Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Kluczową strategią w inżynierii tkankowej jest wykorzystanie biokompatybilnych materiałów do produkcji rusztowań, których morfologia przypomina tkankę, którą zamierza zastąpić, a także jest w stanie wspierać wzrost i funkcję komórek^1,2. Rusztowanie zapewnia mechaniczne wsparcie, umożliwiając przyłączanie i proliferację komórek, a jednocześnie umożliwia migrację komórek przez szczeliny konstruktu komórkowego 3D. Rusztowanie musi również umożliwiać masowy transport składników odżywczych w komórkach i nie może hamować usuwania odpadów metabolicznych³.

Elektroprzędzenie okazało się obiecującą metodą wytwarzania polimerowych rusztowań zdolnych do wspierania wzrostu komórkowego^4-6. Wytworzone włókniny elektroprzędzione włókna nadają się do wzrostu komórek, ponieważ często są porowate i umożliwiają interakcję komórka-komórka, a także migrację komórek przez szczeliny konstruktu komórkowego 3D⁷. Ważne jest monitorowanie żywotności komórek w okresie hodowli i zapewnienie, że żywotność komórek jest utrzymana przez cały czas trwania konstrukcji 3D. Na przykład warunki hodowli, takie jak tlen i pH, wymagają starannej kontroli, ponieważ w konstrukcji 3D mogą występować gradienty stężenia analitu. Bioreaktory lub systemy perfuzyjne mogą być stosowane do naśladowania warunków przepływu śródmiąższowego in vivo, a w rezultacie do zwiększenia transportu składników odżywczych i usuwania odpadów metabolicznych⁸. Pytanie, czy takie systemy zapewniają stałe warunki mikrośrodowiskowe, można rozwiązać, oceniając mikrośrodowisko komórkowe w czasie rzeczywistym.

Kluczowe wskaźniki mikrośrodowiska, które mogą być monitorowane w czasie rzeczywistym, to: temperatura, skład chemiczny nośników komórkowych, stężenie rozpuszczonego tlenu i dwutlenku węgla, pH i wilgotność. Spośród tych wskaźników temperaturę można najłatwiej monitorować za pomocą sond in situ. Metody monitorowania pozostałych wymienionych wskaźników zwykle polegają na usunięciu podwielokrotności do pobierania próbek, a zatem zakłócają hodowlę komórkową i zwiększają ryzyko zanieczyszczenia. Poszukiwane są metody ciągłe w czasie rzeczywistym. Obecne metody monitorowania zwykle opierają się na instrumentach, które fizycznie sondują konstrukcję komórkową, takich jak monitor pH lub sonda tlenu. Jednak te inwazyjne metody mogą uszkodzić konstrukt komórkowy i zakłócić trwający eksperyment. Nieinwazyjne monitorowanie stężeń analitów w konstrukcji 3D może umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym różnych aspektów środowiskowych, takich jak wyczerpanie składników odżywczych⁹. Pozwoliłoby to na ocenę dostarczania składników odżywczych do głębszych regionów struktury i określenie, czy odpady metaboliczne są skutecznie usuwane^10,11. Systemy, które próbują rozwiązać problem inwazyjności, zazwyczaj obejmują użycie komory perfuzyjnej, która przepuszcza pożywkę hodowlaną zarówno przez naczynie hodowlane, jak i do zewnętrznych czujników w celu monitorowania pH, tlenu i glukozy¹². Rośnie zainteresowanie opracowywaniem czujników, które można bezpośrednio zintegrować z naczyniem hodowlanym, które nie wymagają usuwania podwielokrotności do pobierania próbek i jako takie zapewniłyby monitorowanie in situ.

