Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

37.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50646

⸱

8 października 2013

 ,  ,  ,  , 
1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Streszczenie

Modele in vitro wykorzystujące ludzkie pierwotne komórki nabłonkowe są niezbędne do zrozumienia kluczowych funkcji nabłonka oddechowego w kontekście infekcji mikrobiologicznych lub czynników wziewnych. Bezpośrednie porównania komórek uzyskanych z chorych populacji pozwalają scharakteryzować różne fenotypy i przeanalizować mechanizmy pośredniczące w zmianach funkcji komórek nabłonkowych. Hodowla komórek nabłonkowych z ludzkiego obszaru tchawicy i oskrzeli została dobrze udokumentowana, ale jest ograniczona dostępnością ludzkiej tkanki płucnej lub inwazyjnością związaną z uzyskaniem biopsji szczoteczek oskrzelowych. Komórki nabłonka nosa uzyskuje się poprzez znacznie mniej inwazyjne powierzchowne biopsje skrobania nosa, a badani mogą być poddawani wielokrotnej biopsji bez znaczących skutków ubocznych. Ponadto nos jest punktem wejścia do układu oddechowego, a zatem jednym z pierwszych miejsc, które są narażone na wszelkiego rodzaju stresory przenoszone drogą powietrzną, takie jak czynniki mikrobiologiczne, zanieczyszczenia lub alergeny.

Krótko mówiąc, komórki nabłonka nosa uzyskane od ludzkich ochotników są rozwijane na powlekanych płytkach do hodowli tkankowych, a następnie przenoszone na wkładki do hodowli komórkowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są nadal hodowane na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) przez kilka tygodni, co stwarza bardziej fizjologicznie istotne warunki. W warunkach hodowli ALI wykorzystuje się zdefiniowane pożywki prowadzące do zróżnicowanego nabłonka, który wykazuje cechy morfologiczne i funkcjonalne podobne do ludzkiego nabłonka nosa, z komórkami orzęsionymi i wytwarzającymi śluz. Wstawki do hodowli tkankowych ze zróżnicowanymi komórkami nabłonka nosa mogą być manipulowane na różne sposoby w zależności od pytań badawczych (leczenie środkami farmakologicznymi, transdukcja wektorami lentiwirusowymi, narażenie na gazy lub zakażenie czynnikami mikrobiologicznymi) i analizowane pod kątem wielu różnych punktów końcowych, począwszy od szlaków komórkowych i molekularnych, zmian funkcjonalnych, morfologii itp.

Modele in vitro zróżnicowanych ludzkich komórek nabłonka nosa umożliwią badaczom rozwiązywanie nowych i ważnych pytań badawczych za pomocą organotypowych modeli eksperymentalnych, które w dużej mierze naśladują nabłonek nosa in vivo.

Wprowadzenie

Cel techniki

Komórki nabłonkowe (EC) w drogach oddechowych są jednymi z pierwszych miejsc, które są bezpośrednio narażone na wdychane stresory środowiskowe, takie jak patogeny, alergeny czy zanieczyszczenia powietrza. EC są czymś więcej niż barierą strukturalną: działają jak centrala do inicjowania i regulowania odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego1-3 poprzez uwalnianie rozpuszczalnych mediatorów4-6 i ekspresję ligandów/receptorów na ich powierzchni 7-9. Podczas gdy unieśmiertelnione linie komórkowe mogą być używane jako modele do badania EC układu oddechowego in vitro, nie różnicują się one w heterogeniczne populacje komórek złożone ze spolaryzowanych komórek rzęskowych i wytwarzających śluz, podobnie jak to obserwuje się in vivo. Aby podsumować ważne cechy nabłonka oddechowego obserwowane in vivo, można zastosować pierwotne EC dróg oddechowych. Dlatego naszym celem była optymalizacja naszej metody z wykorzystaniem nosonowych EC (NEC) uzyskanych od ochotników. NEC są namnażane i hodowane in vitro, w wyniku czego uzyskuje się model hodowli komórkowej zróżnicowanych NEC, który naśladuje wiele cech nabłonka nosa obserwowanych in vivo.

