Artykuł metodologiczny

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

DOI:

10.3791/50597

⸱

6 sierpnia 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę. Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych. Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie komórek w hodowli (analiza in vitro) dostarczyło ważnych informacji na temat złożonych systemów biologicznych. Konwencjonalne metody i sprzęt do analizy in vitro doskonale nadają się do badania dużej liczby komórek (≥105) w objętościach w skali mililitrów (≥0,1 ml). Istnieje jednak wiele przypadków, w których konieczne lub pożądane jest zmniejszenie wielkości hodowli w celu zmniejszenia zużycia komórek będących przedmiotem zainteresowania i/lub odczynników wymaganych do ich hodowli, stymulacji lub przetwarzania. Niestety, konwencjonalne podejścia nie wspierają precyzyjnej i powtarzalnej manipulacji kulturami w mikroskali, a obecnie dostępne zautomatyzowane systemy oparte na mikroprzepływach są zbyt złożone i wyspecjalizowane, aby mogły być rutynowo stosowane przez większość laboratoriów. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy prostą i wszechstronną platformę technologiczną do zautomatyzowanej hodowli, stymulacji i odzyskiwania małych populacji komórek (100 - 2 000 komórek) w mikroskalowych objętościach (1 - 20 μl). Platforma składa się z zestawu mikronaczyń włosowatych pokrytych fibronektyną ("komór perfuzyjnych komórek"), w których zakłada się, utrzymuje i stymuluje hodowle w mikroskali; cyfrowe urządzenie mikroprzepływowe (DMF) wyposażone w mikrokapilary "transferowe" ("koncentrator centralny"), które kierują komórki i odczynniki do i z komór perfuzyjnych; precyzyjną pompę strzykawkową, która napędza transport materiałów między komorami perfuzyjnymi a piastą centralną; oraz interfejs elektroniczny, który zapewnia kontrolę nad transportem materiałów, który jest koordynowany i zautomatyzowany za pomocą wcześniej określonych skryptów. Na przykład wykorzystaliśmy platformę, aby ułatwić badanie odpowiedzi transkrypcyjnych wywoływanych w komórkach odpornościowych po prowokacji z bakteriami. Korzystanie z platformy umożliwiło nam zmniejszenie zużycia komórek i odczynników, zminimalizowanie zmienności między eksperymentami i przekierowanie pracy ręcznej. Biorąc pod uwagę korzyści, jakie daje, a także jej dostępność i wszechstronność, nasza platforma powinna znaleźć zastosowanie w wielu różnych laboratoriach i aplikacjach, a także okazać się szczególnie przydatna w ułatwianiu analizy komórek i bodźców, które są dostępne tylko w ograniczonych ilościach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie komórek utrzymywanych w hodowli (analiza in vitro) dostarczyło bezcennych informacji na temat podstawowych zasad i mechanizmów molekularnych rządzących złożonymi systemami biologicznymi i ludzkim zdrowiem. Konwencjonalne metody hodowli, stymulacji i pobierania komórek do analizy, które wykorzystują szalki Petriego i płytki do mikromiareczkowania, zostały zaprojektowane do badania dużych populacji komórek (≥105) w objętościach kultur w skali mililitrów (≥0,1 ml). Istnieje jednak wiele przypadków, w których dostępne są tylko ograniczone ilości komórek (np. komórki pierwotne) lub pożądane są małe populacje komórek (np. w celu zmniejszenia zmienności między komórkami w całej populacji) lub wymagane odczynniki są trudne do uzyskania lub zbyt drogie (np. oczyszczone czynniki wydzielane przez komórki). Problemy te można z powodzeniem rozwiązać, zmniejszając wielkość hodowli, co ma dodatkową zaletę w postaci zmniejszenia zużycia wszystkich odczynników wymaganych do analizy in vitro 1,2. Niestety, konwencjonalny sprzęt i metody nie wspierają precyzyjnej i powtarzalnej manipulacji kulturami w mikroskali, a dostępne obecnie zautomatyzowane systemy oparte na mikrofluidycesą zbyt złożone i wyspecjalizowane, aby można je było rutynowo stosować w większości laboratoriów.

