Izolacja ludzkich hepatocytów za pomocą dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy

Podsumowanie

Opisana jest zmodyfikowana dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do izolacji ludzkich hepatocytów. Metodę tę można również zastosować do wątroby innych ssaków. Wyizolowane hepatocyty są dostępne w wysokiej wydajności i żywotności, co czyni je odpowiednim modelem do badań naukowych w takich dziedzinach jak regeneracja wątroby, farmakokinetyka i toksykologia.

Streszczenie

Wątroba, organ o wyjątkowej zdolności regeneracji, pełni szeroki zakres funkcji, takich jak detoksykacja, metabolizm i homeostaza. W związku z tym hepatocyty są ważnym modelem dla wielu różnych pytań badawczych. W szczególności wykorzystanie ludzkich hepatocytów jest szczególnie ważne w dziedzinie farmakokinetyki, toksykologii, regeneracji wątroby i badań translacyjnych. W związku z tym metoda ta przedstawia zmodyfikowaną wersję dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu wyizolowania hepatocytów, jak opisano w Seglen ¹.

Poprzednio, hepatocyty były izolowane metodami mechanicznymi. Wykazano jednak, że metody enzymatyczne są lepsze, ponieważ hepatocyty zachowują swoją integralność strukturalną i funkcję po izolacji. Przedstawiona tutaj metoda dostosowuje metodę opracowaną wcześniej dla wątroby szczurów do kawałków wątroby ludzkiej i skutkuje dużą wydajnością hepatocytów o żywotności 77±10%. Główną różnicą w tej procedurze jest proces kaniulacji naczyń krwionośnych. Co więcej, opisana tutaj metoda może być również zastosowana do wątroby innych gatunków o porównywalnych rozmiarach wątroby lub naczyń krwionośnych.

Wprowadzenie

Zawiesina komórek wątroby może być przygotowana z wątroby metodami mechanicznymi lub enzymatycznymi. Metody mechaniczne stosowane do przygotowania całych komórek wątroby obejmują przetłaczanie wątroby przez gazę ², potrząsanie kawałkiem wątroby szklanymi kulkami w wytrząsarce Kahna ³, używanie homogenizatorów szklanych z luźnymi tłuczkami ^4,5 itp. Z biegiem lat metody mechaniczne wypadły z łask z powodu uszkodzenia błon komórkowych i utraty funkcji izolowanych hepatocytów ^6,7. W związku z tym zastosowanie metody enzymatycznej jest obecnie główną metodą izolacji hepatocytów.

Izolacja hepatocytów metodą enzymatyczną została znacznie ulepszona, gdy Berry i Friend ⁸ przeprowadzili perfuzję kolagenazy i hialuronidazy przez wątrobę przez żyłę wrotną u szczurów. Ten proces perfuzji wykorzystywał naczynia krwionośne, aby umożliwić enzymom bliski kontakt z większością komórek, co doprowadziło do 6-krotnego wzrostu wydajności hepatocytów ⁸. Co więcej, metoda ta pozwoliła uzyskać komórki, które zachowały swoją integralność strukturalną, praktycznie bez transformacji retikulum endoplazmatycznego w izolowane pęcherzyki i bez uszkodzenia mitochondriów ⁸.

Ta metoda została zmodyfikowana przez Seglen ¹, który był pionierem dwuetapowej procedury perfuzji do izolacji komórek wątroby. W tej procedurze wątroba szczura jest perfundowana za pomocą wolnego buforu Ca^{2 +}, a następnie perfuzji za pomocą buforu kolagenazy zawierającego Ca^{2 + 1}. Usunięcie Ca²⁺ w pierwszym etapie pomaga rozbić desmosomy, podczas gdy dodanie Ca²⁺ w drugim etapie jest wymagane dla optymalnej aktywności kolagenazy ^1,9.