Aby zaradzić takim niedociągnięciom w in-situ i nieinwazyjnym monitorowaniu warunków mikrośrodowiskowych, włączyliśmy nanoczujniki reagujące na analit do rusztowań elektroprzędzonych, aby wyprodukować rusztowania samoraportujące¹³. Rusztowania, które działają jako urządzenia detekcyjne poprzez monitorowanie aktywności fluorescencji, zostały przygotowane wcześniej, gdzie urządzenie czujnikowe było albo rzeczywistym rusztowaniem polimerowym utworzonym przez elektroprzędzenie, albo przez użycie barwnika reagującego na analit, który jest wprowadzany do polimeru przed utworzeniem rusztowania^14,15. Jednak te czujniki mogą dawać błędne wyjścia optyczne spowodowane możliwymi zakłóceniami z innych analitów. Zastosowanie ratiometrycznego urządzenia pomiarowego, takiego jak te przygotowane w opisanym protokole, może potencjalnie wyeliminować te możliwe niekorzystne skutki i zapewnić odpowiedź specyficzną dla danego analitu.

Prezentowane tutaj elektrowirowane rusztowania zostały przygotowane z syntetycznego kopolimeru poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA), wybranego ze względu na aprobatę Agencji ds. Żywności i Leków (FDA), ze względu na jego biodegradowalne i biokompatybilne właściwości oraz doświadczenie we wspieraniu wzrostu i funkcji różnych typów komórek^16-18. Przygotowane nanoczujniki reagujące na analit ratiometryczny reagują na pH. Nanoczujniki zawierają dwa barwniki fluorescencyjne w biokompatybilnej matrycy zol-żel, w której jeden barwnik, FAM, reaguje na pH, a drugi, TAMRA, działa jako wzorzec wewnętrzny, ponieważ nie reaguje na pH. Ponadto fluorescencja zarówno FAM, jak i TAMRA może być analizowana oddzielnie, ponieważ nie nakładają się one znacząco na siebie. Określenie stosunku emisji fluorescencji obu barwników przy określonych długościach fal daje odpowiedź pH niezależną od innych warunków środowiskowych. Samoraportujące się rusztowania mogą pozwolić na ponowną ocenę pH in situ i w czasie rzeczywistym bez zakłócania opracowanego modelu 3D. Wykazaliśmy, że te rusztowania są w stanie wspierać przyłączanie i proliferację komórek oraz pozostają wrażliwe na dany analit. Kinetyka kwaśnych produktów ubocznych w konstruktach inżynieryjnych pozostaje niedostatecznie zbadana, dlatego zastosowanie rusztowań reagujących na pH może znacznie ułatwić takie^badania19. Co więcej, wykorzystanie rusztowań samoraportujących do zastosowań w inżynierii tkankowej daje możliwość pełnego zrozumienia, monitorowania i optymalizacji wzrostu konstruktów tkanek modeli 3D in vitro, nieinwazyjnie i w czasie rzeczywistym.

Nanosensory reagujące na pH zostały również dostarczone do wewnątrzkomórkowego środowiska fibroblastów hodowanych na elektrowirowanych rusztowaniach PLGA. Stosunek emisji fluorescencji z barwników wykorzystano do monitorowania pH i porównano z samoraportującym rusztowaniem zawierającym nanoczujniki pH. Dostarczenie nanoczujników do komórek hodowanych w środowisku 3D może umożliwić monitorowanie stężenia analitu w głębi konstruktu w sposób nieniszczący. W związku z tym nanoczujniki mogą być realnym narzędziem do obrazowania do nieniszczącej oceny zachowania komórek w konstrukcjach 3D, umożliwiając długoterminową analizę. Badanie przesiewowe stężenia analitu w poszczególnych komórkach w konstrukcji 3D może zapewnić, że otrzymują one wystarczające stężenia składników odżywczych i tlenu. Monitorowanie parametrów procesu może pomóc w opracowaniu znormalizowanych technik skutecznego masowego transportu tlenu i składników odżywczych. Dostarczanie nanoczujników do środowiska wewnątrzkomórkowego i włączanie nanoczujników do rusztowań polimerowych można połączyć, aby umożliwić ocenę żywotności komórek, a także wydajności rusztowań w konstrukcjach 3D podczas procesu wzrostu tkanki. Może to prowadzić do poszerzenia wiedzy na temat tych konstruktów i postępu w wytwarzaniu biologicznie istotnych substytutów tkanek.