W tym raporcie opisujemy montaż i wykorzystanie prostej i wszechstronnej platformy technologicznej do zautomatyzowanej hodowli, stymulacji i odzyskiwania małych populacji komórek (100 - 2 000 komórek) w mikroskalowych objętościach (1 - 20 μl). Architektura platformy (rysunek 1) ma konstrukcję modułową: zestaw mikrokapilar pokrytych fibronektyną (moduł "komory perfuzyjne komórek") służy jako miejsce zakładania, utrzymywania i stymulacji kultur w mikroskali; oraz cyfrowe urządzenie mikroprzepływowe (DMF)12,13 wyposażone w mikrokapilary "transferowe" (moduł "koncentratora centralnego")14,15 kieruje komórki i odczynniki do i z komór perfuzyjnych. DMF umożliwia użytkownikowi indywidualne adresowanie wielu kropel jednocześnie oraz zmianę lub zmianę kolejności manipulacji (tj. rekonfigurację ciągów przetwarzania próbek) bez zmiany sprzętu urządzenia. Jej ogromna elastyczność jest widoczna w niedawnym pojawieniu się jako kluczowej technologii w szerokim zakresie zastosowań, w tym w hodowlach komórkowych16,17, testach enzymatycznych18,19, testach immunologicznych20,21, analizie DNA22,23, przetwarzaniu białek,24,25 i przetwarzaniu próbek klinicznych. 26,27 Nasz centralny hub wykorzystuje elastyczność właściwą urządzeniom DMF i dodatkowo ją zwiększa poprzez dodanie interfejsów mikrokapilarnych, co daje możliwość przeprowadzenia podzbioru manipulacji (np. hodowli komórek) w wyspecjalizowanych modułach peryferyjnych, a nie na samym urządzeniu DMF. Podział na przedziały ciągów procesowych w ten sposób upraszcza również projektowanie architektury platformy (nie ma potrzeby budowania urządzenia DMF, które może przeprowadzić wszystkie etapy przetwarzania) i ułatwia jej ewolucję w miarę zapotrzebowania na nowe funkcje (w razie potrzeby wystarczy zintegrować nowe moduły peryferyjne). Transport ogniw i odczynników w obrębie węzła centralnego jest napędzany siłami elektrozwilżania generowanymi przez sekwencyjną aktywację elektrod w urządzeniu DMF13,28; Transport do, z i w obrębie komór perfuzyjnych jest napędzany zmianami ciśnienia generowanymi przez precyzyjną pompę strzykawkową. Wszystkie te płynne ruchy są kontrolowane za pomocą prostego interfejsu elektronicznego i zautomatyzowane za pomocą wcześniej określonych skryptów.

Jako reprezentatywny przykład, demonstrujemy użycie platformy do badania odpowiedzi transkrypcyjnych wywoływanych w komórkach odpornościowych po prowokacji z bakteriami (Rysunek 2). Przeprowadzenie tych eksperymentów na platformie umożliwiło nam pracę z niewielką liczbą komórek (~1000 na warunki eksperymentalne), zminimalizowanie zmienności między eksperymentami, oszczędzanie odczynników i przekierowanie pracy ręcznej. Biorąc pod uwagę korzyści, jakie daje, a także jej dostępność i wszechstronność, platforma ta powinna znaleźć zastosowanie w wielu różnych laboratoriach i aplikacjach oraz okazać się szczególnie przydatna w ułatwianiu analizy komórek i bodźców, które są dostępne tylko w ograniczonych ilościach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten ogólny protokół ma na celu wspieranie zastosowania platformy do szerokiej gamy badań; aspekty specyficzne dla reprezentatywnego badania opisanego w tym raporcie są oddzielone w nawiasach. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne badanie przeprowadzone przy użyciu protokołu. Zauważ, że w protokole wszystkie polecenia "instruct" są zautomatyzowane za pomocą wcześniej określonych skryptów. Należy również zauważyć, że Krok 2 może być wykonywany równolegle z Krokiem 1 (np. podczas Kroków 1.7 i 1.8) oraz że Krok 2.1 jest często pomijany (ponieważ wzorzyste/powlekane płyty urządzeń DMF mogą być myte i ponownie używane; patrz Krok 5.2).

