady
   nuta: Wytrącić sondy w pewnym momencie dnia 1. Można to wygodnie przeprowadzić równolegle z leczeniem komórek i nie trzeba tego robić na początku dnia.
   1. Wymieszaj 10-20 ng bezpośrednio znakowaną sondę, 6 μl C₀t-1 DNA (6 μg), 1 μl jednoniciowego DNA z jąder łososia (9,7 μg) i dostosuj objętość do 100 μl wodą.
   2. Dodać 10 μl 3 M NaOAc i 275 μl EtOH i wymieszać przez wirowanie. Wytrącać się przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -20 °C.
   3. Wirować w mikrofugach z maksymalną prędkością przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć granulat 70 % EtOH i ponownie odwirować. Suchy osad i ponownie zawiesić w 5 μl dejonizowanego formamidu. Zawiesić ponownie na 30 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 1000 obr./min, chronić przed światłem (umieścić folię na termomikserze).
   4. Dodać 5 μl mieszaniny siarczanu dekstranu i wstrząsać przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C, ponownie chroniąc przed światłem. Pipetować w górę i w dół tuż przed pipetowaniem na szkiełko nakrywkowe.
      nuta: Do malowania chromosomów w połączeniu z sondami BAC wygodną opcją są sondy do malowania całych chromosomów, które są dostarczane w postaci gotowej do użycia mieszanki hybrydyzacyjnej. Zawiesić wytrąconą sondę BAC (z DNA C_{, 0}t1 i jednoniciowym DNA z jąder łososia) w mieszance farb chromosomowych o objętości 10 μl, pipetując w górę iw dół. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 300–500 obr./min przez 10 minut. Użyj 10 μl farby chromosomowej / mieszanki sondy BAC na miejsce.
2. Dołączanie komórek do slajdów
   nuta: Skłonność komórek do przylegania do szkiełek znacznie różni się w zależności od typu komórki. Dla każdego typu ogniwa należy empirycznie określić optymalny czas osiadania i gęstość komórek. Aby uzyskać spójne wyniki, komórki powinny znajdować się w zawiesinie pojedynczej komórki.
   Dla ułatwienia użycia zakreśl obszar, na którym komórki zostaną namierzone hydrofobowym pisakiem, chociaż w przypadku komórek ponownie zawieszonych w PBS nie jest to absolutnie konieczne. Bariera hydrofobowa zapobiega rozprzestrzenianiu się zawiesiny na szkiełku, utrzymuje do trzech próbek na szkiełku w stanie ładnie oddzielonych i pozwala na stosowanie bardzo małych objętości roztworu przeciwciał w immuno-FISH. Ponadto obszar wykrywania można ograniczyć do minimum, jeśli liczba komórek jest niska.
3. Komórki wątroby płodu myszy
   1. Zebrać każdą wątrobę płodu myszy E13,5 w około 1,5 ml PBS i ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół. Wirowanie w mikrofugach z prędkością 3 000 obr./min przez 2 min. Powtórz pranie trzy razy. Przy ostatnim myciu przecedź komórki przez sito o grubości 70 μm. Zawieś komórki z jednej wątroby w 160 μl PBS i użyj 50 μ na miejsce. Pozostaw komórki na 2 minuty w temperaturze pokojowej.
4. Mysz ES Komórki
   1. Komórki ES myszy nie przyklejają się łatwo do szkiełka. Na szkiełku zakreśl obszar, na którym zostaną wykryte komórki, za pomocą hydrofobowego pisaka. Przygotować zawiesinę 20 000-50 000 komórek na 80-100 μl w normalnej pożywce hodowlanej, pipetować do kółka i pozostawić na około 3 godziny w wilgotnym inkubatorze. nuta: Alternatywnie, komórki ES mogą być hodowane na szkiełkach, ale wtedy będą tworzyć kolonie, które mogą utrudniać automatyczne obrazowanie.
5. Stałe komórki
   1. Niektóre eksperymenty wymagają użycia stałych komórek, które same nie przyczepiają się do szkiełek. Delikatne wirowanie z prędkością 300 obr./min przez 3 minuty przy użyciu cytowirówki zachowuje trójwymiarową strukturę komórek i zapewnia, że komórki nie odpadają.