Uzasadnienie

Użycie modeli in vitro z ludzkimi pierwotnymi EC naśladującymi sytuację in vivo - jak opisano w tym badaniu - daje unikalne możliwości badania specyficznych dla choroby różnic EC, parametrów fizjologicznych związanych z nabłonkiem dróg oddechowych, lub interakcji między EC a innymi typami komórek, takimi jak komórki dendrytyczne 10, komórki NK11 lub makrofagi. Kilka istniejących metod wykorzystuje EC oskrzeli, które można uzyskać inwazyjnie za pomocą biopsji szczoteczki podczas bronchoskopii lub z inaczej wyrzuconej tkanki płucnej12-17. Ponadto istnieją komercyjne źródła pozwalające uzyskać w pełni zróżnicowane hodowle komórek nabłonka ludzkich dróg oddechowych (model EpiAirway firmy MatTek, Ashland, MA, Clonetics z Lonza, Bazylea, Szwajcaria, MucilAir z Epithelix Sars, Genewa Szwajcaria), w których badacze mogą wybierać spośród różnych dawców. Jednak ze względu na ograniczoną pulę dostępnych na rynku komórek nabłonkowych, ograniczony lub przepisany zestaw parametrów, koszt związany z komercyjnym uzyskaniem pierwotnych EC ludzkich dróg oddechowych oraz ograniczony dostęp do odrzuconej tkanki płucnej lub świeżo uzyskanej ludzkiej biopsji oskrzeli uniemożliwiają wielu badaczom prowadzenie badań na w pełni zróżnicowanych EC ludzkich dróg oddechowych. Dlatego postanowiliśmy opracować technikę, która 1) wykorzysta nieinwazyjnie uzyskane ludzkie NEC, 2) zapewni protokół dający hodowle zróżnicowanego ludzkiego nabłonka dróg oddechowych oraz 3) będzie odtwarzalna w większości warunków laboratoryjnych z istniejącą infrastrukturą kultur tkankowych.

Zalety w stosunku do istniejących technik/modeli

Uzyskanie świeżych NEC, w porównaniu do EC oskrzelowych lub małych dróg oddechowych, jest znacznie mniej inwazyjne, osoby mogą być poddawane wielokrotnej biopsji bez znaczących skutków ubocznych, a powierzchowne biopsje z nosa mogą być przeprowadzane w chorych populacjach, które inaczej nie kwalifikowałyby się do bronchoskopii związanych z badaniami. Nieinwazyjne powierzchowne biopsje zeskrobane w celu uzyskania NEC pozwalają badaczowi ustalić a priori specyfikację dawcy, w tym wiek, płeć, stan choroby itp., zgodnie z celem badawczym, który ma zostać osiągnięty. W związku z tym, projektując badania naukowe, badacze nie są ograniczeni klinicznie dostępnymi próbkami tkanek/nabłonka, kupują drogie zróżnicowane modele kultur komórkowych od dostawców komercyjnych lub projektują inwazyjne badania bronchoskopowe. Ponadto łatwość uzyskania NEC zwiększa możliwość przeprowadzania eksperymentów na komórkach pochodzących od różnych dawców, co zwiększa walidację statystyczną zaobserwowanych wyników. Wreszcie, nos jest jednym z pierwszych miejsc, które są narażone na wszelkiego rodzaju stresory przenoszone drogą powietrzną. W związku z tym generowanie organotypowych systemów hodowli in vitro naśladujących nabłonek nosa jest przydatny do badania wdychania cząstek wirusa, zanieczyszczeń, alergenów lub gazów, co można łatwo osiągnąć przy użyciu tego systemu hodowli komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj plastikowe wyroby: Talerz

  1. Dodaj 500 μl PureCol (1:100 rozcieńczony sterylną wodą) do każdego dołka na 12-dołkowej płytce.
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 30 minut, wyjąć PureCol i przepłukać HBSS tuż przed dodaniem komórek do płytki (patrz krok 3.1 poniżej).