1. Złóż i wypełnij komory perfuzyjne komórek

  1. Pokryć wewnętrzne powierzchnie wysterylizowanych (autoklawowanych) mikrokapilar (stopiona krzemionka; 679 μm üm üd, 534 μm üm id; 15 cm długości) fibronektyną, nakazując pompie strzykawkowej pobranie sterylnego roztworu fibronektyny (30 μl z 50 μg/ml) do każdej mikrokapilarnej, inkubacji (37 °C przez 2 godziny), nakazując pompie strzykawkowej pobranie roztworu, i pozostawienie mikronaczyń włosowatych do wyschnięcia (temperatura pokojowa (RT) przez 6 godzin).
  2. Podłącz każdą mikrokapilarnę (komorę perfuzyjną) pokrytą fibronektyną do rurki poliwęglanowej (średnica zewnętrzna 500 μm, średnica wewnętrzna 100 μm), a rurkę do wieloportowej pompy strzykawkowej za pomocą złączek CapTite (6 komór perfuzyjnych, 8-portowa pompa strzykawkowa).
  3. Za pomocą taśmy przymocuj korpus każdej komory perfuzyjnej do bloku grzewczego ustawionego na żądaną temperaturę (37 °C).
  4. Zanurzyć otwarte końce komór perfuzyjnych w zbiorniku (probówka mikrocentyfugowa lub studzienka płytki mikromiareczkowej) zawierającym komórki (mysie makrofagi P388D.1) zawieszone w świeżej pożywce wzrostowej (RPMI-1640, 10% FBS, 500 jednostek/ml penicyliny, 500 μg/ml streptomycyny) w pożądanym stężeniu (10-6 komórek/ml).
  5. Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła komórki (10 μl, 104 komórki) do każdej komory perfuzyjnej, a następnie doprowadzono tyle powietrza, aby przesunąć korek cieczy (~ 4.5 cm) do sekcji przymocowanej do bloku grzewczego.
  6. Pozostawić komórki do przylegania do pokrytych fibronektyną wewnętrznych powierzchni komór perfuzyjnych (37 °C przez 1-2 godziny). W międzyczasie przenieś otwarte końce komór perfuzyjnych ze zbiornika komórek do nowego zbiornika zawierającego świeżą pożywkę wzrostową.
  7. Po upływie okresu przylegania poinstruować pompę strzykawkową, aby wysłała korki cieczy (kondycjonowane media i nieprzyłączone ogniwa) do odpadów, pobrała świeżą pożywkę (10 μl), a następnie dodała wystarczającą ilość powietrza, aby umieścić nowe korki cieczy (świeże podłoże) nad przylegającymi komórkami.
  8. Kontynuuj wymianę pożywki (tj. powtarzaj krok 1.7) w regularnych odstępach czasu (co 2 godziny), aż populacje komórek zostaną wystarczająco zrównoważone i rozszerzone (16 - 24 godziny hodowli w mikroskali wygenerowanych populacji ~ 1,000 komórek / komorę).

