Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Podsumowanie

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Streszczenie

Modele in vitro wykorzystujące ludzkie pierwotne komórki nabłonkowe są niezbędne do zrozumienia kluczowych funkcji nabłonka oddechowego w kontekście infekcji mikrobiologicznych lub czynników wziewnych. Bezpośrednie porównania komórek uzyskanych z chorych populacji pozwalają scharakteryzować różne fenotypy i przeanalizować mechanizmy pośredniczące w zmianach funkcji komórek nabłonkowych. Hodowla komórek nabłonkowych z ludzkiego obszaru tchawicy i oskrzeli została dobrze udokumentowana, ale jest ograniczona dostępnością ludzkiej tkanki płucnej lub inwazyjnością związaną z uzyskaniem biopsji szczoteczek oskrzelowych. Komórki nabłonka nosa uzyskuje się poprzez znacznie mniej inwazyjne powierzchowne biopsje skrobania nosa, a badani mogą być poddawani wielokrotnej biopsji bez znaczących skutków ubocznych. Ponadto nos jest punktem wejścia do układu oddechowego, a zatem jednym z pierwszych miejsc, które są narażone na wszelkiego rodzaju stresory przenoszone drogą powietrzną, takie jak czynniki mikrobiologiczne, zanieczyszczenia lub alergeny.

Krótko mówiąc, komórki nabłonka nosa uzyskane od ludzkich ochotników są rozwijane na powlekanych płytkach do hodowli tkankowych, a następnie przenoszone na wkładki do hodowli komórkowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są nadal hodowane na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) przez kilka tygodni, co stwarza bardziej fizjologicznie istotne warunki. W warunkach hodowli ALI wykorzystuje się zdefiniowane pożywki prowadzące do zróżnicowanego nabłonka, który wykazuje cechy morfologiczne i funkcjonalne podobne do ludzkiego nabłonka nosa, z komórkami orzęsionymi i wytwarzającymi śluz. Wstawki do hodowli tkankowych ze zróżnicowanymi komórkami nabłonka nosa mogą być manipulowane na różne sposoby w zależności od pytań badawczych (leczenie środkami farmakologicznymi, transdukcja wektorami lentiwirusowymi, narażenie na gazy lub zakażenie czynnikami mikrobiologicznymi) i analizowane pod kątem wielu różnych punktów końcowych, począwszy od szlaków komórkowych i molekularnych, zmian funkcjonalnych, morfologii itp.

Modele in vitro zróżnicowanych ludzkich komórek nabłonka nosa umożliwią badaczom rozwiązywanie nowych i ważnych pytań badawczych za pomocą organotypowych modeli eksperymentalnych, które w dużej mierze naśladują nabłonek nosa in vivo.

Wprowadzenie

Cel techniki

Komórki nabłonkowe (EC) w drogach oddechowych są jednymi z pierwszych miejsc, które są bezpośrednio narażone na wdychane stresory środowiskowe, takie jak patogeny, alergeny czy zanieczyszczenia powietrza. EC są czymś więcej niż barierą strukturalną: działają jak centrala do inicjowania i regulowania odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego^1-3 poprzez uwalnianie rozpuszczalnych mediatorów^4-6 i ekspresję ligandów/receptorów na ich powierzchni ^7-9. Podczas gdy unieśmiertelnione linie komórkowe mogą być używane jako modele do badania EC układu oddechowego in vitro, nie różnicują się one w....

Protokół

1. Przygotuj plastikowe wyroby: Talerz

1. Dodaj 500 μl PureCol (1:100 rozcieńczony sterylną wodą) do każdego dołka na 12-dołkowej płytce.
2. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 30 minut, wyjąć PureCol i przepłukać HBSS tuż przed dodaniem komórek do płytki (patrz krok 3.1 poniżej).

2. Uzyskiwanie i wstępne leczenie biopsji ludzkich NEC

1. Biopsja skrobania z nosa
   1. Uzyskać powierzchowne EC wyściełające małżowiny nosowe w bezpośrednim widzeniu za pomocą 9-milimetrowego wziernika nosowego wielokrotnego użytku z polipropylenu (model 22009) na otoskopie operacyjnym ze wziernikiem (model 21....

Wyniki

NECs hodowane zgodnie z opisanym tutaj protokołem redyferencjują się w heterogenną warstwę ECs składającą się z komórek rzęskowych i nierzęskowych, co odzwierciedla sytuację in vivo (Rysunek 1). Niektóre z zróżnicowanych NECs produkują śluz (komórki barwiące się na niebiesko przy użyciu AB/PAS, Rysunek 1B). Mimo że przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany, stopień różnicowania może być zmienny pod względem rozkładu ogólnych populacji komórek (t.j. różne stosunk.......