Przegląd

Sekcja 1 opisuje przygotowanie nanosensorów reagujących na pH oraz charakterystykę reakcji nanosensorów na pH za pomocą spektrometrii fluorescencyjnej oraz ich wielkość przy użyciu SEM.

Sekcja 2 opisuje przygotowanie elektrowirowanych rusztowań polimerowych oraz charakterystykę ich morfologii i rozmiaru za pomocą SEM. Sekcja 2 opisuje również przygotowanie rusztowań samoraportujących, które są rusztowaniami elektroprzędzonymi z uwzględnieniem nanoczujników reagujących na pH. Powstałe w ten sposób rusztowania samoopisujące się są charakteryzowane za pomocą SEM, aby ocenić, czy wystąpiły jakiekolwiek zmiany morfologiczne we włóknach elektroprzędzonych. Fluorescencja z samoopisujących się rusztowań powstałych dzięki wbudowanym nanoczujnikom jest oceniana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Sekcja 3 opisuje hodowlę komórek na rusztowaniu elektrowirowym i rusztowaniu samoopisującym. Rusztowania są najpierw sterylizowane w ramach przygotowań do hodowli komórek, po czym rusztowania są oceniane w celu określenia, czy sterylizacja i hodowla komórek wpływają na zdolność fluorescencyjną rusztowań samoopisujących. Protokół opisuje również dostarczanie nanoczujników do komórek, które są hodowane na elektroprzędzonych rusztowaniach. Barwnik Lysotracker służy do zapewnienia, że nanoczujniki nie zostały wprowadzone do komórkowych komór kwasowych.

1. Przygotowanie i analiza nanosensorów zol-żel reagujących na pH

1.1 Przygotowanie nanosensorów zol-żel reagujących na pH

Uwaga: To przygotowanie powinno być wykonywane w dygestorium.

1. Przygotować fluorofory do użycia w nanoczujnikach pH, rozpuszczając 5-(i-6)-karboksyfluoresceinę, ester sukcynimidylowy (FAM-SE) (1,5 mg) w dimetyloformamidzie (DMF) (1 ml) w kolbie okrągłodennej i 6-karboksytetrametylododaminę, ester sukcynimidylowy (TAMRA-SE) (1,5 mg) w DMF (1 ml) w innej kolbie okrągłodennej. Dodać 3-aminopropylotrietoksysilan (APTES) (1,5 ml) do każdej kolby i mieszać w suchej atmosferze azotu (21 °C) przez 24 godziny w ciemności, tj. owinąć próbki w folię.
2. Dodać oba powyższe barwniki (250 μl) do mieszaniny etanolu (6 ml) i wodorotlenku amonu (30 % wag., 4 ml) znajdujących się w kolbie okrągłodennej i mieszać przez 1 godzinę (21 °C).
3. Powoli dodawać tetraetyloortokrzemian (TEOS) (0,5 ml) do mieszaniny, kontynuować mieszanie przez kolejne 2 godziny. Mieszanina stanie się mętna. Nanoczujniki mogą być zbierane przez odparowanie obrotowe. Nanoczujniki można przechowywać w szklanej fiolce w temperaturze 4 ^oC do wykorzystania w przyszłości.
   
   UWAGA: dalsze obchodzenie się z nanoczujnikami w postaci suchej powinno odbywać się pod wyciągiem wyciągowym lub w przypadku ich ważenia waga powinna być zamknięta, na przykład w sejfie.