2. Wyprodukuj urządzenie DMF i zmontuj architekturę huba

  1. Jak opisano poprzednio14,29, uformować dolną płytkę urządzenia DMF za pomocą czterdziestu sześciu elektrod z tlenku indu i cyny (ITO) (sterowników uruchamiania kropel) za pomocą fotolitografii i trawienia, a następnie pokryć 5 μm parylenu-C i 50 nm teflonu-AF. Uformuj górną płytę urządzenia DMF, pokrywając niewzorzyste podłoże szklane ITO Teflonem-AF, jak powyżej.
  2. Za pomocą metalowych ram zaciskowych zamocuj płyty DMF w odlewie polimerowym14,30 z wgłębieniami, które utrzymują odstęp 400 μm między płytami; odstęp ten, w połączeniu z rozmiarem elektrody uruchamiającej (2,5 mm2), określa objętość kropli (2,5 μl na elektrodę). Należy pamiętać, że montaż DKZ można wykonać w prostszy sposób24.
  3. Włożyć pokryte teflonem mikrokapilary transferowe (średnica zewnętrzna 360 μm, średnica wewnętrzna 100 μm; długość 3,5 - 4,0 cm) w przestrzeń między płytami DMF, ustawiając każdą z nich tak, aby sięgała do krawędzi pokrewnej elektrody uruchamiającej.
  4. Na przeciwległym końcu każdej mikrokapilary transferowej przymocuj złączkę CapTite.
  5. Podłącz złącza elektryczne, aby dostarczyć napięcie do elektrod ITO. Sekwencje aktywacji elektrod są zautomatyzowane za pomocą sterowanego komputerowo interfejsu elektronicznego, na którym działają wcześniej określone skrypty.
  6. Opcjonalnie: Przenieś zmontowaną piastę DMF na stolik translacyjny mikroskopu (SZ-6145TR (Olympus, Japonia)) wyposażonego w kamerę z urządzeniem ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) (DCR-HC96 (Sony, Japonia)) w celu ułatwienia śledzenia kropel. Rozdział 31

3. Podłącz komory perfuzyjne do koncentratora DMF i stymuluj populacje komórek

  1. Wyjmij otwarte końce komór perfuzyjnych ze zbiornika pożywki (patrz krok 1.6) i włóż je do złączek CapTite przymocowanych do końców mikrokapilar transferowych piasty DKZ (patrz krok 2.4).
  2. Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wysłała korki cieczy (kondycjonowane media) w komorach perfuzyjnych do odpadów.
  3. Poinstruuj koncentrator DMF, aby pobierał bodziec (Biocząstki E. coli w stężeniu 100 μg/ml w świeżej pożywce z 0,1% Pluronic F127 w/v) z pokładowego zbiornika i dostarczał kroplę o odpowiedniej wielkości (10 μl) do każdej mikrokapilary transferowej. Zbiorniki pokładowe składają się z cylindrycznych komór (1,5 x 1,5 cm każdy) i są połączone z piastą DMF za pomocą przewodów.
  4. Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wciągnęła czopki bodźcowe do mikrokapilar transferowych, a następnie doprowadź tyle powietrza, aby umieścić czopki nad populacjami komórek w komorach perfuzyjnych.
  5. Inkubować komórki z bodźcem (37 °C przez 1 - 4 godziny). Opcjonalnie: Wymieniaj na nowy bodziec (tj. powtarzaj kroki 3.2-3.4) w regularnych odstępach czasu.

4. Zakończ stymulację i odzyskaj lizaty komórkowe do analizy

  1. Opcjonalnie: Jeśli wymagany jest okres po stymulacji, należy wymienić korki płynne zawierające bodziec na świeże podłoże (tj. powtórzyć kroki 3.2 - 3.4, zastępując bodziec świeżym podłożem) i kontynuować inkubację i wymianę w razie potrzeby.
  2. Wymień korki z cieczą w komorach perfuzyjnych na bufor do przemywania (Prelude Direct Lysis Module Buffer B) (tj. powtórz kroki 3.2 - 3.4, zastępując bodziec buforem do płukania) i inkubuj w razie potrzeby (5 min).
  3. Wymień korki z cieczą (bufor do płukania) na roztwór do lizy (Prelude Direct Lysis Module Buffer A z 0,1% Pluronic F127 w/v) (tj. powtórz kroki 3.2 - 3.4, zastępując roztwór do lizy jako bodziec) i inkubuj w razie potrzeby (5 min).
  4. Poinstruuj pompę strzykawkową, aby wysłała korki cieczy (lizaty komórkowe) do piasty DMF.
  5. Zdemontuj piastę DMF, zdejmij górną płytkę urządzenia DMF (uważając, aby nie przechylić płytki na boki, ponieważ może to spowodować wymieszanie się kropel) i zbierz lizaty za pomocą Pipetmana lub strzykawki do analizy poza platformą (profilowanie ekspresji genów za pomocą qPCR).

