Opisana jest zmodyfikowana dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do izolacji ludzkich hepatocytów. Metodę tę można również zastosować do wątroby innych ssaków. Wyizolowane hepatocyty są dostępne w wysokiej wydajności i żywotności, co czyni je odpowiednim modelem do badań naukowych w takich dziedzinach jak regeneracja wątroby, farmakokinetyka i toksykologia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja ludzkich hepatocytów za pomocą dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Wątroba, organ o wyjątkowej zdolności regeneracji, pełni szeroki zakres funkcji, takich jak detoksykacja, metabolizm i homeostaza. W związku z tym hepatocyty są ważnym modelem dla wielu różnych pytań badawczych. W szczególności wykorzystanie ludzkich hepatocytów jest szczególnie ważne w dziedzinie farmakokinetyki, toksykologii, regeneracji wątroby i badań translacyjnych. W związku z tym metoda ta przedstawia zmodyfikowaną wersję dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu wyizolowania hepatocytów, jak opisano w Seglen 1.
Poprzednio, hepatocyty były izolowane metodami mechanicznymi. Wykazano jednak, że metody enzymatyczne są lepsze, ponieważ hepatocyty zachowują swoją integralność strukturalną i funkcję po izolacji. Przedstawiona tutaj metoda dostosowuje metodę opracowaną wcześniej dla wątroby szczurów do kawałków wątroby ludzkiej i skutkuje dużą wydajnością hepatocytów o żywotności 77±10%. Główną różnicą w tej procedurze jest proces kaniulacji naczyń krwionośnych. Co więcej, opisana tutaj metoda może być również zastosowana do wątroby innych gatunków o porównywalnych rozmiarach wątroby lub naczyń krwionośnych.
Wprowadzenie
Zawiesina komórek wątroby może być przygotowana z wątroby metodami mechanicznymi lub enzymatycznymi. Metody mechaniczne stosowane do przygotowania całych komórek wątroby obejmują przetłaczanie wątroby przez gazę 2, potrząsanie kawałkiem wątroby szklanymi kulkami w wytrząsarce Kahna 3, używanie homogenizatorów szklanych z luźnymi tłuczkami 4,5 itp. Z biegiem lat metody mechaniczne wypadły z łask z powodu uszkodzenia błon komórkowych i utraty funkcji izolowanych hepatocytów 6,7. W związku z tym zastosowanie metody enzymatycznej jest obecnie główną metodą izolacji hepatocytów.
Izolacja hepatocytów metodą enzymatyczną została znacznie ulepszona, gdy Berry i Friend 8 przeprowadzili perfuzję kolagenazy i hialuronidazy przez wątrobę przez żyłę wrotną u szczurów. Ten proces perfuzji wykorzystywał naczynia krwionośne, aby umożliwić enzymom bliski kontakt z większością komórek, co doprowadziło do 6-krotnego wzrostu wydajności hepatocytów 8. Co więcej, metoda ta pozwoliła uzyskać komórki, które zachowały swoją integralność strukturalną, praktycznie bez transformacji retikulum endoplazmatycznego w izolowane pęcherzyki i bez uszkodzenia mitochondriów 8.
Ta metoda została zmodyfikowana przez Seglen 1, który był pionierem dwuetapowej procedury perfuzji do izolacji komórek wątroby. W tej procedurze wątroba szczura jest perfundowana za pomocą wolnego buforu Ca2 +, a następnie perfuzji za pomocą buforu kolagenazy zawierającego Ca2 + 1. Usunięcie Ca2+ w pierwszym etapie pomaga rozbić desmosomy, podczas gdy dodanie Ca2+ w drugim etapie jest wymagane dla optymalnej aktywności kolagenazy 1,9.