Dyskusja

Oddechowe EC zapewniają nie tylko fizyczną barierę chroniącą organizm ludzki przed bodźcami egzogennymi²⁰, ale także działają jako centrala do inicjowania i regulowania odpowiedzi immunologicznych układu oddechowego^1-3 poprzez wydzielanie rozpuszczalnych mediatorów lub bezpośrednie interakcje receptor-ligand komórka-komórka. W celu dalszego badania roli EC w odpowiedzi immunologicznej, zbadania potencjalnych różnic między EC a populacjami chorymi lub zbadania wpływu egzogennych czynników stresogenny.......

Materiały

₂

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wziernik do nosa	Welch Allyn	Model 22009	9 mm, polipropylen wielokrotnego użytku
Otoskop operacyjny	Welch Allyn	Model 21700
Kuweta na komórki z sondą Rhino	Arlington Scientific	SY-96-092	zegnij trochę bardziej główkę kuwety
12-dołkowe płytki hodowlane	Corning	3512
Wkładki do hodowli komórek z membraną Transwell	Kolba do	3460
	Corning	430639 i 430641	T25 i T75
Pożywka RPMI 1640 (z L-glutaminą)	Gibco	11875
Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli/tchawicy	Zastosowania komórkowe	511-500
BEGM Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli	Lonza	CC-3170	Jest to zestaw składający się z jednej butelki pożywki i fiolek z suplementami.
Wodorowęglan sodu 7,5% roztwór	Gibco	25080	Stosować bez zmian.
NuSerum	BD Biosciences	355104	Stosować bez zmian.
BAMBANKER środki zamrażające	BAMBANKER	302-14681	Używaj bez zmian.
CoolCell	Biocision	HTBCS-136	(bezalkoholowy pojemnik do zamrażania komórek CryoPrep)
PureCol	AdvancedBioMatrix	5005-B	rozcieńczyć w stosunku 1:100 sterylną wodą (powinno to być około 0,03 mg / ml) użyj 500 μ l/basenik 12-dołkowej
płytki HBSS z Ca2 i Mg2+	Gibco	14025
DNAse 1	Sigma	DN25	Rozpuścić w 1,5 mg/ml, który jest 100x roztworem, dodać 10 μ l na każdy ml pożywki
Trypsyna, 0,25%, 1x, z czerwienią fenolową	Gibco	25200-056	Stosowanie w to
jest Inhibitor trypsyny sojowej (SBTI)	Sigma	T6522	Stosować rozpuszczony w HBSS w stężeniu 1 mg/ml
Kwas retinowy	Sigma	R7632	Uzupełnić 100 μ M roztwór podstawowy (patrz poniżej), rozcieńczyć do 10 & mu; M z alkoholem bezwodnym, weź 5 μ l tego i dodaj go do 1 ml pożywki BEGM (nasze rozwiązanie robocze). All-trans Retinol ma współczynnik ekstynkcji 52 480 w etanolu przy 325 nm. Rozpuścić 25 mg w 50 ml absolutnego alkoholu etylowego. Należy wykonać seryjne rozcieńczenia, rozcieńczyć 50 ml bulionu w 450 ml absolutnego alkoholu etylowego, pobrać 50 ml tego, rozcieńczyć w 450 ml absolutnego alkoholu etylowego, wziąć 50 ml tego, rozcieńczyć w 450 ml absolutnego alkoholu etylowego i ponownie wziąć 50 ml tego, rozcieńczyć w 450 ml absolutnego alkoholu etylowego, wziąć 100 ml tego i rozcieńczyć w 900 ml absolutnego alkoholu etylowego i odczytać w spektrofotometrze przy 325 nm, Liczba ta jest następnie mnożona przez jego" współczynnik rozcieńczenia, a następnie podzielony przez współczynnik ekstynkcji 52 480, da to liczbę w mM. Zrób zapas 100 mM (przechowuj w temperaturze -20 & deg; C) i z tego wywaru wytwarza się 10 mM podwielokrotności, dzienna potrzeba kwasu retinowego wynosiłaby 5 ml tej 10 mM podwielokrotności w 995 ml pożywki ALI. Przykład: Odczyt 325 nm to 1,15. 1,15 x 10 000 (współczynnik rozcieńczenia) / 52 480 = 0,219 = 219 mM, z tego zrobić 100 mM zapasu w absolutnym etanolu.
DMEM o wysokiej glikemii (1x), płynny, z L-glutaminą i pirogronianem sodu	Gibco	11995
