Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Podsumowanie

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego. Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Streszczenie

Mikroglej są komórkami rezydującymi w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i jako takie odgrywają niezwykle ważną rolę w procesach fizjologicznych i patologicznych, takich jak dojrzewanie OUN w rozwoju, stwardnienie rozsiane i uszkodzenie rdzenia kręgowego. Mikroglej może być aktywowany i rekrutowany do działania przez uszkodzenie neuronów lub stymulację, taką jak uszkodzenie aksonów obserwowane w stwardnieniu rozsianym lub niedokrwienny uraz mózgu wynikający z udaru. Uważa się również, że ci immunokompetentni członkowie OUN odgrywają rolę w plastyczności synaptycznej w warunkach niepatologicznych. Stosujemy protokoły hodowli mikrogleju z tkanek noworodków i dorosłych, które mają na celu maksymalizację liczby żywotnych komórek przy jednoczesnej minimalizacji zmiennych zakłócających, takich jak obecność innych typów komórek OUN i pozostałości po hodowli komórkowej. Wykorzystujemy duże i łatwo rozpoznawalne elementy OUN (np. korę, segmenty rdzenia kręgowego), co sprawia, że cały proces jest wykonalny i powtarzalny. Wykorzystanie dorosłych komórek jest odpowiednią alternatywą dla stosowania mikrogleju mózgu u noworodków, ponieważ wiele badanych patologii dotyczy głównie pourodzeniowego rdzenia kręgowego. Te systemy hodowli są również przydatne do bezpośredniego testowania wpływu związków, które mogą hamować lub promować aktywację mikrogleju. Ponieważ aktywacja mikrogleju może wpływać na wyniki choroby w ośrodkowym układzie nerwowym u dorosłych, istnieje zapotrzebowanie na systemy in vitro, w których można hodować i badać mikroglej noworodków i dorosłych.

Wprowadzenie

Mikroglej to rezydujące komórki odpornościowe OUN, najbardziej przypominające obwodowe makrofagi pod względem budowy i funkcji ¹. Niedawno wykazano, że postnatalne komórki mikrogleju pochodzą od prymitywnych przodków szpiku i są generowane przed ósmym dniem embriogenezy, co obala wcześniejszy pogląd, że pourodzeniowi przodkowie hematopoezy są źródłem mikrogleju w dorosłym mózgu ². Odgrywają kluczową rolę w wielu chorobach neurologicznych i mogą szybko reagować na infekcję lub uraz, uwalniając cytokiny prozapalne lub przeciwzapalne ³. W związku z tym mikroglej obejmuje samodzielną jednostkę w OUN, którą można manipulować w celu wpływu na postęp choroby. Opracowanie solidnych i powtarzalnych metod izolowania i hodowli komórek mikrogleju noworodków lub dorosłych jest ważne dla przyszłych badań.

Mikroglej jest znany z tego, że odgrywa kluczową rolę w wielu patologiach mózgu. Ostatnio pojawiają się role komórek w prawidłowym rozwoju mózgu i funkcjonują jako nadmiar fagocytozy mikrogleju z nerwowych komórek progenitorowych z zakrętu zębatego hipokampa ^{1, 4}. Mikroglej może również modulować kilka stanów neurologicznych, które wpływają na rdzeń kręgowy, takich jak stwardnienie rozsiane, ból neuropatyczny i uraz rdzenia kręgowego ^5-7. Mikroglej rdzenia kręgowego reaguje inaczej niż mikroglej mózgu w odpowiedzi na sygnały aktywacji ^{8, 9}, prawdopodobnie z powodu różnic w środowisku lokalnym. Dlatego ważne jest, aby stworzyć odpowiedni system in vitro do hodowli i badania mikrogleju rdzenia kręgowego. Mikroglej noworodków wytwarza znacznie więcej prozapalnego tlenku azotu cytokin w porównaniu z dorosłymi komórkami po stymulacji in vitro IFN-γ lub TNF-a^10,11, co dodatkowo podkreśla potrzebę wykorzystania dorosłych komórek do badania mikrogleju w kontekście niektórych chorób.

Protokół, który stosujemy w laboratorium do hodowli mikrogleju noworodków, jest odmianą najnowszych metod, które wykorzystują wstrząsanie mieszanych kultur glejowych w celu usunięcia mikrogleju z powierzchni kolby do hodowli komórkowej ¹². Opisujemy również metodę hodowli mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłej myszy w oparciu o protokół po raz pierwszy opisany przez Yipa i wsp. ¹³. Ta metoda zapewnia szybszy sposób hodowli dorosłych komórek w porównaniu z innymi dostępnymi protokołami ¹⁴. Powstały preparat składa się w 70% z mikrogleju; Pozostały procent składa się z astrocytów. Chociaż czystość naszej kultury jest niższa w porównaniu z innymi opublikowanymi metodami ¹³, ten system hodowli jest przydatny do badania reakcji mikrogleju w kulturze na różne bodźce aktywujące, a także do badania chorób, które wpływają głównie na rdzeń kręgowy i w których główną cechą jest silna reakcja zapalna.