Biorąc pod uwagę, że opublikowana praca opisana powyżej została wykonana na szczurach, ten artykuł ma na celu zademonstrowanie zmodyfikowanej procedury, która może być wykorzystana do izolacji hepatocytów o wysokiej żywotności z ludzkich wątrob. Wykorzystanie ludzkich hepatocytów pozostaje ważne dla badań translacyjnych i walidacji eksperymentów z wykorzystaniem modeli zwierzęcych. Fragmenty ludzkiej wątroby użyte w tym badaniu zostały pozyskane za zgodą na zarządzanie za pośrednictwem Human Tissue and Cell Research Foundation, kontrolowanej przez państwo fundacji non-profit 10. Po tym, jak patolog usunął to, co było wymagane do diagnozy, fragmenty wątroby zostały pobrane z pozostałej tkanki. Tkanka wycięta przez patologa była morfologicznie zdrową tkanką uzyskaną z marginesów resekcji po resekcji wątroby.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie roztworów do perfuzji i izolacji
- Przygotować roztwory niezbędne do perfuzji fragmentu wątroby oraz izolacji hepatocytów zgodnie z Tabelą 1. Roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
- Wszystkie roztwory przefiltrować sterylnie za pomocą filtra 0,22 μm.
- Wszystkie roztwory mające kontakt z wątrobą powinny być sterylne.
2. Przygotowanie sprzętu i roztworów do perfuzji
- Sprzęt do perfuzji fragmentu wątroby należy przygotować zgodnie z Rysunkiem 1.
- Kąpiel wodną należy ustawić w odpowiedniej temperaturze, zależnej od konkretnej konfiguracji eksperymentalnej, tak aby roztwory miały temperaturę 37 °C w momencie dotarcia do fragmentu wątroby. W tym przypadku kąpiel wodną ustawiono na 41 °C, aby ogrzać roztwory 1, 2 i 3 oraz płaszczowy chłodnicę szklaną. Roztwór 4 należy ogrzać do 37 °C w osobnej kąpieli wodnej przed użyciem, aby ograniczyć utratę aktywności kolagenazy.
- Tuż przed perfuzją wątroby należy otworzyć zawór butli z gazem 95% O2/5% CO2 w celu napowietrzenia aparatury do oksygenacji (Rysunek 1E).
3. Perfuzja wątroby
- Od patologa należy otrzymać fragment wątroby z jak największą ilością nienaruszonej torebki Glissona i idealnie z tylko jedną powierzchnią cięcia w celu przeprowadzenia perfuzji.
- Umieścić ten fragment wątroby na lejku Büchnera, który zawiera perforowaną dyszkę filtrującą (Rysunek 1B).
- Układ perfuzyjny należy przygotować (odpowietrzyć) za pomocą Roztworu 1.
- Przy niskim natężeniu przepływu, zakrzywione kaniule irygacyjne z oliwkowymi końcówkami należy wprowadzić do większych naczyń krwionośnych na powierzchni cięcia fragmentu wątroby. W miarę wypłukiwania krwi z wątroby, tkanka staje się jaśniejsza w obszarach o dobrej perfuzji. Liczba kaniul użytych dla różnych wielkości wątrób jest przedstawiona na Rysunku 2A. Wybrany rozmiar (gauge) powinien zapewnić ciasne dopasowanie, które utrzyma kaniule na miejscu. Mniejsze naczynia krwionośne powinny pozostać otwarte, aby bufor perfuzyjny mógł odpływać z fragmentu wątroby.
- Zwiększyć natężenie przepływu pompy perystaltycznej do wartości między 110-460 ml/min w zależności od wielkości wątroby (Rysunek 2B). Daje to średnie natężenie przepływu 44±16 ml/min na kaniulę (Rysunek 2C). Wybrana prędkość zależy od fragmentu wątroby i powinna prowadzić do lekkiego napęcznienia tkanki. W niektórych przypadkach może być konieczne zaklamrowanie niektórych otwartych naczyń za pomocą mikronaczyń zacisków, aby uzyskać wspomniane wyżej lekkie napęcznienie. Dobrą perfuzję można zaobserwować, gdy fragment wątroby ma jaśniejszy kolor w całej swojej objętości.
- Podczas perfuzji należy utrzymywać fragment wątroby w stanie wilgotnym, przykrywając go kawałkiem gazy nasączonej solą fizjologiczną.
- Przeprowadzić perfuzję 1 L Roztworu 1, aby wypłukać pozostałą krew z fragmentu wątroby.
- Zmienić płyn do perfuzji na Roztwór 2 i perfundować przez 10 min.
- Zmienić płyn do perfuzji na Roztwór 3 i perfundować 0,5 L.
- Zmienić płyn do perfuzji na Roztwór 4, który zawiera 0,1-0,15% kolagenazy (Tabela 2).
