Separacja typów komórek spermatogennych za pomocą sedymentacji prędkości STA-PUT

Summary

Metoda STA-PUT pozwala na rozdzielanie różnych populacji komórek spermatogennych na podstawie wielkości i gęstości.

Abstract

Spermatogeneza ssaków to złożony proces różnicowania, który zachodzi w kilku etapach w kanalikach nasiennych jąder. Obecnie nie ma niezawodnego systemu hodowli komórkowej pozwalającego na różnicowanie plemników in vitro, a większość badań biologicznych komórek plemnikotwórczych wymaga pobrania tkanek z modeli zwierzęcych, takich jak myszy i szczury. Ponieważ jądro zawiera wiele typów komórek - zarówno niespermatogennych (Leydig, Sertoli, komórki szpikowe i nabłonkowe), jak i plemnikotwórczych (spermatogonia, spermatocyty, okrągłe spermatydy, plemniki kondensacyjne i plemniki) - badania mechanizmów biologicznych zaangażowanych w spermatogenezę wymagają izolacji i wzbogacenia tych różnych typów komórek. Metoda STA-PUT pozwala na oddzielenie niejednorodnej populacji komórek - w tym przypadku od jąder - poprzez liniowy gradient BSA. Poszczególne typy komórek osadzają się z różną prędkością sedymentacji w zależności od wielkości komórki, a frakcje wzbogacone o różne typy komórek mogą być zbierane i wykorzystywane w dalszych analizach. Chociaż metoda STA-PUT nie daje w wyniku wysoce czystych frakcji typów komórek, np. jak można uzyskać przy użyciu niektórych metod sortowania komórek, zapewnia ona znacznie wyższą wydajność całkowitej liczby komórek w każdej frakcji
(~1 x 10⁸ komórek/typ komórek spermatogennych z początkowej populacji 7-8 x 10⁸ komórek). Ta wysokowydajna metoda wymaga jedynie specjalistycznego szkła i może być wykonywana w dowolnej chłodni lub dużej lodówce, co czyni ją idealną metodą dla laboratoriów, które mają ograniczony dostęp do specjalistycznego sprzętu, takiego jak sortownik komórek aktywowany fluorescencją (FACS) lub elutriator.

Introduction

Spermatogeneza ssaków to złożony proces różnicowania, który zachodzi w kilku etapach w kanalikach nasiennych jąder¹. Krótko mówiąc, spermatogonie przypominające łodygę, które znajdują się w pobliżu nabłonka kanalika nasiennego, dzielą się i różnicują w spermatocyty, które następnie przechodzą podziały mejotyczne. Po zakończeniu mejozy powstałe haploidalne komórki lub okrągłe spermatydy przechodzą spermiogenezę, proces różnicowania, który obejmuje zrzucanie cytoplazmy i zagęszczenie jądra. Spermatydy stopniowo rozwijają wić i ulegają wydłużeniu i kondensacji jądra, wytwarzając odpowiednio wydłużające, a następnie kondensujące spermatydy. Produktami końcowymi są plemniki, które są uwalniane do światła kanalika nasiennego, a ostatecznie do najądrza, gdzie dalej dojrzewają.

Ponieważ proces spermatogenezy opiera się na specjalnych warunkach hormonalnych i molekularnych w jądrach, niezawodny system hodowli in vitro dla całego procesu spermatogenezy nie został jeszcze opracowany^2,3. Opracowano metody hodowli w celu tworzenia "pierwotnych komórek rozrodczych" i haploidalnych, "okrągłych komórek podobnych do spermatydów" z komórek macierzystych, ale metody te nie są jeszcze w stanie wygenerować dużej liczby tych komórek i nie są w stanie wytworzyć późniejszych typów komórek plemnikotwórczych^4,5. Na szczęście typy komórek spermatogennych różnią się znacznie wielkością, co pozwala na oddzielenie zawiesiny jednokomórkowej uzyskanej z całych jąder za pomocą gradientu cieczy. Zademonstrowana tutaj metoda STA-PUT wykorzystuje liniowy gradient BSA i prostą sedymentację do separacji komórek plemnikotwórczych na podstawie wielkości i masy^6-9.