1.2 Odpowiedź nanosensora na pH

1. Przygotować buforowe roztwory fosforanowe Sørensena o pH 5,5-8,0, mieszając określone proporcje roztworów podstawowych jednozasadowego (0,2 M) i dwuzasadowego (0,2 M) fosforanu sodu. Sprawdź końcowe pH za pomocą pH-metru. Dokonać drobnych korekt pH za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH) (4 M) lub kwasu solnego (HCl) (2 M).
2. Zawiesić nanoczujniki pH w pH (5 mg/ml), najpierw przytrzymując naczynie zawierające roztwór nanosensora w wirze przez 3 minuty, a następnie zanurzając naczynie w ultrasonografie, aż roztwór stanie się mętny (około 5 minut). Powtórz te kroki, aby całkowicie zawiesić nanoczujniki w roztworze.
3. Umieść pierwszy roztwór w kuwecie optycznej i użyj długości fali wzbudzenia 488 nm dla 5-(i-6)-karboksyfluoresceiny (FAM) i 568 nm dla 6-karboksytetrametylorodaminy (TAMRA). Zebrać długości fal emisji przy 500-530 nm dla FAM i 558-580 nm dla TAMRA za pomocą spektrometru fluorescencyjnego.
4. Zmień roztwory w kuwecie optycznej tak, aby można było zaobserwować pH przy innym pH i kontynuuj zbieranie widm emisyjnych.
5. Obliczyć stosunek maksymalnych emisji wytwarzanych przy każdej wartości pH, aby otrzymać krzywą kalibracyjną.

1.3 SEM nanosensorów

1. Umieść próbkę nanoczujników na pokrytym węglem króćcu mikroskopu elektronowego i napylaj złotem przez 5 minut w atmosferze argonu.
2. Obserwuj za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Podczas obrazowania dostosuj odległość roboczą, napięcie i powiększenie, aby zminimalizować ładunek elektronów (ilustracja 1).

2. Przygotowanie i analiza rusztowań PLGA

2.1 Elektroprzędzące rusztowania PLGA

1. W dygestorii rozpuścić poli(kwas mlekowo-glikolowy) (PLGA) w dichlorometanie (DCM) (20% (m/w)) z mrówczanem pirydyny (PF) (1% (w/w)). Umieścić roztwór w strzykawce o pojemności 10 ml z igłą o sile 18 g i bezpiecznie dopasować do pompy strzykawkowej.
2. Odsuń końcówkę igły na 20 cm od aluminiowej płytki zbierającej o wymiarach 20 cm x 15 cm.
3. Przymocuj elektrodę zasilacza wysokonapięciowego do końcówki strzykawki, a uziemienie do aluminiowej płytki zbiorczej.
   
   UWAGA: Należy zachować ostrożność, ponieważ używane jest wysokie napięcie, tj. zawsze wyłączaj zasilanie elektryczne przed obsługą jakiegokolwiek sprzętu do elektroprzędzenia.
4. Roztwór należy dostarczyć przy stałym natężeniu przepływu 3,5 m/h przy napięciu 12 kV przez 2 godziny. Elektroprzędzenie w tych warunkach zapewni głębokość rusztowania około 60 μm.
5. Pozostawić rusztowanie w dygestorii na 24 godziny, aby pozostałości rozpuszczalnika mogły odparować.

2.2 Elektroprzędzenie Rusztowania PLGA reagujące na pH

1. Przygotować rusztowania zawierające nanoczujniki reagujące na pH, jak opisano w sekcji 2.1, ale z modyfikacją polegającą na dodawaniu nanoczujników do roztworu polimeru (5 mg/ml). Zawieś nanoczujniki w roztworze PLGA za pomocą ultradźwięków (około 5 min) przed umieszczeniem w strzykawce o pojemności 10 ml.

2.3 SEM rusztowania PLGA i rusztowania reagującego na pH

1. Umieścić próbkę rusztowania PLGA lub rusztowania reagującego na pH na króćcu mikroskopu elektronowego pokrytego węglem i postępować zgodnie z opisem dla SEM nanoczujników (rysunek 1).