Wszystkie opisane protokoły zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Stony Brook.

Protokół

1. Sekcja (Dzień 0)

1. Wywołaj znieczulenie u p0-2 mysich szczeniąt z hipotermią. Przetrzyj głowy szczeniąt chusteczką nasączoną 70% etanolem, aby zdezynfekować tkankę.
2. Usuń głowy nożyczkami, używając 4 szczeniąt na 10 cm płytki hodowlanej. Umieść głowy na szalce Petriego zawierającej lodowaty bufor Hanka.
3. Zakotwicz głowy za pomocą zakrzywionych kleszczy przez oczodoły i ostrożnie usuń skórę pokrywającą czaszkę prostymi mikrokleszkami.
4. Usuń kości czaszki za pomocą prostych mikrokleszczyków, uważając, aby nie przebić ani nie uszkodzić kory mózgowej. Najskuteczniejszym sposobem jest rozpoczęcie usuwania zaczynając w pobliżu móżdżku, który znajduje się u podstawy głowy, ponieważ ten obszar zostanie odrzucony.
5. Usuń mózg małą szpatułką i umieść (4) mózgi na świeżej szalce Petriego zawierającej lodowaty bufor Hanka.
6. Wszystkie czynności od tego momentu wykorzystują mikrokleszcze i są wykonywane pod mikroskopem preparacyjnym. Zaczynając od brzusznej strony mózgu, zakotwicz tkankę, trzymając móżdżek i wykonaj dwa małe nacięcia po obu stronach śródmózgowia. Uważaj, aby nie przeciąć całej tkanki, ponieważ kora pokrywa śródmózgowie w tym obszarze.
7. Delikatnie drażnij śródmózgowie i móżdżek w jednym kawałku z dwóch kory. Dwie kory powinny tworzyć wklęsły kształt.
8. Oddziel dwie kory i ustaw jedną pojedynczą korę przyśrodkową stroną do góry w celu dalszej sekcji. Hipokamp może być trudny do zaobserwowania, ale znajduje się naprzeciwko opuszki węchowej, która pojawia się jako mały guzek na spiczastym końcu kory.
9. Usuń hipokamp, który ma kształt półksiężyca. Odwróć korę, aby wyświetlić stronę grzbietową.
10. Używając opuszki węchowej jako punktu wyjścia, usuń wszystkie opony mózgowe i samą opuszkę węchową z kory.
11. Wypreparowaną korę należy umieścić w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml z 14 ml zimnego buforu soli fizjologicznej Hanka na lodzie.

2. Hodowla komórkowa (Dzień 0)

1. Wstępnie pokryć 10-centymetrowe szalki do hodowli tkankowych 5 μg/ml poli-D-lizyny (PDL) rozcieńczonej w autoklalawowanej wodzie przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
2. Odessać PDL i raz umyć płytki wodą z autoklawy. Suszyć płytkę w promieniowaniu UV w kapturze do hodowli tkankowych przez 20 minut. Ten krok należy wykonać tuż przed procesem preparacji.
3. Odessać bufor Hanka z probówek zawierających korę mózgową z 4 mózgów każda, nałożyć 4 ml 1x roztworu trypsyny/EDTA, rozcierać tkankę końcówką p1000 i umieszczać probówki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 15 minut.
4. Dodaj 4 ml kompletnej pożywki mikroglejowej na probówkę, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne, wymieszaj i odwiruj zawartość z prędkością 1,5 tys. obr./min przez 5 minut.
5. Odessać supernatant i powtórzyć płukanie 4 ml kompletnego podłoża. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml kompletnych pożywek mikrogleju (DMEM z 10% FBS, 1% pirogronianem sodu, 0,08% gentamycyny) i przefiltrować przez sitko do komórek o siatce 40 mikronów.
6. Płytkę o gęstości 8 korowych na 10 ml umieścić na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej i umieścić w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ (patrz protokół dla dorosłych mikrogleju).

(Dzień 3)

1. Zmień pożywkę we wszystkich szalkach do hodowli komórkowych z kompletnymi pożywkami mikrogleju.

(Dzień 10)

1. Dodaj 400 mikrolitrów 60 mM lidokainy w HBSS (w celu odłączenia mikrogleju) do pożywki z 10-centymetrowych płytek do hodowli tkankowych i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 10-15 minut.
2. Zebrać zawiesinę pożywki/ogniwa z płytki i umyć płytkę raz buforem Hanka. Zebrać bufor do płukania, aby odzyskać pozostały mikroglej.
3. Dodać 5 mM EDTA (pH 8,0) do zawiesiny komórek do końcowego stężenia 50 μM lub w rozcieńczeniu 1:100.
4. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 1,000 x g (1,500 obr./min) przez 5 minut i ponownie zawieś w 1 ml DMEM z 1% FBS.
5. Policz liczbę żywotnych komórek (zgodnie z dorosłym mikroglejem 3.1/3.2) i podziel komórki na płytki do hodowli tkankowych o pożądanej gęstości doświadczalnej. Około 1x10⁶ mikrogleju pobiera się z 10-centymetrowej płytki zawierającej korę z 4 mózgów. Do immunofluorescencji zalecana jest gęstość 2,5x10⁴ komórki na 18 mm szkiełka nakrywkowego.
6. Odczekaj co najmniej 24 godziny, aby komórki mikrogleju w pełni powróciły do rozgałęzionego, spoczynkowego stanu przed użyciem.