Typ komórki Zawieszenie w Czas ustalania komentarz Wątroba płodu myszy Pbs Czas trwania: 2 min Na ławce rezerwowych Mysz ES DMEM z suplementami 4 godz 37 °C w nawilżanym inkubatorze Limfocyty myszy Pbs Czas trwania: 2 min Na ławce rezerwowych Komórki rozrodcze myszy P20 Napraw w rozwiązaniu Cytospin (Cytospin) Na ławce rezerwowych

3. Aby utrwalić komórki, delikatnie zanurz szkiełko w 4% PFA (UWAGA: wykonaj w dygestorium) na 10 minut. Zamocuj komórki za pomocą szkiełka płasko na tacy, aby uzyskać najlepsze zatrzymanie komórek (np. 50 ml 4% PFA w pokrywie pojemnika na końcówki). nuta: Ten krok nie ma zastosowania do komórek ustalonych przed dołączeniem do slajdów.

Do wszystkich kolejnych kroków używaj słoików Coplin o pojemności 50 ml lub 100 ml. Uważaj, aby nie zeskrobać komórek podczas przesuwania szkiełek między słoikami.

4. Hartować w 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Przepuszczalność komórek w 0,1% saponinie/0,1% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Prać dwukrotnie w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Inkubować przez co najmniej 20 minut w 20% glicerolu/PBS w temperaturze pokojowej. Uwaga: W tym momencie szkiełka można przechowywać w 50% glicerolu/PBS w temperaturze -20 °C przez co najmniej kilka tygodni. Zaobserwowano, że przechowywanie przez co najmniej jeden dzień powoduje wzrost siły sygnału⁹. Przed kontynuowaniem należy ponownie skalibrować w temperaturze pokojowej 20% glicerol/PBS. nuta: Jest to dogodny punkt do rozpoczęcia wytrącania sond (patrz 2.1.1).
8. 3x zamrażanie/rozmrażanie w ciekłym azocie. Zanurzaj jedno szkiełko na raz w ciekłym azocie za pomocą małego dewara. Wyjmij po kilku sekundach i charakterystycznym trzaskającym dźwięku i połóż na ręczniku papierowym do rozmrożenia. Poczekaj, aż nieprzezroczysty zamrożony glicerol zniknie, a następnie ponownie zamroź. Wygodnie można wykonać do 15 slajdów w rotacji przez trzy cykle zamrażania/rozmrażania.
9. Prać dwukrotnie w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
10. Inkubować w 0,1 M HCl przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
11. Prać w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
12. Przepuszczalność w 0,5% saponinie/0,5% Triton X-100/PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
13. Prać dwukrotnie w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
14. Równoważyć w 50% formamidzie/2x SSC przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej.
15. Pipetę nanieść na szkiełko nakrywkowe. Wyjmij szkiełko ze słoika i osusz nadmiar płynu wokół miejsca (miejsc) komórek ręcznikiem papierowym. Ponieważ formamid szybko wysycha, należy uważać, aby nie wysuszyć komórek. W przypadku szkiełek z dwu- lub trzykomórkowymi plamkami, należy nałożyć 10 μl sondy na plamkę na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 50 mm odpowiadające lokalizacji plamki na szkiełku. Odwróć szkiełko nakrywkowe na miejsce (miejsca) szkiełka. Uszczelnij cementem gumowym i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Chronić przed światłem na wszystkich kolejnych etapach.
16. Podgrzewanie przesuwa się do 78 °C dokładnie przez 2 minuty na płycie grzejnej (np. odwrócony blok grzewczy, KROK KRYTYCZNY: patrz Dyskusja). Umieść pokrywę (kartonowe pudełko lub podobne) na płycie grzejnej, aby chronić przed światłem podczas denaturacji.
17. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w szczelnie nawilżonej komorze. Aby nawilżyć, umieść ręczniki papierowe w światłoszczelnym pudełku i zwilż wodą.