2.4 Kalibracja rusztowania reagującego na pH

1. Umieścić próbkę rusztowania reagującego na pH na płytce hodowlanej o średnicy 35 mm i zanurzyć w odpowiednich roztworach buforowych.
2. W mikroskopie konfokalnym użyj lasera argonowego o długości fali 488 nm do wzbudzenia FAM i lasera kryptonowego o długości fali 568 nm do wzbudzenia TAMRA w nanoczujnikach. Obserwować emisję fluorescencji dla rusztowań reagujących na pH przy 500-530 nm dla FAM i 558-580 nm dla TAMRA. (Rysunek 2). Użyj skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć zbierania długości fal wzbudzenia.

3. Hodowla komórkowa na rusztowaniach PLGA i rusztowaniach PLGA reagujących na pH

Uwaga: Następujące czynności powinny być wykonywane w komorze do hodowli komórkowych.

3.1 Przygotowanie rusztowań PLGA do hodowli komórkowych

1. Pociąć rusztowania PLGA lub PLGA reagujące na pH na 2 cm² części.
2. Sterylizuj rusztowania, naświetlając je światłem ultrafioletowym (UV) z odległości 8 cm przez 15 minut z każdej strony.
3. Przenieś rusztowania na 12-dołkową płytkę hodowlaną i umieść na niej stalowy pierścień. Dodać roztwór penicyliny/streptomycyny (5% v/v) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do wnętrza i na zewnątrz stalowego pierścienia, inkubować przez noc (37 °C, 5% CO₂ ). Zwróć uwagę, że stalowy pierścień został wyprodukowany na Uniwersytecie w Nottingham i ma następujące wymiary: 2 cm średnica zewnętrzna, 1 cm średnica wewnętrzna, 1 cm głębokość.
4. Usuń roztwór sterylizujący i przemyj PBS.
5. Dodać pożywkę do hodowli komórkowych do wnętrza (500 μl) i na zewnątrz (500 μl) stalowego pierścienia, umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ), przygotowując zawiesinę komórek.
6. Przygotować zawiesinę komórek i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą testu wykluczania błękitu trypanowego.
7. Utwórz zawiesinę komórek, aby uzyskać liczbę komórek 1 x 10⁶ komórek/ml.
8. Usuń nośnik z wewnątrz i na zewnątrz stalowego pierścienia.
9. Zastąp wstępnie podgrzaną pożywką do hodowli komórkowych na zewnątrz stalowego pierścienia (1 m).
10. Dodaj 300 μl zawiesiny komórek do wnętrza stalowego pierścienia - płytki skalnej do tyłu i do przodu, delikatnie rozprowadzając komórki.
11. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ) - przyłączenie komórek powinno nastąpić w ciągu 24 godzin, jednak kontynuuj hodowlę tak długo, jak wymaga tego eksperyment - odświeżając pożywkę co 2-3 dni.