5. Czysty sprzęt platformy do ponownego wykorzystania

  1. Zanurz mikrokapilary transferowe i złączki CapTite w 10% wybielaczu (v/v w wodzie) na 10 minut w temperaturze pokojowej, dobrze spłucz wodą dejonizowaną i wysusz przy użyciu gazowego azotu.
  2. Zanurz płytki urządzenia DMF w 10% wybielaczu na 10 minut w temperaturze pokojowej, dobrze spłucz izopropanolem, a następnie wodą dejonizowaną i wysusz przy użyciu azotu, a następnie piecz w temperaturze 160 °C przez 10 minut.
  3. Rurka z poliwęglanu pompy strzykawkowej oraz odlewana z polimeru i rama kompresyjna urządzenia DMF mogą być ponownie użyte bez czyszczenia. Mikrokapilary komory perfuzyjnej są odrzucane po każdym eksperymencie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako demonstrację zautomatyzowanej platformy, użyliśmy jej do przeprowadzenia badania, w którym małe populacje komórek odpornościowych były hodowane w mikroskalowych kulturach, prowokowane bakteriami i poddawane lizie w celu analizy odpowiedzi prozapalnych poza platformą (Rysunek 2).

Każda z sześciu komór perfuzyjnych komórek została obsiana 104 komórkami odpornościowymi (P388D.1 mysie makrofagi) zawieszonymi w 10 μl pożywki wzrostowej. Po okresie przylegania (37 °C...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy prostą i wszechstronną zautomatyzowaną platformę do eksperymentów z hodowlą i stymulacją komórek w mikroskali. Platforma umożliwia nam pracę z małymi objętościami kultur i populacjami komórek (1 - 20 μl i 100 - 2 000 komórek na komorę); Rozmiary kultur można jeszcze bardziej zmniejszyć poprzez zastosowanie mikronaczyń włosowatych o mniejszej średnicy. Praca w tych skalach zmniejsza koszty rutynowych badań i umożliwia badania, które wymagają użycia cennych odczynników i/lub komórek. Eksperymenty prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Ronaldowi F. Renzi i Michaelowi S. Bartschowi za ich wkład w projektowanie i rozwój urządzeń DMF oraz koncentratora DMF. Badania te były w pełni wspierane przez program badawczo-rozwojowy kierowany przez laboratorium w Sandia National Laboratories. Sandia to wieloprogramowe laboratorium zarządzane i obsługiwane przez Sandia Corporation, spółkę zależną należącą w całości do Lockheed Martin Corporation, dla Narodowej Administracji Bezpieczeństwa Jądrowego Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych w ramach kontraktu DE-AC04-94AL85000.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Moduł Prelude Direct Lysis NuGEN1400-24
Trypan Blue (0,4% w/v)GIBCO15250-061
StripperCellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesTest qRT-PCR InvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCRTest Applied BiosystemsMm00443111_m1
CCL5 Test qRT-PCR TaqManMm01302428_m1
Test QRT-PCR PTGS2 TaqMan Test qRT-PCRApplied BiosystemsMm00478374_m1
TNF Test qRT-PCRApplied BiosystemsMm00443258_m1
GAPDH Test TaqMan qRT-PCRApplied BiosystemsMm99999915_g1
Pluronic F127Sigma Chemical2594628
Fluorinert FC-40Sigma Chemical51142-49-5
Dimer Parylenu CSpecjalistyczne systemy powlekania28804-46-8
Teflon-AFDuPontAF1600
Taśma poliamidowaULINES-11928
Podłoża szklane powlekane tlenkiem indu i cyny (ITO) Delta TechnologiesCB-40IN-1107
Piasta DMF Mikrokapilary z topionej krzemionki pokryte teflonemPolymicro TechnologiesTSU100375
Mikrokapilary komory perfuzyjnejPolymicro TechnologiesTSP530700
Rurki i złączki mikrokapilarneSandia National Laboratories
Rurka poliwęglanowaParadigm OpticsCTPC100-500-5