2.2 Dzień 2

1. Przygotuj słoiki Coplin z roztworami o odpowiedniej temperaturze do kolejnych etapów mycia. Chroń slajdy przed światłem w jak największym stopniu podczas wszystkich kolejnych kroków. Puszka po kawie stanowi dobrą, światłoszczelną pokrywę dla słoików Coplin.
2. Oderwij cement gumowy i umieść szkiełko w 2x SSC, aż szkiełka nakrywkowe poluzują się i zsuną.
3. Prać w 50% formamidzie/2x SSC przez 15 minut w temperaturze 45 °C. Przykryć łaźnią wodną pod przykryciem w celu ochrony przed światłem.
4. Prać w 0,2x SSC przez 15 min w temperaturze 63 °C.
5. Prać w 2x SSC przez 5 min w temperaturze 45 °C.
6. Prać w 2x SSC przez 5 min w temperaturze pokojowej.
7. Prać w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
8. Barwieć DAPI (5 μg/ml w 2x SSC) przez 2 minuty w słoiku Coplin w temperaturze RT.

Uwaga: Roztwór DAPI może być przechowywany w temperaturze 4 °C w ciemności przez 2 miesiące.

9. Odplamić w PBS przez 5 minut w RT.
10. Aby zamontować szkiełko nakrywkowe, należy odpipetować podłoże mocujące do szkiełka nakrywkowego. Użyć 10 μl na plamkę komórki, używając szkiełek nakrywkowych 22 mm x 22 mm dla jednego miejsca i szkiełek nakrywkowych 22 mm x 50 mm dla dwóch lub trzech plamek. Wysusz PBS wokół miejsca komórkowego tak bardzo, jak to możliwe, ale uważaj, aby nie wysuszyć komórek. Odwróć szkiełko nakrywkowe na szkiełko podstawowe i uszczelnij lakierem do paznokci.

Wyniki

Protokół opisany tutaj (Rysunek 1 dla przeglądu) został wykorzystany z doskonałym skutkiem do połączenia DNA FISH z wysokoprzepustowym przechwytywaniem obrazów do analizy organizacji genomu. Generowanie dobrej jakości sond ma kluczowe znaczenie dla sukcesu (patrz Dyskusja). Rysunek 2 przedstawia dwie ważne kontrole jakości sond FISH. Po translacji nacięcia powinien być widoczny rozmaz DNA, przy czym większość fragmentów powinna mieć temperaturę od 150 do 700 pz (ryc. 2A). Po sprzężeniu chemicznym włączenie barwnika fluorescencyjnego można zmierzyć za pomocą analizy spektroskopowej sondy (rysunek 2B).

Podczas korzystania z dobrych sond, przestrzeganie protokołu DNA FISH zwykle skutkuje jasnymi sygnałami DNA FISH na niskim tle. Z powodzeniem zastosowaliśmy ten protokół na wielu różnych typach komórek, zarówno za pomocą mikroskopów epi-fluorescencyjnych, jak i konfokalnych. Zautomatyzowane obrazowanie przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego wymaga ostrych, łatwych do zidentyfikowania sygnałów FISH z niewielkim tłem (ryc. 3), podczas gdy mikroskopia konfokalna wymaga bardziej intensywnych sygnałów. Rysunek 4A przedstawia reprezentatywne przetworzone obrazy. Można uzyskać współrzędne jądrowe sygnałów FISH i obliczyć relacje przestrzenne regionów genomu (na przykład patrz rysunek 4B). Wykorzystaliśmy również stosy obrazów uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej do modelowania 3D sygnałów FISH w obrębie ich terytoriów chromosomowych (film 1).