Metoda STA-PUT ma kilka zalet w porównaniu z dwoma najczęściej stosowanymi metodami rozdzielania typów komórek spermatogennych: FACS i elutriacja^10-13. Aparat STA-PUT wymaga jedynie kilku sztuk specjalistycznego szkła zmontowanego w chłodni lub dużej lodówce. Dzięki temu jest tańszy niż użycie sortownika komórek lub elutriatora. Metoda STA-PUT daje większą ilość komórek na typ komórki i jądra, niż można posortować za pomocą FACS w porównywalnym czasie, chociaż czystość każdej populacji komórek nie jest tak wysoka, jak w przypadku FACS¹¹. Sortowanie komórek za pomocą kulek magnetycznych (magnetic activated cell sorting, MACS) jest ostatnio z powodzeniem stosowane do wzbogacania spermatogonii z mieszanej populacji komórek jąder, ale obecnie nie nadaje się do oddzielania spermatocytów lub spermatydów ze względu na brak wiedzy na temat odpowiednich markerów powierzchniowych¹⁴. Dodatkową przewagą metody STA-PUT nad FACS czy MACS jest możliwość wyizolowania żywotnych komórek nadających się do późniejszej hodowli, ponieważ w przeciwieństwie do większości protokołów FACS nie wymaga ona barwienia DNA ani innych rodzajów barwienia. W przypadku badań, które wymagają dużej wydajności typów komórek spermatogennych o czystości ~90%, STA-PUT jest idealną metodą.

Protocol

Protokół STA-PUT składa się z trzech etapów: 1) Przygotowanie aparatury i odczynników, 2) Przygotowanie zawiesiny komórek z całych jąder, oraz 3) Ładowanie komórek, sedymentacja i pobieranie frakcji. W przypadku wykonywania przez zespół dwóch badaczy, protokół trwa średnio osiem godzin.

1. Konfiguracja aparatu STA-PUT (Rysunek 1)

***Aparat STA-PUT powinien być umieszczony w dużej lodówce o temperaturze 4°C lub w chłodni, która może również pomieścić kolektor frakcji, jeśli ta metoda zbierania jest preferowana.