2. Uzyskiwanie i wstępne leczenie biopsji ludzkich NEC

  1. Biopsja skrobania z nosa
    1. Uzyskać powierzchowne EC wyściełające małżowiny nosowe w bezpośrednim widzeniu za pomocą 9-milimetrowego wziernika nosowego wielokrotnego użytku z polipropylenu (model 22009) na otoskopie operacyjnym ze wziernikiem (model 21700). Urządzenie to zapewnia optymalną wizualizację małżowin nosowych i elastyczność ruchu.
    2. Wykonaj biopsje, gdy pacjent siedzi prosto na krześle z prostym oparciem z głową lekko odchyloną do tyłu lub leży w pozycji leżącej na stole do badań.
    3. Włóż wziernik otoskopu do nozdrza i dolną małżowinę usztywnioną za pomocą oświetlenia.
    4. Wprowadzić sterylną kiretę termoplastyczną przez wziernik z końcówką wysuniętą dystalnie do tylnej części małżowiny.
    5. Używając delikatnego nacisku na dolną powierzchnię małżowiny, łyżeczka jest przeciągana po powierzchni błony śluzowej 5x i cofana. Udane odzyskanie komórek błony śluzowej utrzymywanych przez działanie kapilarne będzie widoczne w filiżance kireta.
  2. Umieścić próbkę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml RPMI 1640, transportować na lodzie.
  3. Użyj kleszczy, aby wyjąć sondę, usuń tkankę z sondy nosorożca za pomocą pipety P-1000, odrzuć sondę
  4. Odwirować do osadu (4 °C, 400 x g, 5 min), zassać supernatant (uwaga: uważać, aby nie zassać osadu).
  5. Zawiesić osad w 1 ml BEGM z 10 μl 100x DNazy 1.
  6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  7. Wirówka (4 °C, 400 x g, 5 min), NIE zasysać supernatantu!

3. Zasiewanie komórek na plastiku (Dzień 0)

  1. Wyjmij PureCol z płytki i spłucz HBSS (patrz również krok 1.2).
  2. Dodać minimalną objętość pożywki BEGM++ (80-100 μl, aż menisk pożywki pojawi się w środku studzienki) do 1-4 dołków (w zależności od wielkości biopsji) powlekanej płytki.
  3. Użyj pipety P-1000, aby ostrożnie usunąć osad tkanki biopsyjnej z probówki, nie zasysając zbyt dużej ilości pożywki.
  4. Przenieś osad do środka studzienek, utrzymuj biopsję razem jako skupisko komórek i nie rozbijaj się, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Dobra biopsja daje do 4 dołków, które można wysiać. Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2, >90% wilgotności względnej).
  5. Sprawdź po dwóch godzinach, czy jest wystarczająca ilość pożywki (bez naruszania łąkotki).
  6. Dzień 1, 24 godziny po wysiewie: zebrać wszystkie nieprzylegające komórki ze wszystkich studzienek (przechylić płytkę i zebrać pożywkę z komórkami w P-1000, zebrać wszystkie dołki w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml).
  7. Wirówka (4 °C, 400 x g, 5 min).
  8. Podczas wirowania zawiesiny komórek: dodać około 250 μl mieszaniny BEGM++ i 250 μl mieszaniny pożywek BEGM+ do komórek wysianych w dniu 0.
  9. Powtórz kroki 3.1-3.5 dla komórek nieprzylegających.
  10. Dzień 2-5: codziennie zmieniaj pożywki w komórkach; dodaj 500 μl pożywki do każdej studzienki, stopniowo zmniejszaj ilość pożywki BEGM++ (dzień 2 po wysiewie: 125 μl BEGM++ plus 375 μl BEGM+, dzień 3 po wysiewie i kolejne dni: 73 μl BEGM++ plus 427 μl BEGM+).

4. Rozszerzanie komórek w kolbach

  1. Monitoruj komórki codziennie; gdy osiągną 80-90% zbieżności (zwykle 5-7 dni po biopsji, jeśli potrwają dłużej, nie będą pomyślnie rosły) podnieś komórki w następujący sposób: ostrożnie odessać pożywkę; dodać 500 μl 0,25% trypsyny na studzienkę, utrzymywać je w temperaturze 37 °C, aż komórki zostaną odłączone (zwykle trwa to 2-3 minuty).
  2. Przygotuj potrzebną objętość inhibitora trypsyny sojowej (SBTI) (750 μl na 1 ml trypsyny) w probówce o pojemności 15 ml.
  3. Usunąć komórki poprzez wielokrotne pipetowanie roztworu trypsyny w górę i w dół; przenieść oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą SBTI.
  4. Przepłukać wszystkie studzienki łącznie 1 ml HBSS, dodać HBSS do probówki z komórkami.
  5. Odwirować do osadu (4 °C, 400 x g, 5 min), odessać pożywkę, ponownie zamieszać w 1 ml pożywki BEGM+ i przemieszać probówkę.
  6. Rozpręż komórki w kolbie T25 lub T75 w zależności od wielkości osadu (jest to p1; około dwóch zlewających się studzienek trafia do jednej kolby T75, jedna zlewająca się studzienka wystarcza na jeden T25, zwykle 2 zlewające się studzienki dają jeden T75).
    1. Dodać BEGM+ do kolb (po 5 ml dla T75, po 3 ml dla T25).
    2. Dodać zawiesinę komórek do kolb. Przenieść kolby do inkubatora do hodowli tkankowych.
  7. 24-godzinny wysiew po wysiewie kolby: dodać dodatkowe podłoże BEGM+ do kolby (3 ml do T25, 10 ml do T75).
  8. Utrzymać komórki w kolbach: Usunąć pożywkę (odessać z rogu) i dodać pożywkę BEGM+ (5 ml/T25, 20 ml/T75). Nośnik należy wymieniać co 2-3 dni. Utrzymuj komórki w kolbie, aż osiągną około 80% zlewania się (konfluencja może nie być równomierna w całej kolbie; zwykle trwa to od 7 do 10 dni; jeśli nie zlewają się po 10 dniach, nie będą pomyślnie rosły).