Rysunek 1. Przepływ pracy do znakowania sondy i DNA FISH. Przygotowanie sondy jest pokazane na niebiesko. Procedura DNA FISH jest pokazana w kolorze czarnym, a szczegóły podane są na zielono.

Rysunek 2. Znakowanie sond za pomocą translacji nicków i kontrola jakości oznakowanych sond. A) Żel wykazujący idealny rozmaz przed podgrzaniem w celu dezaktywacji DNazy I (tor 1: drabinka DNA, tor 2 i 3: BAC po translacji nacięcia). Fragmenty powinny znajdować się w przedziale 150-700 pz. Często obserwuje się dodatkowy rozmaz przy ~1 kb przy udanych reakcjach translacji nicka. B) Analiza pełnego spektrum mikroobjętości znakowanych sond. Pik DNA przy 260 nm obserwuje się z drugim pikiem odpowiadającym długości fali absorbancji fluoroforu, którym znakowana jest sonda: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Pokazano trzy sondy z dobrym wbudowaniem: piki absorbancji fluoroforu są podobnej wysokości lub wyższe niż piki DNA. Alexa Fluor 647 ma zazwyczaj wyższą absorbancję niż Alexa Fluor 555, która z kolei ma wyższą absorbancję niż Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 pochłania również trochę światła przy 260 nm, stąd pierwszy szczyt dla tej sondy jest wyższy niż pozostałych. Sondy o słabej inkorporacji wykazują absorbancję fluoroforu 2-3 razy niższą niż absorbancja DNA. Sondy z ponad 2-krotnie wyższym pikiem fluoroforowym niż pik DNA zazwyczaj zawierają niesprzężony barwnik, który może powodować tło w FISH.

Rysunek 3. Zrzut ekranu z oprogramowania do obrazowania MetaCyte 3D FISH przedstawiający typowy trójkolorowy eksperyment FISH. Ekran podzielony jest na kilka części. A) Surowy obraz pola widzenia (FOV) przechwycony przez system skanowania preparatów Metafer/MetaCyte. B) Galeria zdjęć zidentyfikowanych jąder, które zostały poddane przetwarzaniu obrazu i segmentacji dla sygnałów FISH. Na każdym obrazie w galerii można wyświetlać różne typy danych. W tym przykładzie numer komórki jest pokazany w lewym górnym rogu z różnymi odległościami międzyallelicznymi i międzylokowymi w prawym górnym rogu i po obu stronach poniżej każdego obrazu. C) Nazwa preparatu wraz z liczbą jąder zidentyfikowanych w analizie. D) Przedstawienie slajdu z obszarem skanowanym przez system. E) Powiększenie skanowanego obszaru. Białe plamy reprezentują zidentyfikowane jądra na pole widzenia. F) Przetwarzane dane. W tym przykładzie pokazane są maksymalne odległości interalleliczne między sygnałami zielonymi (na górze) i czerwonymi (na dole). Pokazane dane pochodzą z mysich komórek rozrodczych P20. Sondy znajdują się na różnych chromosomach, obejmując geny Hbb i Hba oraz klaster histonów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać.

Rysunek 4. Przykłady przetworzonych obrazów i pochodnych danych pozycyjnych . A) Przetworzone obrazy komórek wątroby płodu E13.5 barwionych sondami BAC zlokalizowanymi na różnych chromosomach pokrywających geny Myci Kcnq1 (określane jako myc i KvDMR, odpowiednio w kolorze zielonym i czerwonym). ZA)Wykresy pudełkowo-wąsy Tukeya reprezentujące rozkład odległości międzyallelicznej dla tych samych loci w 600 jądrach. Odległość międzyalleliczną wykreśla się jako ułamek promienia jądra (odległość/promień), aby uwzględnić zmiany wielkości jądra. Jądra komórek ES mają promień około 5 μm. Czerwone sondy są znacznie bliżej siebie niż zielone sondy (***: p<0,01, niesparowany test t). Dane z¹⁰.