1. W noc poprzedzającą (lub przynajmniej kilka godzin przed) wykonaniem metody umyj cały sprzęt (zwłaszcza szkło i rurki) i wysterylizuj 70% etanolem. Poczekaj, aż sprzęt całkowicie wyschnie przed montażem urządzenia, jak pokazano na rysunku 1.
2. Przymocuj dwie butle o pojemności 2 litrów (rysunki 1B i C) oraz komorę ładowania ogniw (rysunek 1A) do górnej platformy i połącz wszystko za pomocą dwóch małych kawałków rurki z rurką clamps. Zacisnąć wszystkie rurki zamknięte. Uszczelnij wylewkę na skrajnej prawej butli o pojemności 2 l.
3. Umieść małe mieszadło w komorze ładowania komory (rysunek 1A), a większe mieszadło w skrajnym lewym cylindrze o pojemności 2 litrów (rysunek 1B), który będzie zawierał 2% BSA.
4. Umieść komorę sedymentacyjną o pojemności 2 l na platformie (rysunek 1D). Umieść metalową przegrodę (Rysunek 1F) bezpośrednio na górze otworu w dnie komory sedymentacyjnej (Rysunek 1D). Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ przegroda zapobiega wirowaniu cieczy i zakłóceniu gradientu komórek podczas zbierania frakcji. Umieść pokrywę na górze komory sedymentacyjnej.
5. Po nałożeniu bardzo małej ilości smaru próżniowego na szlifowane szklane złącze zaworu trójdrogowego (rysunek 1G), zacisnąć zawór odcinający na dnie komory sedymentacyjnej, łącząc szlifowane szklane złącza kurka i komory sedymentacyjnej.
6. Podłącz komorę ładowania ogniw (Rysunek 1A) do prawego wylotu kurka za pomocą rurki. Zamknij zawór odcinający.
7. Podłącz rurkę do frakcjonowania komórek do lewego wylotu kurka. Rurka do frakcjonowania składa się z kawałka rurki ze szklaną pipetą Pasteura podłączoną do otwartego końca. Kawałek rurki o mniejszym otworze jest przymocowany do wąskiego końca szklanej pipety. Wąska pipeta ogranicza przepływ zawiesiny komórek podczas pobierania frakcji. Zaciśnij tę małą rurkę na samym dole.
8. Przygotować 2 l buforu Krebsa (1x) w dniu eksperymentu (Tabela 1). Następnie przygotuj 550 ml 2% BSA w 1x Krebs, 550 ml 4% BSA w 1x Krebs i 50 ml 0,5% BSA w 1x Krebs. Przefiltrować i schłodzić te roztwory do temperatury 4 °C.
9. Wlej 4% roztwór BSA do prawej butli o pojemności 2 l (rysunek 1C), a 2% roztwór BSA do lewej butli o pojemności 2 l (rysunek 1B). Upewnij się, że w rurkach łączących te cylindry nie ma dużych pęcherzyków.
10. Wlej bufor Krebsa do komory ładowania komórek i napełnij rurkę łączącą tę komorę z komorą sedymentacyjną, upewniając się, że nie ma dużych pęcherzyków, ponieważ mogłyby one zaburzyć gradient. Delikatne ściskanie lub trzepanie rurki pomaga usunąć pęcherzyki. Upewnij się, że cały bufor Krebsa znajduje się w probówce, a nie w komorze celi.
11. Pozwolić, aby niewielka ilość buforu Krebsa spłynęła do komory sedymentacyjnej, a następnie spuścić prawie cały bufor do rurki frakcjonowania komórek w celu napełnienia probówki i usunięcia wszelkich dużych pęcherzyków.
12. Umieść kolektor frakcji bezpośrednio pod komorą sedymentacyjną. Upewnij się, że wszystkie probówki z frakcją są na swoim miejscu i przykryte folią, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