5. Zasiewanie komórek na wkładkach do hodowli tkankowych

  1. Wyjąć pożywkę z kolby i dodać trypsynę (3 ml dla T25, 4 ml dla kolby T75).
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do oderwania komórek (około 2-3 minut).
  3. Przygotuj SBTI (750 μl na 1 ml trypsyny > 2,25 ml dla T25, 3 ml dla T75) w probówce o pojemności 15 ml.
  4. Usunąć komórki, zaklejając kolbę taśmą i pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść do stożkowej rurki za pomocą SBTI.
  5. Przepłukać kolbę HBSS (1 ml dla T25, 2 ml dla T75), dodać HBSS do probówki o pojemności 15 ml.
  6. Odwirować do osadu (4 °C, 400 x g, 5 min), ostrożnie usunąć supernatant.
  7. Przygotuj talerze: zdecyduj, ile talerzy zostanie zasianych, oznacz płytki kodem i numerem próbki, numerem przejścia (np. p2) i datą. Dodać 700 μl pożywki BEGM+ do komory podstawowej.
  8. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki BEGM ALI, wirując probówkę.
  9. Policz komórki za pomocą hemocytometru (T25 zwykle wytwarza około 4 milionów komórek; T75 może mieć do 20 milionów komórek w zależności od wysepki; użyj 1-2 milionów komórek na jedną 12-dołkową płytkę) i rozcieńczyć zawiesinę komórek za pomocą pożywki BEGM ALI do całkowitej objętości potrzebnej do ilości płytek, które powinny zostać wysiane (1,2 x 10,6 komórek w pożywce 2,5 ml na płytkę). (Uwaga: Jeśli część komórek chce zostać zamrożona, oznacz probówkę i usuń komórki tutaj: zwykle zamrażamy 2 x 106 komórek w 2 ml pożywki do zamrażania)
  10. Dodać 200 μl zawiesiny komórek do wierzchołkowej strony każdej niepowlekanej wkładki do komórek Corning 12well (>będzie to około 80 000-150 000 komórek/wkładkę; transwelle 12 mm z wkładką membranową poliestrową (politereftalan etylenu (PET)) o porach 0,4 μm); przenieść do inkubatora do hodowli tkankowych.
  11. Po 24 godzinach wymienić podłoże wierzchołkowe (200 μl podłoża ekspandacyjnego).
  12. Utrzymanie hodowli komórkowych: Zmieniaj pożywkę (pożywka BEGM ALI; 700 μl podstawno-boczna i 200 μl wierzchołkowa) co drugi dzień. Wkładki muszą być utrzymywane w zanurzeniu, aż komórki całkowicie się zlewają (nie są widoczne żadne w monowarstwie). W zależności od liczby komórek trwa to zwykle od 2 do 6 dni, jeśli trwa dłużej, komórki najprawdopodobniej nie będą zdolne do życia.