- W tym kroku perfuzja powinna być prowadzona w trybie recyrkulacyjnym przez 9-12 min lub do momentu wystarczającego strawienia wątroby; tkanka wątroby powinna sprawiać wrażenie lekkiego rozpadania się pod torebką Glissona i być miękka w dotyku podczas badania tępą stroną skalpela.
4. Izolacja hepatocytów
- Wyłącz pompę perystaltyczną i usuń kaniule z fragmentu wątroby.
- Umieść fragment wątroby w naczyniu krystalizacyjnym zawierającym 100-200 ml Roztworu 5.
- Ostrożnie usuń torebkę Glissona i delikatnie wytrzep komórki. W przypadku obszarów, które nie zostały dobrze przepłukane, można użyć skalpela, aby przeciąć te regiony i uwolnić zawarte w nich komórki. W razie potrzeby w trakcie tego procesu dodaj więcej Roztworu 5.
- Dodaj więcej Roztworu 5, aż uzyskano objętość końcową 500 ml.
- Przefiltruj zawiesinę komórkową dwukrotnie; najpierw przez nylonowe sito 210 μm, a następnie przez nylonowe sito 70 μm. Następnie przelej zawiesinę komórkową do probówek do wirowania o pojemności 200 ml.
- Wirować zawiesinę komórkową przy 72 g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Odessaj nadsącz i delikatnie resuspenduj osad komórkowy w 200 ml Roztworu 5.
- Powtórz etap płukania numer 4.6 trzykrotnie. Podczas ostatniego etapu wirowania resuspenduj komórki w zimnym roztworze do przechowywania (patrz lista materiałów). Stężenie komórek powinno wynosić około 2-5 milionów hepatocytów na mililitr w celu oceny wydajności i żywotności za pomocą testu wykluczania błękitu trypanu z użyciem komory countingowej (hemocytometru).
- Aby przeprowadzić test wykluczania błękitu trypanu, dodaj 0,1 ml odpowiednio rozcieńczonych komórek (≈2-5 milionów/ml) do probówki do mikrowirowania zawierającej 0,5 ml roztworu błękitu trypanu (0,4% błękitu trypanu rozpuszczonego w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS)) oraz 0,4 ml PBS. Po dokładnym wymieszaniu zawiesiny komórkowej, napełnij komorę countingową zawiesiną i obejrzyj pod mikroskopem przy powiększeniu 100X. Pod mikroskopem martwe komórki będą zabarwione na niebiesko, natomiast żywe komórki pozostaną niezabarwione. Policz liczbę komórek żywych i całkowitych w każdym z siatek 1 mm2 zaznaczonych na komorze countingowej. Żywotność (%), wydajność żywych komórek (miliony hepatocytów na ml zimnego roztworu do przechowywania (CSS) lub miliony hepatocytów na g wątroby) można obliczyć za pomocą poniższych wzorów.
Uwaga: W tym przypadku współczynnik rozcieńczenia błękitu trypanu wynosi 10, a współczynnik hemocytometru wynosi 10 000.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Konfiguracja perfuzji
Sprzęt wymagany do perfuzji wątroby należy przygotować zgodnie z Rysunkiem 1.
Żywotność i wydajność wyizolowanych hepatocytów ludzkich
Średnia żywotność izolowanych ludzkich hepatocytów wynosiła 77±10%, a średnia wydajność hepatocytów wynosiła 13±11 milionów hepatocytów/g wątroby, przy czym wartości wyrażono jako średnia ± odchylenie standardowe. Liczba przeprowadzonych izolacji hepatocytów w celu uzyskani...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten skutkuje izolacją ludzkich hepatocytów o wysokiej żywotności i czystości. Aby osiągnąć te wyniki, ważne jest, aby zacząć od odpowiedniego kawałka wątroby. Kawałek wątroby powinien mieć nienaruszoną torebkę Glissona na wszystkich powierzchniach z wyjątkiem 1 powierzchni cięcia. Innym ważnym czynnikiem jest konkretna partia użytej kolagenazy, ponieważ różne partie mogą powodować znaczne różnice w żywotności hepatocytów po trawieniu 11. Dlatego należy badać różne partie kolagenazy, a partię, która wy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Optymalizacja tego protokołu została częściowo sfinansowana z grantu firmy Hepacult GmbH. Dr Wolfgang Thasler jest jednym z założycieli Hepacult GmbH i pozostaje jednym z członków zarządu tej firmy. Zatrudnienie Maresy Demmel jest częściowo przez Hepacult. Maria Hauner jest zatrudniona w Hepacult GmbH. Hepacult to firma biotechnologiczna typu spin-off z Uniwersytetu, która oferuje ludzkie hepatocyty za zgodą i otwartym dostępem do celów badawczych.