Tekst protokołu: (Dorosły mikroglej)

1. Pobieranie tkanek

1. Płytki do hodowli tkankowych należy pokryć poli-D-lizyną (PDL) przez 3 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C. Bezpośrednio przed użyciem umyć płytki wodą z autoklawizu.
2. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO₂ i upewnij się, że eutanazja jest zakończona. Oczyść obszar rdzenia kręgowego 70% etanolem.
3. Za pomocą nożyczek przeciąć skórę na górze rdzenia kręgowego, a następnie przystąp do wycinania rdzenia kręgowego od obszaru T1 do T12. Odetnij pozostały mięsień po bokach rdzenia kręgowego.
4. Powoli przecinaj kręgi za pomocą mikronożyczek, delikatnie trzymając rdzeń kręgowy opuszkami palców. Uważaj, aby nie przebić rdzenia kręgowego, ponieważ tkanka jest bardzo miękka. Powoli wyprowadź rdzeń kręgowy za pomocą mikrokleszczy.
5. Zanurz rdzeń kręgowy na szalce Petriego zawierającej lodowaty HBSS. Za pomocą mikroskopu świetlnego usuń wszystkie widoczne opony mózgowe za pomocą mikrokleszczy
6. Przetnij rdzeń kręgowy na segmenty poprzeczne wystarczająco małe, aby wytworzyć kilka fragmentów. Grubość fragmentów nie powinna być większa niż 2 mm, aby ułatwić sprawne trawienie. Przenieść fragmenty rdzenia kręgowego do stożkowej rurki o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml lodowatego HBSS. Trzymaj probówkę na lodzie aż do etapu trawienia.

2. Trawienie tkanek

1. Odessać HBSS z 15 ml stożkowej rurki zawierającej tkankę rdzenia kręgowego. Uważaj, aby nie zassać żadnego kawałka tkanki.
2. Dodać 1 ml trypsyny (2,5 g/l napromieniowanej trypsyny wieprzowej i 0,2 g/l EDTA w HBSS) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
3. Aby zatrzymać trawienie, usuń trypsynę i dodaj 3 ml pierwotnej pożywki dla mikrogleju, która zawiera surowicę, aby zatrzymać trawienie enzymatyczne.
4. Pipetować w górę i w dół, aby usunąć tkankę. Przefiltrować zawiesinę komórek za pomocą sitka o wielkości 40 μm.

3. Liczenie komórek i powlekanie

1. Wymieszać równą objętość zawiesiny komórkowej i roztworu DAPI.
2. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
3. Płytka o gęstości między 5-7x10⁵ komórek/ml w szalkach 35 x 10 mm pokrytych PDL. Posiew o mniejszej gęstości zapobiegał wzrostowi komórek, nawet gdy komórki były hodowane na płytkach 12-dołkowych, które mają mniejszą powierzchnię w porównaniu z szalkami o wymiarach 35 x 10 mm.

Wyniki

Przykład komórek mikrogleju w stanie spoczynku i aktywowanych przedstawiono na Rysunku 1. Mikroglej został zobrazowany 24 h po wysianiu (Rysunek 1a) i wykazuje morfologię rozgałęzioną (spoczynkową). Ekspozycja na odczyn prymujący, bakteryjny lipopolisacharyd (LPS), prowadzi do zmian w morfologii mikrogleju w miarę aktywacji komórek (Rysunek 1b).

Przykład liczenia komórek przed wysianiem przedstawiono na Rysunku 2. Ze względu n...

Dyskusja

Mikroglej moduluje normalne funkcjonowanie OUN, a także reakcje zapalne na różne patologie. Funkcjonalna przebudowa synaps przez mikroglej jest zaangażowana w utrzymanie prawidłowej homeostazy mózgu ¹⁵. Podczas kaskady neurogennej uczestniczą w usuwaniu nerwowych komórek progenitorowych z zakrętu zębatego hipokampa ^{4, 16}. Dlatego konieczne jest opracowanie systemu hodowli, w którym można by badać mikroglej noworodków i dorosłych, który obejmie ogromny obszar rozwoju i dorosłości, w którym mikroglej ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
EDTA, 5mM	Invitrogen	15567-028
Lidokaina, 60mM	Sigma	L-5647
Trypan Blue	Sigma	T8154
Trypsyna/EDTA	Cellgro	25-052-CI
DMEM, 1X	Cellgro	10-017
Pirogronian sodu	Cellgro	25-000-Cl
Siarczan gentamycyny	Biowittaker	17-518Z
35 x 10mm naczynie do hodowli tkankowych	Falcon	353001
Poli-D-lizyna, 100 μ g/ml			Rozcieńczony 1:20
HBSS, 1X	Cellgro	20-023-CV