Biorąc pod uwagę, że opublikowana praca opisana powyżej została wykonana na szczurach, ten artykuł ma na celu zademonstrowanie zmodyfikowanej procedury, która może być wykorzystana do izolacji hepatocytów o wysokiej żywotności z ludzkich wątrob. Wykorzystanie ludzkich hepatocytów pozostaje ważne dla badań translacyjnych i walidacji eksperymentów z wykorzystaniem modeli zwierzęcych. Fragmenty ludzkiej wątroby użyte w tym badaniu zostały pozyskane za zgodą na zarządzanie za pośrednictwem Human Tissue and Cell Research Foundation, kontrolowanej przez państwo fundacji non-profit ¹⁰. Po tym, jak patolog usunął to, co było wymagane do diagnozy, fragmenty wątroby zostały pobrane z pozostałej tkanki. Tkanka wycięta przez patologa była morfologicznie zdrową tkanką uzyskaną z marginesów resekcji po resekcji wątroby.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów do perfuzji i izolacji

1. Przygotować roztwory niezbędne do perfuzji fragmentu wątroby oraz izolacji hepatocytów zgodnie z Tabelą 1. Roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
2. Wszystkie roztwory przefiltrować sterylnie za pomocą filtra 0,22 μm.
3. Wszystkie roztwory mające kontakt z wątrobą muszą być sterylne.

2. Przygotowanie sprzętu i roztworów do perfuzji

1. Sprzęt do perfuzji fragmentu wątroby należy przygotować zgodnie z Rysunkiem 1.
2. Kąpiel wodną należy ustawić na odpowiednią temperaturę, która różni się w zależności od konkretnej konfiguracji eksperymentalnej, tak aby roztwory miały temperaturę 37 °C w momencie dotarcia do fragmentu wątroby. W tym przypadku kąpiel wodna jest ustawiona na 41 °C w celu ogrzania Roztworów 1, 2 i 3 oraz płaszczowego chłodniczki szklanej. Roztwór 4 należy ogrzać do 37 °C w osobnej kąpieli wodnej przed użyciem, aby zminimalizować utratę aktywności kolagenazy.
3. Tuż przed perfuzją wątroby należy otworzyć zawór butli z gazem 95% O₂/5% CO₂, aby napowietrzyć aparat do natleniania (Rysunek 1E).

3. Perfuzja wątroby

1. Od patologa należy otrzymać fragment wątroby z jak największą ilością nienaruszonej torebki Glissona i w idealnym przypadku z tylko jedną powierzchnią cięcia do perfuzji.
2. Umieścić ten fragment wątroby na lejku Büchnera zawierającym perforowany dysk filtrujący (Rycina 1B).
3. Układ perfuzyjny należy przygotować, wypełniając go Roztworem 1.
4. Przy niskim natężeniu przepływu zakrzywione kaniule irygacyjne z oliwkowymi końcówkami należy wprowadzić do większych naczyń krwionośnych na powierzchni cięcia fragmentu wątroby. W miarę wypłukiwania krwi z wątroby, tkanka staje się jaśniejsza w obszarach o dobrej perfuzji. Liczbę kaniul użytych dla różnych wielkości wątrób przedstawiono na Rycynie 2A. Wybrany rozmiar G (gauge) powinien zapewnić szczelne dopasowanie, które utrzyma kaniule na miejscu. Mniejsze naczynia krwionośne powinny pozostać otwarte, aby bufor perfuzyjny mógł odpływać z fragmentu wątroby.
5. Zwiększyć natężenie przepływu w pompie perystaltycznej do poziomu między 110-460 ml/min, w zależności od wielkości wątroby (Rycina 2B). Daje to średni przepływ 44±16 ml/min na kaniulę (Rycina 2C). Wybrana prędkość zależy od fragmentu wątroby i powinna prowadzić do lekkiego napęcznienia tkanki. W niektórych przypadkach może być konieczne zamknięcie niektórych otwartych naczyń za pomocą mikrozacisków naczyniowych, aby osiągnąć wspomniane wyżej lekkie napęcznienie. Prawidłową perfuzję można zaobserwować, gdy fragment wątroby ma jednolity, jaśniejszy kolor.
6. Podczas perfuzji należy utrzymywać fragment wątroby w stanie wilgotnym, przykrywając go kawałkiem gazy nasączonej solą fizjologiczną.
7. Przeprowadzić perfuzję 1 L Roztworu 1, aby wypłukać pozostałą krew z fragmentu wątroby.
8. Zmienić płyn perfuzyjny na Roztwór 2 i perfundować przez 10 min.
9. Zmienić płyn perfuzyjny na Roztwór 3 i przeprowadzić perfuzję 0,5 L.
10. Zmienić płyn perfuzyjny na Roztwór 4, który zawiera 0,1-0,15% kolagenazy (Tabela 2).
11. W tym kroku perfuzję należy prowadzić w trybie recyrkulacyjnym przez 9-12 min lub do momentu wystarczającego strawienia wątroby; tkanka wątroby powinna sprawiać wrażenie lekkiego rozpadowania się pod torebką Glissona i być miękka przy badaniu tępą stroną skalpela.