6. Ustal interfejs cieczy, gdy komórki są całkowicie zlewające się (gdy komórki na transwellach są całkowicie zlewne)

  1. Gdy komórki są całkowicie zlewne, zastąp zarówno wierzchołek, jak i podłoże podstawno-boczne pożywką BEGM ALI uzupełnioną kwasem retinowym 500 nM przez 48 godzin.
  2. 48 godzin po dodaniu pożywki BEGM ALI uzupełnionej kwasem retinowym: Przygotuj pożywkę konserwacyjną PneumaCult-ALI (zgodnie z instrukcjami producenta): Oblicz potrzebną objętość podłoża (na jedną płytkę zwykle 8,5 ml dla przegródek podstawowych); dodać na 1 ml PneumaCult Complete Base Media:
    • 10 μl PneumaCult 100x Suplement pielęgnacyjny
    • 2 μl heparyny (z roztworu podstawowego o stężeniu 2 mg/ml)
    • 5 μl hydrokortyzonu (z roztworu podstawowego o stężeniu 96 μl/ml).
  3. Usuń wszystkie podłoża i dodaj 700 μl pożywki konserwacyjnej PneumaCult-ALI tylko po stronie podstawno-bocznej (bez pożywki po stronie wierzchołkowej).
  4. Utrzymuj kultury komórkowe przez 4 tygodnie w ALI:
    1. Zmieniaj media co drugi dzień (harmonogram poniedziałków, środ i piątek dobrze nam odpowiada).
    2. Po tygodniu w ALI, raz w tygodniu (środy) powierzchnia wierzchołkowa jest płukana: dodać 200 μl HBSS na stronę wierzchołkową, przechowywać je przez 10 minut w inkubatorze, ostrożnie zassać HBSS (użyć szklanej pipety o średnicy 9 cali dołączonej do pułapki próżniowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego, użyć końcówek 200 μl na końcówce pipety, aby odessać HBSS).

Uwaga: Zmieniaj końcówki między płytami, jak również zmieniaj końcówki podczas przechodzenia z powierzchni wierzchołkowej na bazolateralną. Po około 2 tygodniach w ALI komórki zaczynają się różnicować i pojawiają się rzęski. Hodowle komórkowe osiągają pełne różnicowanie po około 4 tygodniach w ALI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

NECs hodowane zgodnie z opisanym tutaj protokołem redyferencjują się w heterogenną warstwę ECs składającą się z komórek rzęskowych i nierzęskowych, co odzwierciedla sytuację in vivo (Rysunek 1). Niektóre z zróżnicowanych NECs produkują śluz (komórki barwiące się na niebiesko przy użyciu AB/PAS, Rysunek 1B). Mimo że przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany, stopień różnicowania może być zmienny pod względem rozkładu ogólnych populacji komórek (t.j. różne stosunk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oddechowe EC zapewniają nie tylko fizyczną barierę chroniącą organizm ludzki przed bodźcami egzogennymi20, ale także działają jako centrala do inicjowania i regulowania odpowiedzi immunologicznych układu oddechowego1-3 poprzez wydzielanie rozpuszczalnych mediatorów lub bezpośrednie interakcje receptor-ligand komórka-komórka. W celu dalszego badania roli EC w odpowiedzi immunologicznej, zbadania potencjalnych różnic między EC a populacjami chorymi lub zbadania wpływu egzogennych czynników stresogenny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Lisie Dailey za pomocne uwagi.

Ta praca została wsparta grantami z National Institutes of Health (ES013611 i HL095163), Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) oraz Agencji Ochrony Środowiska (CR83346301) i deklaruje brak konfliktu interesów. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Chociaż badania opisane w tym artykule zostały częściowo sfinansowane przez Amerykańską Agencję Ochrony Środowiska na mocy umowy o współpracy CR83346301 z Centrum Medycyny Środowiskowej, Astmy i Biologii Płuc na Uniwersytecie Karoliny Północnej-Chapel Hill, nie zostały one poddane wymaganej przez agencję ocenie wzajemnej i politycznej, a zatem niekoniecznie odzwierciedlają poglądy agencji. i nie należy wnioskować o żadne oficjalne poparcie. Wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia ani rekomendacji do użycia. Loretta Müller jest wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki w ramach osobistego grantu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