3.2 Dostarczanie nanosensorów do komórek hodowanych na rusztowaniu PLGA

1. Komórki nasienne na rusztowanie PLGA zgodnie z opisem w sekcji 3.1. W tym badaniu użyto ślepego rusztowania PLGA (niezawierającego nanoczujników) ze względu na nakładanie się emisji fluorescencji podczas obrazowania.
2. Umieść rusztowanie wysiewane komórkami w inkubatorze (37 °C, 5% CO₂ ) na 72 godziny, aby umożliwić komórkom wzrost i migrację w całym rusztowaniu przed dostarczeniem nanosensorów.
3. Przed podaniem nanosensora przemyć komórki PBS i zmienić pożywkę ze standardowej pożywki hodowlanej na pożywkę wolną od antybiotyków i surowicy, inkubować (37 °C, 5% CO₂) przez 1 godzinę. Uwaga: standardowa pożywka hodowlana dla komórek 3T3 składa się z pożywki Dulbecco Modified Eagle's uzupełnionej płodową surowicą cielęcą (10% (v/v)), roztworem L-glutaminy (2 mM), penicylina/streptomycyna (1% (v/v)).
4. W okresie inkubacji przygotować kompleks nanosensor-liposom poprzez krótką sonikację nanoczujników (5 mg) za pomocą Optimem (50 μl) w celu wytworzenia roztworu A.
5. Stworzyć roztwór B, dodając Lipofectamine 2000 (5 μl) do Optimem (45 μl), inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
6. Dodaj roztwór A do roztworu B, inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utworzyć roztwór C, który jest kompleksem nanosensor-liposom.
7. Dodać roztwór C (100 μl) do komórek i inkubować (37 °C, 5% CO₂ ) przez 3 godziny.
8. Usunąć rusztowania z nasionami komórek z inkubatora, odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć PBS przed dodaniem PBS (1 ml), aby umożliwić wizualizację żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej. Uwaga: PBS został użyty w tym protokole, aby wskaźnik czerwieni fenolowej obecny w pożywkach do hodowli komórkowych nie powodował autofluorescencji, a także dlatego, że wykonywano kalibrację przy innym pH. Jednak pożywki wolne od czerwieni fenolowej mogą być stosowane do długoterminowej analizy kultur komórkowych.
9. Zanurz rusztowanie wysiewane komórkami w o różnym pH i monitoruj reakcję nanoczujników związanych z komórkami.
10. Monitoruj pHi, określając stosunek intensywności fluorescencji z FAM i TAMRA, obserwując fluorescencję za pomocą mikroskopii konfokalnej (ryc. 3).

3.3 Lokalizacja nanosensora w komórkach ssaków

1. Inkubować komórki za pomocą nanoczujników zawierających tylko barwnik FAM, jak opisano w sekcji 3.2 (dzieje się tak, ponieważ emisja fluorescencji TAMRA znajduje się w tym samym obszarze widmowym co LysoTracker Red). Przygotować te nanoczujniki w sposób opisany w sekcji 1.1, ale z pominięciem przygotowania i dodania TAMRA.
2. Po upływie okresu dostarczania nanosensora rozcieńczyć roztwór podstawowy LysoTracker Red do długości fali 50 nM.
3. Dodać podwielokrotność rozcieńczonego roztworu (2 μl) do komórek hodowanych na rusztowaniach PLGA.
4. Inkubować komórki za pomocą LysoTracker Red przez 1 godzinę (37 °C, 5% CO₂ ).
5. Po okresie inkubacji należy usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS (pH 7,4) przed zmianą pożywki na PBS (pH 7,4) (2 ml) w celu przygotowania do oglądania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Uwaga: Zamiast PBS można użyć pożywki wolnej od czerwieni fenolowej.
6. Dodać barwnik jądrowy Draq5 do PBS, tak aby końcowe stężenie wynosiło 5 μM i inkubować z komórkami przez 3 minuty (37 °C 5% CO₂ ). Nie jest konieczna zmiana pożywki po okresie inkubacji z Draq5.
7. Użyj lasera argonowego o długości fali 488 nm do wzbudzenia nanoczujników tylko FAM, lasera kryptonowego o długości fali 568 nm do wzbudzenia LysoTracker Red i lasera helowo-neonowego o długości fali 633 nm do wzbudzenia chromoforu Draq5 i obserwacji fluorescencji odpowiednio przy 500-530 nm, 580-600 nm, 650-750 nm (rysunek 3). Użyj skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć zbierania długości fal wzbudzenia.