Film 1. 3D owy model modelowania dwóch loci na terytorium chromosomów. Dwie sondy BAC znajdujące się blisko obu końców mysiego chromosomu 7 zostały oznaczone (czerwone i dalece czerwone, (pseudo-kolorowe białe)) i zhybrydyzowane razem z całą farbą chromosomową (zieloną) do mysich komórek ES. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

3D DNA FISH stało się powszechnie uznanym narzędziem do analizy układów przestrzennych w jądrze. Chociaż FISH zapewnia wizualne i bezpośrednie rezultaty, jak w przypadku każdej techniki, należy zdawać sobie sprawę z jej ograniczeń. DNA FISH boryka się z nieodłącznym problemem, jakim jest to, że potrzebne są stosunkowo surowe zabiegi, aby chromatyna była dostępna dla sond FISH, co ostatecznie zaburza strukturę jądrową – dokładnie to, co ma być analizowane. Podjęto kilka strategii mających na celu pogodzenie dostępności z zachowaniem struktury. W opisanym tutaj protokole chromosomalne DNA jest dostępne poprzez przenikanie komórek przez zamrażanie i rozmrażanie oraz denaturację cieplną przed hybrydyzacją sondy. Solovei i wsp., (2002) przeanalizowali zmiany strukturalne po podobnym leczeniu i stwierdzili, że średnie przemieszczenie domen chromatyny wynosiło 300 nm, co ogranicza rozdzielczość analizy strukturalnej do około 1 Mb regionów w genomie⁸. Chociaż nie jest to wysoka rozdzielczość, jest to rozsądna skala do analizy pozycji jądra.

Bardziej praktycznym aspektem analizy FISH jest to, że pozyskiwanie obrazów i pomiary odległości jądrowych są czasochłonnymi procesami, które ograniczają liczbę jąder, które można analizować. Aby zbadać rzadkie zdarzenia, naszym celem było przeprowadzenie wysokoprzepustowego zautomatyzowanego obrazowania. Następnie, przy zastosowaniu odpowiednich kontroli, można porównać wystarczającą liczbę danych, aby umożliwić solidną analizę statystyczną relacji przestrzennych. Rutynowo analizujemy 600 jąder w każdym punkcie danych, dla których określamy współrzędne 3D wszystkich sygnałów FISH w objętości jądrowej. Dane te zajmują bardzo mało miejsca w pamięci masowej i pozwalają na analizę odległości między- i wewnątrzallelicznych lub pozycji radialnych w dowolnym późniejszym momencie. Co więcej, zautomatyzowane przetwarzanie może odbywać się w sposób ślepy badacza, co znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo nieświadomych uprzedzeń.

Aby umożliwić tego rodzaju wysokoprzepustową analizę, naszym celem było opracowanie szybkiego i wydajnego sposobu wykonywania DNA FISH. Stwierdziliśmy, że opisany tutaj protokół jest niezwykle solidny, konsekwentnie wytwarzając jasne sygnały o niskim tle. Zadziałało to dla wszystkich typów komórek, które wypróbowaliśmy, pod warunkiem, że dostosowaliśmy etap mocowania komórek do szkiełka. Co więcej, z jednym wyjątkiem, wszystkie BAC, których używaliśmy, można było przekształcić w jasne sondy. Udało nam się również wykryć szereg białek jądrowych poprzez barwienie przeciwciałami po DNA FISH. Chociaż w przypadku niektórych białek działa to dobrze, zalecamy porównanie z tradycyjną immunofluorescencją (IF), aby zapewnić spójność wzorca barwienia przeciwciał między IF a DNA immuno FISH (porównaj ¹¹).