Podziękowania
Ta praca była możliwa dzięki Fundacji Badań nad Tkankami Ludzkimi i Komórkami, która udostępnia ludzkie tkanki do badań. Wsparcie finansowe na te prace otrzymało Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (nazwa grantu: Virtual Liver Network, numer grantu: 0315759) oraz Hepacult GmbH. Podziękowania kierujemy również do asystentów technicznych z Banku Tkanek Szpitala Grosshadern za pobranie próbek wątroby oraz asystentów technicznych z Zakładu Izolacji Komórek za przeprowadzenie perfuzji wątroby i izolacji hepatocytów. W szczególności chcielibyśmy podziękować Natalji Löwen za zademonstrowanie tej procedury w filmie. Na koniec chcielibyśmy podziękować Natalji Löwen i Edeltraud Hanesch za stworzenie ilustracji do rysunku 1 oraz rysunków w schematycznym przeglądzie filmu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pułapka bąbelkowa | Gaß ner Glastechnik | ||
| Skraplacz z płaszczem szklanym | Gaß ner Glastechnik | ||
| 41 &stopnie; C Łaźnia wodna | Julabo | 35723-H24/EG& | nbsp; |
| 37 &stopnie; C Łaźnia wodna | GFL | 1083 | |
| Butla ze sprężonym gazem (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| Rurka przepuszczająca gaz | Neolab | 2-4440 | |
| Pompa perystaltyczna | Ismatec | IP65 | |
| Skalpel Pióro | 320010 | ||
| Kleszcze | Omnilab | 5171014 | |
| Kolby stożkowe 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Kolby stożkowe 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Zlewki | Schott Duran | 2110654 | |
| Probówki wirówkowe 200 ml | Becton Dickinson | 352075 | |
| Naczynie krystalizujące | Omnilab | 5144063 | |
| Zakrzywione kaniule irygacyjne z końcówkami kulowymi | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Zaciski mikronaczyniowe | Ernst Kratz GmbH | ||
| Bü Lejek kanałowy | Carl Roth | HT38.1 | |
| Siatka nylonowa 210 μ m | Neolab | 4-1413 | |
| Siatka nylonowa 70 μ m | Neolab | 4-1419 | |
| 0,22 &m; m filtry sterylne | Peske | 99505 | |
| Butelki 500 ml | Schott Duran | 2180144 | |
| Butelki 1 L | Schott Duran | 2180154 | |
| Hemocytometr | Peske | 06-0001 | |
| Probówki 1,5 ml | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| Probówki stożkowe 50 ml | BD Biosciences | 352070 | |
| Wiadro na lód | Neolab | 1508454 | |
| Sterylne pipety Pasteura | Marka | 747715 | |
| Zmotoryzowany napełniacz do pipet (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Wirówka chłodnicza | Eppendorf | 5810R | |
| Kendro | z przepływem laminarnym-KS9 | ||
| Aspirator (chirurgiczna pompa ssąca o niskim przepływie) | Atmos | C361 | |
| Laboratoryjny palnik | gazowy Integra | Fire Boy eco | |
| Jednorazowy fartuch laboratoryjny | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Maska chirurgiczna z przyłbicą | Kimberly-Clark | 48247 | |
| Kaptur chirurgiczny | Barrier | 42072 | |
| Rękawice lateksowe | Semper Care | CE0321 | |
| Kolagenaza (numer partii NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Chlorek wapnia dwuwodny | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Chlorek sodu | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Chlorek potasu | Serva | 26868 | |
| Albumina | Biomol | 01400-2 | |
| Glukoza Serva | 22700 | ||
| Wodorowęglan sodu | Serva | 30180 | |
| 0,4% roztwór błękitu trypanowego | Lonza | 17-942E | |
| Rozwiązanie do przechowywania w chłodni | Hepacult GmbH |
Bibliografia
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 149, 217-227 (1943).