2. Izolowanie komórek plemnikotwórczych od całych jąder

1. Wypreparuj jądra od około12 dorosłych myszy (najlepiej w wieku co najmniej ośmiu tygodni) i umieść w buforze Krebsa w temperaturze pokojowej, aby zmyć wszelkie zanieczyszczenia. Zademonstrowany protokół obejmuje wykorzystanie myszy laboratoryjnych i został wykonany zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Pensylwanii.
2. Dodaj 45 mg kolagenazy do 50 ml buforu Krebsa w stożkowej probówce tuż przed planowanym dodaniem kanalików nasiennych. Pozostawić roztwór do nagrzania do temperatury 33 °C przez kilka minut. Podzielić równomiernie na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml.
3. Zdecapsulować jądra na osobnej płytce zawierającej 8 ml buforu Krebsa, odrzucając osłonkę białawą i uwalniając kanaliki nasienne. Tunica albuginea to cienka błona otaczająca kanaliki nasienne. Kanaliki powinny łatwo odłączyć się od osłonki białawej. Aby to zrobić, wykonaj nacięcie w osłonce białawej, przytrzymaj tę błonę parą kleszczy i wypchnij kanaliki z błony i odsuń od niej inną parą kleszczy.
4. Dodać 4 ml buforu Krebsa zawierającego kanaliki do każdej stożkowej probówki zawierającej 25 ml roztworu kolagenazy i inkubować, wstrząsając, w temperaturze 33 °C przez 10 minut. Na końcu kanaliki powinny mieć wygląd "przypominający spaghetti".
5. Pozwól kanalikom osiąść na ~ 5 minut do dna rurki. Wylać sklarowany osad i przemyć 2x w 25 ml buforu Krebsa (w temperaturze pokojowej), pozwalając kanalikom za każdym razem osiąść na dnie probówki. Pozostaw ~5 ml buforu Krebsa w każdej probówce.
6. Podczas mycia dodaj 30 mg trypsyny do 50 ml buforu Krebsa w probówce sokoła tuż przed planowanym dodaniem kanalików nasiennych. Pozostawić roztwór do nagrzania do temperatury 33 °C przez kilka minut. Podzielić równomiernie na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml.
7. Dodać 25 ml roztworu trypsyny do każdej z dwóch probówek zawierających kanaliki. Dodaj 3 μg DNAzy (1 μg/10 ml) do każdej probówki, aby zapobiec zlepianiu się komórek. Inkubować, wstrząsając, w temperaturze 33 °C przez 10 minut.
8. Za pomocą pipety o szerokim otworze wymieszać roztwór zawierający kanaliki, pipetując je około 10 razy. Roztwór powinien zacząć wyglądać bardziej jak zawiesina pojedynczej komórki.
9. Inkubować, wstrząsając, w temperaturze 33 °C przez dodatkowe 10 minut. Użyj pipety o szerokim otworze, aby rozproszyć kanaliki w zawiesinie jednokomórkowej, pipetując je i odpipetowując około 25 razy. Jeśli nadal widzisz dużo kanalików lub grudek komórek, rozprowadź więcej za pomocą pipety i/lub dodaj kolejne 3 μg DNAzy do każdej probówki (podwójne stężenie początkowe).
10. Przefiltrować zawiesinę jednokomórkową przez sitko o siatkowej siatce 100 μm (po jednym na każdą probówkę 30 ml zawiesiny komórek). Połącz zawiesiny komórek i policz całkowitą liczbę komórek (powinna wynosić od 7 do 8 x 10⁸ komórek). NIE ŁADUJ WIĘCEJ NIŻ 800 000 000 komórek na gradient.
11. Na podstawie liczby komórek uzyskanej w kroku 2.10 rozsypać odpowiednią objętość przefiltrowanych komórek w temperaturze 450 rcf przez 5 minut i przemyć 30 ml buforu Krebsa. Powtórzyć. Zwykle 22 jądra dają więcej niż 800 000 000 komórek, ale nie ładuj więcej niż ta liczba komórek.
12. Ostrożnie ponownie zawiesić komórki w 25 ml 0,5% BSA zawierającym od 2,5 do 5 μg DNAzy (w zależności od stopnia zlepiania się komórek) bez tworzenia pęcherzyków. Upewnij się, że komórki się nie zlepiają. Przefiltruj zawiesinę jednokomórkową przez siatkowy sitko o siatku 100 μm. Komórki są teraz gotowe do załadowania. Dobrze wymieszaj przed załadowaniem, odwracając rurkę kilka razy.

3. Ładowanie komórek i sedymentacja

1. Upewnij się, że zawór odcinający jest zamknięty, ale w pozycji, która umożliwi przepływ cieczy z komory celi (rysunek 1A) do komory sedymentacyjnej (rysunek 1D).
2. Przekręć obie płytki mieszadła na niskie ustawienie (około 70 obr./min), aby mieszadła poruszały się w sposób ciągły, ale powolny.
3. Wlać zawiesinę komórek do komory komórkowej (rysunek 1A) i otworzyć kran tak, aby komórki powoli przepływały do komory sedymentacyjnej z szybkością 10 ml/min (rysunek 1D). Zamknij zawór odcinający. Natężenie przepływu można określić, zaznaczając odstępy objętości na komorze sedymentacyjnej.
4. Wlać 5 ml 0,5% roztworu BSA do komory komórkowej i odsączyć do komory sedymentacyjnej z prędkością 10 ml/min. Zamknij zawór odcinający. Ten krok wypłucze komórki z komory komórkowej. Powtórz 4 razy.
5. Przygotuj gradient: Otwórz zaciski między komorą celi (rysunek 1A) a dwoma cylindrami o pojemności 2 litrów (rysunek 1B i C) i natychmiast rozpocznij spuszczanie cieczy do komory sedymentacyjnej z szybkością 40 ml/min (rysunek 1D). Dostosuj natężenie przepływu tak, aby załadowanie gradientu BSA do komory sedymentacyjnej zajęło około 20-30 minut. Powinna być widoczna cienka, niezakłócona warstwa komórek leżąca na szczycie gradientu BSA. Po załadowaniu większości BSA zamknij kran i przekręć go do pozycji, która umożliwi spływanie cieczy z komory sedymentacyjnej do rurki frakcjonowania.
6. Wyłącz talerze mieszające.
7. Pozostaw komórki do osadzenia się na godzinę i 45 minut. W TYM CZASIE NIE PRZESZKADZAJ W PRACY URZĄDZENIA. Jakiekolwiek poruszenie mechaniczne może zaburzyć gradient.