Ogólnie rzecz biorąc, stwierdziliśmy, że sondy oznaczone różnymi kolorami dawały te same wyniki. Jednak przy wyborze barwnika do etykietowania należy wziąć pod uwagę następujące aspekty. Po pierwsze, kolor fluoroforu musi być dobrze wykrywalny przez użyty mikroskop. Po drugie, długość fali światła emitowanego przez fluorofory powinna być na tyle różna, aby uniknąć przenikania do drugiego kanału. Będzie to zależeć od filtrów w mikroskopie. I po trzecie, przynajmniej w naszych rękach, niektóre kolory wytwarzają jasne sygnały bardziej konsekwentnie niż inne. Zawsze używaliśmy DAPI (niebieski) jako przeciwbarwienia, co sprawia, że Alexa Fluor 555 (czerwony), 488 (zielony) i 647 (dalece czerwony) są dobrym wyborem do etykietowania sond. Dzięki naszemu systemowi obrazowania stwierdziliśmy, że Alexa Fluor 555 (czerwona) wytwarza najjaśniejsze sygnały, a następnie Alexa Fluor 488 (zielona). Alexa Fluor 647 (daleko czerwony) ma tę wadę, że nie może być wykryty przez ludzkie oko i dlatego nie widać żadnych sygnałów podczas patrzenia w dół mikroskopu. Tak więc, jeśli robisz dwukolorowe RYBY, zalecamy połączenie czerwonych i zielonych barwników.

Mogą pojawić się dwa zasadnicze problemy: wypłukiwanie komórek ze szkiełek i słabe sygnały. To, jak dobrze komórki przylegają do szkiełka, jest bardzo zróżnicowane w zależności od typu komórek i należy określić najlepszy protokół osadzania/zasiewania komórek. Z powodzeniem używaliśmy szkiełek z ładunkiem dodatnim lub pokrytych poli-L-lizyną (kupionych w postaci gotowej do użycia), ale stwierdziliśmy, że ogniwa ogólnie lepiej przylegają do szkiełek pokrytych poli-L-lizyną. Odkryliśmy również, że gdy komórki były zbyt gęste, całe obszary odklejały się jako arkusz, podczas gdy automatyczne obrazowanie było utrudnione, jeśli komórki były zbyt rzadkie. Tak więc, jeśli próbka nie jest zbyt cenna, należy rozsiać różne liczby komórek, aby określić idealną gęstość. Jeśli komórki są szczególnie podatne na zmywanie, można użyć hydrofobowego pisaka barierowego, a etapy FISH można wykonać, ostrożnie pipetując roztwory bezpośrednio na szkiełko. Pipetowanie również drastycznie zmniejsza ilość potrzebnych odczynników, ale trwa znacznie dłużej w przypadku wykonywania wielu szkiełek.

Słabe sygnały są zwykle spowodowane słabymi sondami i warto zainwestować czas w tworzenie dobrych. Jako materiał wyjściowy należy stosować czyste DNA BAC, który można uzyskać przez wielokrotne wytrącanie lub za pomocą dostępnych w handlu zestawów. Zanieczyszczenie bakteryjnym genomowym DNA negatywnie wpływa na jakość sondy i wymagane jest ostrożne obchodzenie się z nią podczas lizy komórek i filtrowanie lizatu komórkowego, aby ograniczyć je do minimum. Nie jest jednak konieczne stosowanie etapu egzonukleazy do trawienia liniowego DNA, ponieważ znacznie zmniejsza to wydajność. Wydajne etykietowanie sondy ma kluczowe znaczenie. Najważniejszą kontrolą jakości na tym etapie jest sprawdzenie rozmiaru fragmentu po translacji nicka (patrz Reprezentatywne wyniki). "Dobry" rozmaz prawie zawsze skutkuje jaskrawym kolorem sondy. Odkryliśmy jednak, że czasami pewien BAC nie może zostać przetworzony na dobrą sondę i trzeba wybrać inny BAC. Kolejnym ważnym krokiem jest denaturacja cieplna. Jeśli temperatura jest zbyt niska, DNA zostanie tylko częściowo zdenaturowane, a hybrydyzacja sondy zostanie upośledzona. Jeśli temperatura jest zbyt wysoka, struktura jądrowa zostanie zaburzona bardziej niż to konieczne. W naszych rękach 78 °C na odwróconym gorącym bloku jest idealnym kompromisem, ale może się to różnić w zależności od użytego gorącego bloku.