4. Izolacja hepatocytów

1. Wyłączyć pompę perystaltyczną i usunąć kaniule z fragmentu wątroby.
2. Umieścić fragment wątroby w naczyniu krystalizacyjnym zawierającym 100-200 ml Roztworu 5.
3. Ostrożnie usunąć torebkę Glissona i delikatnie wypłukać komórki. W przypadku obszarów słabo perfundowanych można użyć skalpela, aby przeciąć te miejsca i uwolnić znajdujące się w nich komórki. W razie potrzeby w trakcie procesu dodawać więcej Roztworu 5.
4. Dodawać Roztwór 5, aż do osiągnięcia końcowej objętości 500 ml.
5. Przefiltrować zawiesinę komórkową dwukrotnie: najpierw przez nylonową siatkę 210 μm, a następnie przez nylonową siatkę 70 μm. Następnie przelać zawiesinę komórkową do probówek do wirowania o pojemności 200 ml.
6. Wirować zawiesinę komórkową przy 72 g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odessać nadsącz i delikatnie resuspendować osad komórkowy w 200 ml Roztworu 5.
7. Powtórzyć etap płukania numer 4.6 trzy razy. Po ostatnim wirowaniu resuspendować komórki w zimnym roztworze do przechowywania (patrz lista materiałów). Stężenie komórek powinno wynosić około 2-5 milionów hepatocytów na mililitr w celu oceny wydajności i żywotności za pomocą testu wykluczania błękitu trypanu z użyciem hemocytometru.
8. Aby przeprowadzić test wykluczania błękitu trypanu, dodać 0,1 ml odpowiednio rozcieńczonych komórek (≈2-5 milionów/ml) do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 0,5 ml roztworu błękitu trypanu (0,4% błękitu trypanu rozpuszczonego w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS)) i 0,4 ml PBS. Po dokładnym wymieszaniu zawiesiny komórkowej, napełnić hemocytometr zawiesiną i zbadać pod mikroskopem przy powiększeniu 100X. W badaniu mikroskopowym martwe komórki będą zabarwione na niebiesko, natomiast żywe pozostaną niezatopione. Policzyć liczbę komórek żywych i całkowitych w każdym z pól o powierzchni 1 mm² zaznaczonych na hemocytometrze. Żywotność (%), wydajność żywych komórek (milionów hepatocytów na ml zimnego roztworu do przechowywania (CSS) lub milionów hepatocytów na g wątroby) można obliczyć za pomocą poniższych wzorów.

Uwaga: W tym przypadku czynnik rozcieńczenia błękitu trypanu wynosi 10, a czynnik hemocytometru wynosi 10 000.