4. Frakcjonowanie i analiza frakcji

***Podczas wykonywania następujących kroków, uważaj, aby nie zakłócić gradientu. Jeśli gradient BSA zostanie zakłócony, procedura nie zadziała!

1. Gdy komórki się osadzą, powoli odcedź 50 ml z komory sedymentacyjnej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odstaw na bok. Ta frakcja zwykle zawiera niechciane grudki komórek i gruzu.
2. Przymocuj rurkę frakcji do kolektora frakcji. Możliwe jest również ręczne zbieranie frakcji, jeśli kolektor frakcji nie jest dostępny.
3. Zbieranie frakcji: Wyreguluj natężenie przepływu za pomocą kranu tak, aby 10 ml (napełniając jedną probówkę zbiorczą) było zbierane co 45 sekund.
4. Zakryj probówki do zbierania frakcji i wiruj przez 5 minut w temperaturze 450 rcf w temperaturze 4 °C. Delikatnie odlej supernatant, ponownie zawieś komórki w pozostałym płynie i utrzymuj komórki na lodzie.
5. Po zebraniu wszystkich frakcji przeanalizuj je pod mikroskopem dla różnych populacji komórek. Można rozróżnić różne typy komórek na podstawie wielkości komórki i morfologii jądra^8,15 . Rysunek 2 ilustruje "reprezentatywne wyniki" dla trzech połączonych frakcji, które są wzbogacone dla (a) komórek somatycznych i mejotycznych oraz spermatogonii, (b) okrągłych spermatyd oraz (c) spermatyd wydłużających i zagęszczających.
   • Spermatogonie typu A mają średnicę ok. 12-14 μm i okrągłe jądra, które są jednorodne pod względem składu chromatyny.
   • Spermatogonie typu B mają średnicę ok. 8-9 μm i okrągłe jądra, które wykazują gęstszą heterochromatynę wzdłuż obwodu jądra.
   • Spermatocyty preleptotenowe mają średnicę ok. 7,5-8,2 μm, mają mniej cytoplazmy niż spermatogonia typu B i mają jądra podobne do tych w spermatogonii typu B.
   • Pierwotne spermatocyty leptotenu mają średnicę ok. 8-10 μm i jądra, które wyglądają podobnie do spermatocytów sprzed leptotenu, ale wydają się uzyskiwać gęstszą chromatynę na błonie jądrowej.
   • Pierwotne spermatocyty zygotenu mają średnicę ok. 10-12 μm i jądra przypominające jądra spermatocytów pierwotnych leptotenu.
   • Spermatocyty pachytenowe mają średnicę od 12 do 18 μm i składają się z cienkiej obwódki cytoplazmy otaczającej duże jądro. W jądrze można zaobserwować więcej grudek gęstej chromatyny.
   • Okrągłe spermatydy mają średnicę ok. 10 μm i mają okrągłe jądro z gęsto barwiącym chromocentrum pośrodku.
   • Ciała szczątkowe mają średnicę ~6,5 μm, są okrągłe i nie mają jądra.
   • Wydłużające się i zagęszczające spermatydy są podobne wielkością do okrągłych spermatyd, ale mają unikalne, sierpowate jądro.
   1. Zacznij od frakcji 15 i analizuj co pięć frakcji do 85. Zwykle frakcje poniżej 15 będą zbyt wymieszane i grudkowate, a frakcje powyżej 85 będą zawierały niewiele użytecznych komórek lub nie będą ich wcale.
   2. Aby przeanalizować frakcję, weź 5 μl cieczy z probówki do zbierania frakcji (po ponownym zawieszeniu komórek po odwirowaniu) i dodaj do 5 μl 8% formaldehydu w buforze Krebsa. Pozostaw utrwalone komórki w temperaturze pokojowej na pięć minut.
   3. Dodaj 5 μl 0,1% Tritonu i DAPI (5 μ/ml buforu Krebsa) do stałych komórek. Pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na 5 minut.
   4. Umieścić 10 μl otrzymanego roztworu na szkiełku podstawowym, przykryć szkiełkiem nakrywkowym i przeanalizować pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia czystości każdej frakcji.
   5. Połącz frakcje o podobnej wielkości i morfologii jądra (patrz "Reprezentatywne wyniki"), aby utworzyć następujące populacje komórek: mejotyczne i somatyczne komórki diploidalne, okrągłe spermatydy i zagęszczające/wydłużające się spermatydy.