Ekstrakt z przysadki bydlęcej	Gibco	13028-014	Używany do pożywek BEGM ALI.
Nystatyna	Sigma	N4014-50 mg	Uzupełnić roztwór o stężeniu 3,3 mg/ml.
Surowica bydlęca Albumina	Fisher Scientific	BP1600-100	Uzupełnić roztwór 10 mg/ml roztworu w miliQ wody.
PneumaCult-ALI media	StemCell	5001	Jest dostarczany w zestawie składającym się z jednej butelki pożywki i fiolek z suplementami. Szczegółowe informacje znajdują się poniżej.
Hydrokortyzon	StemCell	7904	Rozpuść 2,4 mg hydrokortyzonu w 1 ml ddH2O (używany do produkcji 200x roztworu podstawowego hydrokortyzonu)
Heparyna Sól sodowa w PBS (2 mg / ml)	StemCell	7980	Użyj w tym.
Kolby filtracyjne (500 ml)	Corning	431097	0,22 μ m wielkość
porów Probówki filtracyjne (50 ml)	Milipory	SCGP00525	Steriflip, 0,22 μ m wielkość porów
Końcówki do pipet - ART Końcówki barierowe	Bioprodukty molekularne	2139RI, 2069RI, 2179RI
Probówki stożkowe, sterylne, 15 ml i 50 ml
ddH2O, etanol absolutny, lód
Inkubator
wirówka
Pipety do szafy
(P2, P200, P1000), 9 cali szklane pipety rękawice
fartuch
laboratoryjny z ciasnymi mankietami
< TD> (jest stabilny przez 2 tygodnie w temperaturze 2-8 & stopni; C lub do 6 miesięcy w temperaturze -20 stopni; C) Stosowane media i roztwory: Przepis Używany do Uwaga ogólna: zawsze podgrzewaj nośnik do temperatury pokojowej BEGM media 500 ml pożywki do aplikacji komórek BEGM z jedną podwielokrotnością kwasu retinowego (wymieszaj je do połowy i przefiltruj 500 ml pożywki BEGM Lonza z jedną porcją pojedynczych suplementów quot < ul> trawienie biopsji BEGM+ media 50 ml pożywka BEGM utrzymanie komórek na plastiku w tabliczkach (przejście0) 10 μ l Kwas retinowy (roztwór roboczy) komórki wysiewu w kolbie (przejście1; częściowo) utrzymać komórki w kolbie BEGM++ media 50 ml Lonza' s Pożywka BEGM z dodatkami wysiew świeżych komórek na 12-dołkowej płytce na plastiku 1 ml Sodium BiCarb utrzymywanie komórek w płytkach na tworzywie sztucznym (przejście0; tylko częściowo) 2,5 ml NuSerum komórki wysiewające w kolbie (przejście1; częściowo) BEGM ALI media 250 ml DMEM-H Utrzymanie komórek na transwell przed ich odejściem ALI 250 ml BEGM wraz z suplementami 2 ml ekstraktu z przysadki bydlęcej (12,5 mg/ml roztworu) 1 ml nystatyny (3,3 mg/ml roztworu) 75 μ l BSA (10 mg / ml roztwór) < / li>< / ul> < / td> < / tr> 200X Roztwór podstawowy hydrokortyzonu (96 μ l/ml roztwór) 200 μ l rozpuszczony hydrokortyzon Jako uzupełnienie PneumaCult-ALI Complete Base Medium na ostatni dzień w kolbie i gdy komórki są na wkładkach 4250 μ l rozpuszczony chlorek sodu 540 μ l ddH2O 10 μ l etanol absolutny Roztwór filtrujący przez 0,22 μ m przefiltrować, podwielokrotny roztwór i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, unikaj dodatkowych cykli zamrażania/rozmrażania PneumaCult-ALI Complete Base Media 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium Podłoże bazowe dla wszystkich trzech pożywek PneumaCult-ALI 50 ml PneumaCult 10x Suplement Media PneumaCult są wrażliwe na światło, dlatego zawsze przechowuj je w ciemności PneumaCult-ALI Maintenance Medium Na 1 ml PneumaCult-ALI Complete Base Medium dodaj: Kultura ALI na wkładkach 10 μ l PneumaCult 100x Maintenance Suplement 2 μ l Heparyna (o stężeniu 2 mg/ml roztworu podstawowego) 5 μ l Hydrokortyzon (o wartości 96 μ l/ml roztwór podstawowy)

hodowli tkankowych Corning Kolba wentylowana CO z chłodzeniembezpieczeństwa biologicznego