8-portowa precyzyjna pompa strzykawkowa wyposażona w 30 mm (500 μ l pojemność) strzykawkiHamilton Company54848-01
Przyrząd do osadzania z fazy gazowej Parylene-CSpecjalistyczne systemy powlekaniaPDS 2010 Labcoter 2
Wysokonapięciowy generator funkcyjnyTrek615A-1 615-3
Mikroskop MVX10OlympusOpcjonalnie (ułatwia śledzenie kropel na piaście DMF)
Cyfrowa kamera CCD QIClickQImagingQIClick-F-CLR-12Opcjonalnie (ułatwia śledzenie kropel na piaście DMF)
komórkowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
  2. Yeo, L. Y., Chang, H. C., Chan, P. P. Y., Friend, J. R. Microfluidic devices for bioapplications. Small. 7, 12-48 (2011).
  3. Zhang, B., Kim, M. C., Thorsen, T., Wang, Z. A self-contained microfluidic cell culture system. Biomedical Microdevices. 11, 1233-1237 (2009).
  4. Skafte-Pedersen, P., et al. A self-contained, programmable microfluidic cell culture system with real-time microscopy access. Biomedical Microdevices. 14, 385-399 (2012).
  5. Barbulovic-Nad, I., Au, S. H., Wheeler, A. R. A microfluidic platform for complete mammalian cell culture. Lab Chip. 10, 1536-1542 (2010).
  6. Zhou, Y., Pang, Y., Huang, Y. Openly Accessible Microfluidic Liquid Handlers for Automated High-Throughput Nanoliter Cell Culture. Analytical Chemistry. 84, 2576-2584 (2012).
  7. Wang, H. Y., Bao, N., Lu, C. A microfluidic cell array with individually addressable culture chambers. Biosensors and Bioelectronics. 24, 613-617 (2008).
  8. Cimetta, E., Cagnin, S., Volpatti, A., Lanfranchi, G., Elvassore, N. Dynamic culture of droplet-confined cell arrays. Biotechnology Progress. 26, 220-231 (2010).
  9. Hung, P. J., Lee, P. J., Sabounchi, P., Lin, R., Lee, L. P. Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays. Biotechnology and Bioengineering. 89, 1-8 (2005).
  10. King, K. R., et al. A high-throughput microfluidic real-time gene expression living cell array. Lab on a Chip. 7, 77-85 (2007).
  11. Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Pirone, D. M., Chen, C. S., Quake, S. R. Versatile, fully automated, microfluidic cell culture system. Analytical Chemistry. 79, 8557-8563 (2007).
  12. Wheeler, A. R. Chemistry - Putting electrowetting to work. Science. 322, 539-540 (2008).
  13. Gong, J., Kim, C. J. All-electronic droplet generation on-chip with real-time feedback control for EWOD digital microfluidics. Lab Chip. 8, 898-906 (2008).
  14. Choi, K., et al. Integration of field effect transistor-based biosensors with a digital microfluidic device for a lab-on-a-chip application. Lab Chip. 12, 1533-1536 (2012).
  15. Barbulovic-Nad, I., Yang, H., Park, P. S., Wheeler, A. R. Digital microfluidics for cell-based assays. Lab Chip. 8, 519-526 (2008).
  16. Gentilucci, L., de Marco, R., Cerisoli, L. Chemical modifications designed to improve peptide stability: incorporation of non-natural amino acids, pseudo-peptide. 16, 3185-3203 (2010).
  17. Miller, E. M., Wheeler, A. R. A digital microfluidic approach to homogeneous enzyme assays. Anal. Chem. 80, 1614-1619 (2008).
  18. Jebrail, M. J., Bartsch, M. S., Patel, K. D. Digital microfluidics: a versatile tool for applications in chemistry, biology. 12, 2452-2463 (2012).
  19. Ng, A. H. C., Choi, K., Luoma, R. P., Robinson, J. M., Wheeler, A. R. Digital Microfluidic Magnetic Separation for Particle-Based Immunoassays. Analytical Chemistry. 84, 8805-8812 (2012).
  20. Sista, R. S., et al. Heterogeneous immunoassays using magnetic beads on a digital microfluidic platform. Lab Chip. 8, 2188-2196 (2008).