Uzyskaliśmy dobre wyniki przy użyciu podłoża montażowego Vectashield, ale stwierdziliśmy, że SlowFade Gold ma mniej tła i dłużej zachowuje sygnał fluorescencyjny. Nie zalecamy stosowania twardego medium montażowego, ponieważ stwierdziliśmy, że wpływa to na strukturę 3D i z czasem tworzy pęcherzyki powietrza.

Podsumowując, jaskrawo fluorescencyjne, bezpośrednio znakowane sondy wraz z opisanym tutaj protokołem DNA FISH oferują skuteczne rozwiązanie do solidnej i szybkiej analizy architektury jądrowej, które ma zastosowanie w szerokiej gamie zagadnień biologicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik/Materiał
bufor NTB			Krok 1.1.1 (Zobacz listę 'FISH i mieszanki reakcyjne' poniżej)
DTT	Invitrogen	D-1532	Krok 1.1.1
dNTPs	Bioline	BIO-39025	Krok 1.1.1 (Patrz lista 'RYB i mieszanki reakcyjne' poniżej)
Aminoallil-dUTP	Ambion	AM8439	Krok 1.1.1
Polimeraza DNA I	New England Biolabs	M02095	Krok 1.1.1
DNaza I rekombinowana bez RNazy	Roche	4716728001	Krok 1.1.1
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28104	Krok 1.1.4, 1.2.3
NaOAc	VWR	27653	Krok 1.1.5, Krok 2.1.1.2
NaHCO3	Sigma	S5761	Krok 1.2.1
Barwniki reaktywne Alexa Fluor Decapacks do zastosowań w mikromacierzach	Invitrogen (sondy molekularne)	A32750, A32756, A32757	Krok 1.2.2
DMSO (bezwodny)	Sigma Aldrich	276855	Krok 1.2.2
SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNA	Life Technologies	S33102	Krok 1.2.4 (alternatywa dla bromku etydyny)
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016	Krok 2.1.1.1 (DNA Cot-1 może być wykonane w domu w dużych ilościach i działa równie dobrze)
Jednoniciowe DNA z jąder łososia	Sigma	D7656	Krok 2.1.1.1
Dejonizowany formamid	Sigma	F-9037	Krok 2.1.1.3 (Zagrożenie dla zdrowia)
Siarczan dekstranu	Sigma Life Sciences	D8906	Krok 2.1.1.4 (Patrz lista "RYB i mieszaniny reakcyjne" poniżej)
Sondy do malowania XMP	MetaSystems	000000-0528-837	Krok 2.1.1.4
Prowadnice pokryte poli-L-lizyną	Sigma Aldrich	P0425	Krok 2.1.2
Długopis hydrofobowy (ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000	Krok 2.1.2
70 μ m sito (Mysz f– Tylko komórki wątroby)	BD Falcon	352350	Krok 2.1.2.1
PFA	Sigma Aldrich	P6148	Etap 2.1.3 (Łatwopalne,, toksyczność ostra, zagrożenie dla zdrowia) (Patrz lista "RYB i mieszaniny reakcyjne" poniżej)
Tris-Cl			Krok 2.1.3 (Patrz lista "RYB i mieszaniny reakcyjne" poniżej)
Saponina z kory Quillaja	Sigma Aldrich	47036	Etap 2.1.4, 2.1.11 (Toksyczność ostra), (Patrz wykaz "RYB i mieszaniny reakcyjne" poniżej)
Triton X-100	Sigma	T9284	Etap 2.1.4, 2.1.11 (Toksyczność ostra, stwarzająca zagrożenie dla środowiska)
10 x PBS	Life Technologies (GIBCO)	70011-036	Krok 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650	Krok 2.1.6