2
Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wziernik do nosaWelch AllynModel 220099 mm, polipropylen wielokrotnego użytku
Otoskop operacyjnyWelch AllynModel 21700
Kuweta na komórki z sondą RhinoArlington ScientificSY-96-092zegnij trochę bardziej główkę kuwety
12-dołkowe płytki hodowlaneCorning3512
Wkładki do hodowli komórek z membraną TranswellKolba do3460
Corning430639 i 430641T25 i T75
Pożywka RPMI 1640 (z L-glutaminą)Gibco11875
Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeli/tchawicyZastosowania komórkowe511-500
BEGM Pożywka do wzrostu komórek nabłonka oskrzeliLonzaCC-3170Jest to zestaw składający się z jednej butelki pożywki i fiolek z suplementami.
Wodorowęglan sodu 7,5% roztwórGibco25080Stosować bez zmian.
NuSerumBD Biosciences355104Stosować bez zmian.
BAMBANKER środki zamrażająceBAMBANKER302-14681Używaj bez zmian.
CoolCell BiocisionHTBCS-136(bezalkoholowy pojemnik do zamrażania komórek CryoPrep)
PureColAdvancedBioMatrix5005-Brozcieńczyć w stosunku 1:100 sterylną wodą (powinno to być około 0,03 mg / ml) użyj 500 μ l/basenik 12-dołkowej
płytki HBSS z Ca2 i Mg2+Gibco14025
DNAse 1SigmaDN25Rozpuścić w 1,5 mg/ml, który jest 100x roztworem, dodać 10 μ l na każdy ml pożywki
Trypsyna, 0,25%, 1x, z czerwienią fenolowąGibco25200-056Stosowanie w to
jest Inhibitor trypsyny sojowej (SBTI)SigmaT6522Stosować rozpuszczony w HBSS w stężeniu 1 mg/ml
Kwas retinowySigmaR7632Uzupełnić 100 μ M roztwór podstawowy (patrz poniżej), rozcieńczyć do 10 & mu; M z alkoholem bezwodnym, weź 5 μ l tego i dodaj go do 1 ml pożywki BEGM (nasze rozwiązanie robocze).