  21. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Biochip functionalization using electrowetting-on-dielectric digital microfluidics for surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization. Biosens. Bioelectron. 24, 2218-2224 (2009).
  22. Malic, L., Veres, T., Tabrizian, M. Nanostructured digital microfluidics for enhanced surface plasmon resonance imaging. Biosens. Bioelectron. 26, 2053-2059 (2011).
  23. Jebrail, M. J., Wheeler, A. R. Digital microfluidic method for protein extraction by precipitation. Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).
  24. Nelson, W. C., et al. Incubated protein reduction and digestion on an electrowetting-on-dielectric digital microfluidic chip for MALDI-MS. Anal. Chem. 82, 9932-9937 (2010).
  25. Mousa, N. A., et al. Droplet-scale estrogen assays in breast tissue, blood, and serum. Sci. Transl. Med. 1, 1ra2(2009).
  26. Jebrail, M. J., et al. A digital microfluidic method for dried blood spot analysis. Lab Chip. 11, 3218-3224 (2011).
  27. Choi, K., Ng, A. H. C., Fobel, R., Wheeler, A. R. Digital microfluidics. Annual Review of Analytical Chemistry. 5, 413-440 (2012).
  28. Jebrail, M. J., et al. Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing. J. Vis. Exp. (33), e1603(2009).
  29. Thaitrong, N., et al. Quality Control of Next Generation Sequencing Library through an Integrative Digital Microfluidic Platform. , Submitted (2012).
  30. Shin, Y. J., Lee, J. B. Machine vision for digital microfluidics. Review of Scientific Instruments. 81, (2010).
  31. Thornton, M., Eward, K. L., Helmstetter, C. E. Production of minimally disturbed synchronous cultures of hematopoietic cells. BioTechniques. 32, 1098-1105 (2002).
  32. Huang, X., Dai, W., Darzynkiewicz, Z. Enforced adhesion of hematopoietic cells to culture dish induces endomitosis and polyploidy. Cell Cycle. 4, 801-805 (2005).
  33. Raje, M., et al. Charged nylon membrane substrate for convenient and versatile high resolution microscopic analysis of Escherichia coli & mammalian cells in suspension culture. Cytotechnology. 51, 111-117 (2006).
  34. Chatterjee, D., Hetayothin, B., Wheeler, A. R., King, D. J., Garrell, R. L. Droplet-based microfluidics with nonaqueous solvents and solutions. Lab Chip. 6, 199-206 (2006).
  35. Perroud, T. D., et al. Microfluidic-based cell sorting of Francisella tularensis infected macrophages using optical forces. Analytical Chemistry. 80, 6365-6372 (2008).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10, 57-63 (2009).
  37. Malone, J. H., Oliver, B. Microarrays, deep sequencing and the true measure of the transcriptome. BMC Biology. 9, (2011).
  38. Wu, M., et al. Microfluidically-unified cell culture, sample preparation, imaging and flow cytometry for measurement of cell signaling pathways with single cell resolution. Lab on a Chip. 12, 2823-2831 (2012).
  39. Srivastava, N., et al. Fully integrated microfluidic platform enabling automated phosphoprofiling of macrophage response. Analytical Chemistry. 81, 3261-3269 (2009).
  40. Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 5268-5273 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Micro scale Cell CultureDigital MicrofluidicsCell Perfusion ChambersSyringe Pump ControlAutomated Cell StimulationQuantitative RT PCR AnalysisFibronectin CoatingMicrocapillary TransportCell Lysate RecoveryImmune Cell Stimulation

Powiązane artykuły