- Aubin, P. M. G., Bucher, N. L. R. A Study of Binucleate Cell Counts in Resting and Regenerating Rat Liver Employing a Mechanical Method for the Separation of Liver Cells. Anat. Rec. 112, 797-809 (1952).
- Anderson, N. G. The Mass Isolation of Whole Cells from Rat Liver. Science. 117, 627-628 (1953).
- Jacob, S. T., Bhargava, P. M. New Method for Preparation of Liver Cell Suspensions. Experimental Cell Research. 27 (62), 453-467 (1962).
- Berry, M. N. Metabolic Properties of Cells Isolated from Adult Mouse Liver. Journal of Cell Biology. 15, 1-8 (1962).
- Laws, J. O., Stickland, L. H. Metabolism of Isolated Liver Cells. Nature. 178, 309-310 (1038).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. The Journal of Cell Biology. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of Rat-Liver Cells .3. Enzymatic Requirements for Tissue Dispersion. Experimental Cell Research. 82 (73), 391-398 (1973).
- Thasler, W. E., et al. Charitable State-Controlled Foundation Human Tissue and Cell Research: Ethic and Legal Aspects in the Supply of Surgically Removed Human Tissue For Research in the Academic and Commercial Sector in Germany. Cell and Tissue Banking. 4, 49-56 (2003).
- Queral, A. E., DeAngelo, A. B., Garrett, C. T. Effect of different collagenases on the isolation of viable hepatocytes from rat liver. Analytical Biochemistry. 138, 235-237 (1984).
- Smedsrod, B., Pertoft, H. Preparation of Pure Hepatocytes and Reticuloendothelial Cells in High-Yield from a Single-Rat Liver by Means of Percoll Centrifugation and Selective Adherence. J. Leukocyte Biol. 38, 213-230 (1985).
- Cantrell, E., Bresnick, E. Benzpyrene Hydroxylase-Activity in Isolated Parenchymal and Nonparenchymal Cells of Rat-Liver. Journal of Cell Biology. 52, 316-321 (1972).
- Weiskirchen, R., Gressner, A. M. Isolation and culture of hepatic stellate cells. Methods in Molecular Medicine. 117, 99-113 (2005).
- Baccarani, U., et al. Steatotic versus cirrhotic livers as a source for human hepatocyte isolation. Transplant P. 33, 664-665 (2001).
- Renz, J. F., et al. Utilization of extended donor criteria liver allografts maximizes donor use and patient access to liver transplantation. Annals of Surgery. 242, 556-563 (2005).
- Schemmer, P., et al. Extended donor criteria have no negative impact on early outcome after liver transplantation: a single-center multivariate analysis. Transplant Proc. 39, 529-534 (2007).
- Alexandre, E., et al. Influence of pre-, intra- and post-operative parameters of donor liver on the outcome of isolated human hepatocytes. Cell and Tissue Banking. 3, 223-233 (2002).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. State-of-the-art review: Hemostats, sealants, and adhesives II: Update as well as how and when to use the components of the surgical toolbox. Clinical and applied thrombosis/hemostasis : official journal of the International Academy of Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 16, 497-514 (2010).
- Spotnitz, W. D., Burks, S. Hemostats, sealants, and adhesives III: a new update as well as cost and regulatory considerations for components of the surgical toolbox. Transfusion. 52, 2243-2255 (2012).
- Toriumi, D. M., Raslan, W. F., Friedman, M., Tardy, M. E. Histotoxicity of cyanoacrylate tissue adhesives. A comparative study. Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 116, 546-550 (1990).
- Vinters, H. V., Galil, K. A., Lundie, M. J., Kaufmann, J. C. The histotoxicity of cyanoacrylates. A selective review. Neuroradiology. 27, 279-291 (1985).
- Bhogal, R. H., et al. Isolation of primary human hepatocytes from normal and diseased liver tissue: a one hundred liver experience. PloS ONE. 6, e18222(2011).
- Olson, H., et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regul. Toxicol. Pharm. 32, 56-67 (2000).
- Koebe, H. G., Pahernik, S. A., Sproede, M., Thasler, W. E., Schildberg, F. W. Porcine hepatocytes from slaughterhouse organs. An unlimited resource for bioartificial liver devices. ASAIO Journal. 41, 189-193 (1995).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Methuen. (1959).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