All-trans Retinol ma współczynnik ekstynkcji 52 480 w etanolu przy 325 nm. Rozpuścić 25 mg w 50 ml absolutnego alkoholu etylowego. Należy wykonać seryjne rozcieńczenia, rozcieńczyć 50 ml bulionu w 450 ml absolutnego alkoholu etylowego, pobrać 50 ml tego, rozcieńczyć w 450 ml absolutnego alkoholu etylowego, wziąć 50 ml tego, rozcieńczyć w 450 ml absolutnego alkoholu etylowego i ponownie wziąć 50 ml tego, rozcieńczyć w 450 ml absolutnego alkoholu etylowego, wziąć 100 ml tego i rozcieńczyć w 900 ml absolutnego alkoholu etylowego i odczytać w spektrofotometrze przy 325 nm, Liczba ta jest następnie mnożona przez jego" współczynnik rozcieńczenia, a następnie podzielony przez współczynnik ekstynkcji 52 480, da to liczbę w mM. Zrób zapas 100 mM (przechowuj w temperaturze -20 & deg; C) i z tego wywaru wytwarza się 10 mM podwielokrotności, dzienna potrzeba kwasu retinowego wynosiłaby 5 ml tej 10 mM podwielokrotności w 995 ml pożywki ALI. Przykład: Odczyt 325 nm to 1,15. 1,15 x 10 000 (współczynnik rozcieńczenia) / 52 480 = 0,219 = 219 mM, z tego zrobić 100 mM zapasu w absolutnym etanolu.
DMEM o wysokiej glikemii (1x), płynny, z L-glutaminą i pirogronianem soduGibco11995
Ekstrakt z przysadki bydlęcejGibco13028-014Używany do pożywek BEGM ALI.
NystatynaSigmaN4014-50 mgUzupełnić roztwór o stężeniu 3,3 mg/ml.
Surowica bydlęca AlbuminaFisher ScientificBP1600-100Uzupełnić roztwór 10 mg/ml roztworu w miliQ wody.
PneumaCult-ALI mediaStemCell5001Jest dostarczany w zestawie składającym się z jednej butelki pożywki i fiolek z suplementami. Szczegółowe informacje znajdują się poniżej.
Hydrokortyzon StemCell7904Rozpuść 2,4 mg hydrokortyzonu w 1 ml ddH2O (używany do produkcji 200x roztworu podstawowego hydrokortyzonu)
Heparyna Sól sodowa w PBS (2 mg / ml)StemCell7980Użyj w tym.
Kolby filtracyjne (500 ml)Corning4310970,22 μ m wielkość
porów Probówki filtracyjne (50 ml)MiliporySCGP00525Steriflip, 0,22 μ m wielkość porów
Końcówki do pipet - ART Końcówki barieroweBioprodukty molekularne2139RI, 2069RI, 2179RI
Probówki stożkowe, sterylne, 15 ml i 50 ml
ddH2O, etanol absolutny, lód
Inkubator
wirówka
Pipety do szafy
(P2, P200, P1000), 9 cali szklane pipety rękawice
fartuch
laboratoryjny z ciasnymi mankietami
< TD> (jest stabilny przez 2 tygodnie w temperaturze 2-8 & stopni; C lub do 6 miesięcy w temperaturze -20 stopni; C)
Stosowane media i roztwory: PrzepisUżywany do
Uwaga ogólna: zawsze podgrzewaj nośnik do temperatury pokojowej
BEGM media
  • 500 ml pożywki do aplikacji komórek BEGM z jedną podwielokrotnością kwasu retinowego
(wymieszaj je do połowy i przefiltruj
  • 500 ml pożywki BEGM Lonza z jedną porcją pojedynczych suplementów quot
< ul>
  • trawienie biopsji
    • BEGM+ media
    • 50 ml pożywka BEGM
    • utrzymanie komórek na plastiku w tabliczkach (przejście0)
    • 10 μ l Kwas retinowy (roztwór roboczy)
    • komórki wysiewu w kolbie (przejście1; częściowo)
    • utrzymać komórki w kolbie
    BEGM++ media
    • 50 ml Lonza' s Pożywka BEGM z dodatkami
    • wysiew świeżych komórek na 12-dołkowej płytce na plastiku
    • 1 ml Sodium BiCarb
    • utrzymywanie komórek w płytkach na tworzywie sztucznym (przejście0; tylko częściowo)
    • 2,5 ml NuSerum
    • komórki wysiewające w kolbie (przejście1; częściowo)
    BEGM ALI media
    • 250 ml DMEM-H
    • Utrzymanie komórek na transwell przed ich odejściem ALI
    • 250 ml BEGM wraz z suplementami
    • 2 ml ekstraktu z przysadki bydlęcej (12,5 mg/ml roztworu)
    • 1 ml nystatyny (3,3 mg/ml roztworu)
    • 75 μ l BSA (10 mg / ml roztwór) < / li>< / ul> < / td> < / tr>
    200X Roztwór podstawowy hydrokortyzonu (96 μ l/ml roztwór)
    • 200 μ l rozpuszczony hydrokortyzon
    • Jako uzupełnienie PneumaCult-ALI Complete Base Medium na ostatni dzień w kolbie i gdy komórki są na wkładkach
    • 4250 μ l rozpuszczony chlorek sodu
    • 540 μ l ddH2O
    • 10 μ l etanol absolutny
    Roztwór filtrujący przez 0,22 μ m przefiltrować, podwielokrotny roztwór i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C, unikaj dodatkowych cykli zamrażania/rozmrażania
    PneumaCult-ALI Complete Base Media
    • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
    • Podłoże bazowe dla wszystkich trzech pożywek PneumaCult-ALI
    • 50 ml PneumaCult 10x Suplement
    • Media PneumaCult są wrażliwe na światło, dlatego zawsze przechowuj je w ciemności
    PneumaCult-ALI Maintenance MediumNa 1 ml PneumaCult-ALI Complete Base Medium dodaj:Kultura ALI na wkładkach
    • 10 μ l PneumaCult 100x Maintenance Suplement
    • 2 μ l Heparyna (o stężeniu 2 mg/ml roztworu podstawowego)
    • 5 μ l Hydrokortyzon (o wartości 96 μ l/ml roztwór podstawowy)
    hodowli tkankowych Corning Kolba wentylowana CO z chłodzeniembezpieczeństwa biologicznego

    Bibliografia

    1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
    2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
    3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. , (2012).
    4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
    5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
    6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
    7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
    8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
    9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
    10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. , (2010).
    11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. , (2013).
    12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
    13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89(2009).
    14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).
    15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
    16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462(1987).
    17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
    18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
    19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
    20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
    21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108(2012).
    22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
    23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
    24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. , (2012).
    25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
    26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
    27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
    28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
    29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102(2011).
    30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

    Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

    Przedruki i uprawnienia

    Przeglądaj więcej artykułów

    hodowla ALIinserty do hodowli komórkowychpłytki do hodowli tkankowejbiopsja z opracowania błony śluzowej nosapożywka BEGM Pluswysiew na system Transwellróżnicowanie mukocyliarneWestern blotting
    Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy
    Skontaktuj się z nami
    Poleć bibliotece

    Prywatność

    Warunki korzystania z usługi

    Zasady

    Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.