Rozkład wielkości przygotowanych nanosensorów reagujących na pH został scharakteryzowany za pomocą SEM, gdzie zmierzono populację zobrazowanych nanosensorów i stwierdzono, że mają wymiary nanometrowe w zakresie 240-470 nm (Rysunek 1A). Osiągnięcie wąskiej i rozsądnie małej średnicy jest spójne z zastosowaniem metody Stöbera do otrzymywania nanocząstek. Stwierdzono, że zastosowanie zasadowego środowiska pH podczas syntezy nanocząstek, tj. nanocząstek otrzymanych metodą Stöbera, pozwala na dobrą kontrolę wielkości, podczas gdy przygotowanie w warunkach kwaśnych powoduje dużą dyspersję wielkości cząstek. Reprezentatywne mikrofotografie SEM włókien elektroprzędzonych PLGA wytworzonych przy użyciu opisanych metod pokazano na rysunku 1B, wykazując, że wytworzone rusztowanie PLGA składa się z włókien włókninowych wykazujących minimalne zgrubienia lub pęknięcia, gdy włókna mają wymiary nanometrowe. Rysunek 1C pokazuje, że dodanie nanoczujników do roztworu PLGA w stężeniu 5 mg / ml wytwarza włókna, które są porównywalne z próbką kontrolną na rysunku 1B, Mikrofotografie SEM dostarczają dowodów na asocjację nanoczujników na powierzchni włókien, jednak mogą one być również włączone do włókien rusztowania, badania degradacji tych rusztowań / rusztowań nanosensorowych można przeprowadzić w połączeniu z SEM i / lub konfokalnymi mikroskopii, aby ustalić, czy ma to wpływ na działanie nanoczujników.

Zdolność nanosensorów do zachowania swojej aktywności optycznej po włączeniu do światłowodów PLGA została zweryfikowana poprzez badanie samoopisujących się rusztowań za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zachowanie zdolności do pozostawania aktywnymi optycznie i chemicznie po włączeniu do włókien rusztowania może umożliwić monitorowanie stężeń analitu. Fluorescencja emitowana przez nanoczujniki wykazała, że nanoczujniki zachowały swoją aktywność optyczną i są związane z włóknami rusztowania. Fluorescencja emitowana przez barwniki FAM (zielony) i TAMRA (czerwony) zawarte w nanoczujnikach reagujących na pH pokazano odpowiednio na rysunkach 2A i 2B. Jest to pozytywny wynik, który umożliwia monitorowanie stężeń analitu in situ. Jest to również pierwszy raz, kiedy optycznie aktywne nanoczujniki ratiometryczne zostały włączone do włókien rusztowania PLGA przy użyciu procesu elektroprzędzenia. Po potwierdzeniu, że nanoczujniki mogą być wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po włączeniu do włókien PLGA, zweryfikowano reakcję nanoczujnika na zmiany stężenia analitu. Zanurzenie rusztowania w o różnym pH spowodowało zmianę intensywności fluorescencji w stosunku do barwnika FAM, podczas gdy fluorescencja emitowana przez barwnik referencyjny TAMRA nie uległa zauważalnej zmianie. Stosunek intensywności fluorescencji obu barwników można wykorzystać do wytworzenia krzywej kalibracyjnej, jak pokazano na rysunku 2C. Krzywa kalibracyjna dla nanoczujników ocenianych samodzielnie i po włączeniu do elektroprzędzonego rusztowania PLGA jest porównywalna i pokazuje, że nanoczujniki zachowują swoją aktywność optyczną po włączeniu do rusztowań samoraportujących. Zdolność rusztowania samoopisującego się do odwracalnego reagowania na różne wartości pH oceniano poprzez naprzemienne zanurzanie rusztowania w o wartościach pH 5,5 i 7,5. Stwierdzono, że odwracalność jest bardzo dobra, jak pokazano na rysunku 2D, gdzie rusztowanie samoopisujące się może reagować na liczne cykliczne zmiany pH. Nie przeprowadzono długoterminowych badań w celu oceny wpływu degradacji PLGA na włączenie nanoczujnika; Uważa się, że ponieważ nanoczujniki zapewniają odpowiedź ratiometryczną, ilość obecnych nanoczujników nie będzie miała wpływu na wynik.