Wyniki

Konfiguracja perfuzji

Wyposażenie wymagane do perfuzji wątroby należy przygotować zgodnie z Rysunkiem 1.

Żywotność i wydajność wyizolowanych hepatocytów ludzkich

Średnia żywotność wyizolowanych ludzkich hepatocytów wynosiła 77±10%, a średnia wydajność izolacji hepatocytów wyniosła 13±11 milionów hepatocytów/g wątroby, przy czym wartości wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe. Liczba izolacji hepatocytów przeprowadzonych...

Dyskusja

Protokół ten skutkuje izolacją ludzkich hepatocytów o wysokiej żywotności i czystości. Aby osiągnąć te wyniki, ważne jest, aby zacząć od odpowiedniego kawałka wątroby. Kawałek wątroby powinien mieć nienaruszoną torebkę Glissona na wszystkich powierzchniach z wyjątkiem 1 powierzchni cięcia. Innym ważnym czynnikiem jest konkretna partia użytej kolagenazy, ponieważ różne partie mogą powodować znaczne różnice w żywotności hepatocytów po trawieniu ¹¹. Dlatego należy badać różne partie kolagenazy, a partię, która wy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pułapka bąbelkowa	Gaß ner Glastechnik
Skraplacz z płaszczem szklanym	Gaß ner Glastechnik
41 &stopnie; C Łaźnia wodna	Julabo	35723-H24/EG&	nbsp;
37 &stopnie; C Łaźnia wodna	GFL	1083
Butla ze sprężonym gazem (95 % O2/5 % CO2)	Linde
Rurka przepuszczająca gaz	Neolab	2-4440
Pompa perystaltyczna	Ismatec	IP65
	Skalpel Pióro	320010
Kleszcze	Omnilab	5171014
Kolby stożkowe 1 L	Schott Duran	2121654
Kolby stożkowe 5 L	Schott Duran	2121673
Zlewki	Schott Duran	2110654
Probówki wirówkowe 200 ml	Becton Dickinson	352075
Naczynie krystalizujące	Omnilab	5144063
Zakrzywione kaniule irygacyjne z końcówkami kulowymi	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Zaciski mikronaczyniowe	Ernst Kratz GmbH
Bü Lejek kanałowy	Carl Roth	HT38.1
Siatka nylonowa 210 μ m	Neolab	4-1413
Siatka nylonowa 70 μ m	Neolab	4-1419
0,22 &m; m filtry sterylne	Peske	99505
Butelki 500 ml	Schott Duran	2180144
Butelki 1 L	Schott Duran	2180154
Hemocytometr	Peske	06-0001
Probówki 1,5 ml	Eppendorf	0030 120,086
Probówki stożkowe 50 ml	BD Biosciences	352070
Wiadro na lód	Neolab	1508454
Sterylne pipety Pasteura	Marka	747715
Zmotoryzowany napełniacz do pipet (Pipette boy acu)	Integra	155017
Wirówka chłodnicza	Eppendorf	5810R
Kendro	z przepływem laminarnym-KS9
Aspirator (chirurgiczna pompa ssąca o niskim przepływie)	Atmos	C361
Laboratoryjny palnik	gazowy Integra	Fire Boy eco
Jednorazowy fartuch laboratoryjny	Paperlynen GmbH	MD0202414
Maska chirurgiczna z przyłbicą	Kimberly-Clark	48247
Kaptur chirurgiczny	Barrier	42072
Rękawice lateksowe	Semper Care	CE0321
Kolagenaza (numer partii NB 4G)	Serva	17465
Chlorek wapnia dwuwodny	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Chlorek sodu	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Chlorek potasu	Serva	26868
Albumina	Biomol	01400-2
	Glukoza Serva	22700
Wodorowęglan sodu	Serva	30180
0,4% roztwór błękitu trypanowego	Lonza	17-942E
Rozwiązanie do przechowywania w chłodni	Hepacult GmbH