HCl	VWR	20252	Krok 2.1.9 (Toksyczność ostra, działanie)
Formamid	Sigma Aldrich	47670	Krok 2.1.14, 2.2.3 (Zagrożenie dla zdrowia)
SSC			Krok 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (Patrz wykaz "rybne i mieszaniny reakcyjne" poniżej)
Szkiełka nakrywkowe 22 x 22	Menzel-Glaser	BB022022A1	Krok 2.1.15
Szkiełka nakrywkowe 22 x 50	Menzel-Glaser	BB022050A1	Krok 2.1.15
Cement kauczukowy	Marabu	2901 (10 000)	Krok 2.1.15 (łatwopalny, zagrożenie dla zdrowia, zagrożenie dla środowiska)
Sondy molekularne	DAPI	D3571	Krok 2.2.8 (zagrożenie dla zdrowia)
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936	Krok 2.2.10 (medium montażowe)
Bezbarwny lakier do paznokci	Dowolny dostawca		Krok 2.2.10
Equipment
Nanodrop 2000	Thermo Scientific		Krok 1.1.6, 1.2.4 (spektroskopia mikroobjętościowa)
Tajfun FLA 7000 fosfoimager	GE Life Sciences		Krok 1.2.4
Słoiki z kopiny	Sigma-Aldrich	S6016 (6EA)/S5516 (6EA)Krok	2.1.3 i nowsze
Ciekły azot Dewar	Dowolny dostawca		Krok 2.1.7
Podstawa z czarną pokrywą (komora światłoszczelna)	Simport	M920-2	Krok 2.1.17
Komfort termomiksera	Eppendorf	5355 000.011	Krok 2.2.3 (lub użyj wytrząsarki w 37 & stopni; Pokój C)
Metafer - Platforma automatyzacji obrazowania	Oprogramowanie do automatycznego obrazowania	MetaSystems
MetaCyte - Zautomatyzowana analiza międzyfazowa FISH	Oprogramowanie do automatycznego obrazowania	MetaSystems
mikroskop epifluorescencyjny Zeiss			Z2
Mikroskop konfokalny IX81 (FV1000)	Mikroskop konfokalny	Olympus
Bitplane, wersja 7.3	Oprogramowanie do analizy obrazu i modelowania 3D	Imaris
Objętość naukowa Obrazowanie, wersja 4.1	Oprogramowanie do analizy i dekonwolucji obrazu	Huygens
i mieszanki reakcyjne FISH Nazwa Skład Komentarze 10 x bufor NTB 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 0,05 M MgCl2 0,5 mg/ml BSA dNTP Mix 0,5 mM dGTP Store 50 μ l podwielokrotności przy -20 ° C 0,5 mM dATP 0,5 mM dCTP 0,125 mM dTTP 4 % PFA Odważyć 4 g/100 ml PFA w PBS i podgrzać do temperatury 62 °C. Dostosować pH za pomocą NaOH do 7,0, aby rozpuścić pozostałe PFA. Przechowywać 50 ml porcji w temperaturze -20 & stopni; C, nie zamrażać ponownie 2 % roztwór saponin Rozpuść 2 g saponiny na 100 ml PBS przez przedłużone mieszanie. Rozpuść i dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH. Doprowadzić do 1 l za pomocą ddH20 i autoklawu. Przechowywać porcje 5 ml w temperaturze -20 & deg; C 20 x SSC Odważyć 175,3 g NaCl i 88,2 g cytrynianu sodu i dodać do 80 ml ddH20 . Rozpuść i dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH. Doprowadzić do 1 l za pomocą ddH20 i umieścić w autoklawie. mieszanka siarczanu dekstranu 20 % siarczanu dekstranu w 2 x bufor SSC; Roztwór wirować i mieszać na bujaku przez noc. Przechowywać 500 μ l podwielokrotności przy -20 ° C