Nanosensory reagujące na analit zostały dostarczone za pomocą liposomalnego środka transfekcji do wewnątrzkomórkowego środowiska fibroblastów 3T3, których wzrost był wspierany przez puste rusztowania PLGA. Obrazy z mikroskopii konfokalnej fibroblastów 3T3 hodowanych na ślepych rusztowaniach PLGA pokazują, że nanoczujniki są powiązane z komórkami fibroblastów z fluorescencją obserwowaną przez FAM i TAMRA pokazane odpowiednio na rysunkach 3A i B. Nakładanie fluorescencji z tych kanałów pokazuje, że fluorescencja z dwóch barwników jest kolokalizowana, co sugeruje, że barwniki pozostały uwięzione w biokompatybilnej matrycy nanoczujników (jak pokazano za pomocą żółtej fluorescencji na rysunku 3C). Uważa się, że nanoczujniki znajdują się w cytoplazmie fibroblastów 3T3 i nie są zawarte w przedziałach kwasowych, o czym świadczy brak kolokalizowanej fluorescencji z nanoczujników FAM i barwnika Lysotracker Red przedstawionego na rysunku 3D. Intensywność fluorescencji nanoczujników reagujących na pH dostarczanych do fibroblastów 3T3 była monitorowana, podczas gdy komórki poddano zmianom pH, których wyniki przedstawiono na rysunku 3E. Uzyskany wykres pokazuje, że komórki hodowane na elektroprzędzonym rusztowaniu PLGA utrzymały pH w zakresie 6,8-7,0.

Rysunek 1. Mikrofotografie SEM nanoczujników, włókien PLGA i rusztowań samoraportujących. (A) Reagujące na pH nanoczujniki zol-żel pokazujące sferyczne cząstki o rozmiarach nanometrów (B) Włókniny elektroprzędzone PLGA, w których morfologia włókien jest regularna z minimalnymi zgrubieniami i pęknięciami (C) Rusztowania samoraportujące reagujące na pH, w których można zaobserwować, że nanoczujniki wystają z PLGA, ale morfologia włókien pozostaje porównywalna z kontrolnymi włóknami PLGA, które nie zawierają nanoczujników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 2. Obrazy z mikroskopii konfokalnej rusztowań samoraportujących reagujących na pH, na których można zaobserwować fluorescencję za pomocą nanoczujników związanych z włóknami rusztowania PLGA. (A) FAM (zielony) to barwnik reagujący na pH, a (B) TAMRA (czerwony) to barwnik referencyjny. (C) Wykresy kalibracyjne nanoczujników zol-żel reagujących na pH i rusztowań reagujących na pH pokazują, że odpowiedź optyczna i chemiczna nanoczujników nie uległa zmianie po włączeniu do włókien rusztowania PLGA. (D) Odwracalność rusztowania samoopisującego się przez zanurzenie rusztowania w naprzemiennych roztworach buforowych o pH 5,5 i pH 7,5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Ryc. 3. Obrazy z mikroskopii konfokalnej zinternalizowanych nanoczujników komórkowych oraz wykresy odpowiedzi pH i pHi. Fluorescencja z uwewnętrznionych nanoczujników: (A) FAM (zielony), (B), TAMRA (czerwony), (C), kolokalizacja fluorescencji z FAM i TAMRA (żółty), (D) Tylko nanoczujniki FAM (zielone) dostarczane do fibroblastów 3T3 hodowanych na rusztowaniu PLGA z znakowaniem jądra Draq5 (magenta) i znakowaniem lizosomów LysoTracker na czerwono (czerwonym). Fluorescencja czerwieni FAM i Lysotracker nie jest kolokalizowana, co pokazuje, że jest mało prawdopodobne, aby nanoczujniki zostały zinternalizowane w komórkowych przedziałach kwasowych (E) pomiary pHi wykonane z nanoczujników dostarczonych do fibroblastów 3T3 hodowanych na ślepym rusztowaniu PLGA w porównaniu z kalibracją pH rusztowania wykrywającego pH bez hodowli komórek. Pokazuje to również, że pomiary pH wykonane za pomocą zinternalizowanych nanoczujników nie są kwaśne, ponieważ komórki hodowane na elektroprzędzonym rusztowaniu PLGA utrzymują pH w zakresie 6,8-7,0. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.