Results

Idealnym wynikiem procedury STA-PUT jest dość zauważalne oddzielenie komórek od jąder na podstawie wielkości i gęstości komórek. Podczas gdy komórki wyizolowane z jąder sedymentują przez gradient BSA, można zaobserwować kilka odrębnych pasm komórek. Wszelkie kępy komórek mają tendencję do opadania na dno gradientu i nie zanieczyszczają innych frakcji. Nieco dalej w górę gradientu będą duże komórki somatyczne i mejotyczne. Dalej w górę gradientu nadal będą mniejsze okrągłe spermatydy. Na szczycie gradientu znajdują s...

Discussion

Ci, którzy badają spermatogenezę, polegają na modelach zwierzęcych w przypadku próbek komórek spermatogennych, ponieważ nie istnieje jeszcze niezawodny system hodowli komórkowych do generowania wszystkich typów komórek spermatogennych³. Chociaż komórki plemnikotwórcze są łatwo pobierane z całych jąder, powstaje tylko mieszana populacja. Stanowi to problem dla tych, którzy chcą badać określone podtypy tych komórek, takie jak komórki mejotyczne, okrągłe spermatydy i spermatydy kondensacyjne. Obecnie stosuje s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate.
0,5%, 2% i 4% roztwory BSA	Rozpuścić 0,25 g, 11 g i 22 g (odpowiednio) w łącznych objętościach 50 ml, 550 ml i 550 ml 1x KREBS (odpowiednio).	Do dnia przeprowadzenia procedury STA-PUT. Filtruj sterylizację.
KREBS (10x)	3,26 g KH2PO4 + 139,5 g NaCl +5,89 g MgSO4/7H20 + 40 g dekstroza + 3,78 g CaCl2/2H20 + 7,12 g KCl, doprowadzić do 2 l za pomocą autoklawu/filtra ddH20	i przechowywać w temperaturze 4 &; C przez kilka miesięcy.
KREBS (1x)	Rozpuścić 4,24 g NaHCO3 w 100 ml ddH20. Dodać 200 ml 10x KREBS. Doprowadzić do 2 l za pomocą ddH20.	Do dnia przeprowadzenia procedury STA-PUT. Filtruj sterylizację.
Kolagenaza	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsyna	Sigma	T9201-1G
DAPI Preferencja	badacza
Triton-X100	Preferencje badacza
Formaldehyd (~37%)	Preferencje badacza
TABELA 2: SPRZĘT
Sprzęt	firmy	#	Comments
Kompletna aparatura STA-PUT	Sklep	ze szkłem ProScienceSTA-PUT (w tej procedurze wykorzystuje się standardową komorę sedymentacyjną: Kat. Nr 56700-500)	Obejmuje wszystkie szkło i wyposażenie aparatu. Alternatywne szkło jest dostępne do wykonywania STA-PUT z mniejszymi numerami komórek.
10 μ m filtr siatkowy	Fisherbrand	22363549
Narzędzia do preparowania myszy	Preferencja badacza
14 ml probówki do zbierania frakcji z okrągłym dnem z nakrętkami	Preferencja badacza
Potrzebujesz około 100 probówek
	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Kod produktu: 18-1177-40	Można użyć alternatywy.
Szkiełka mikroskopowe, szkło nakrywkowe	Preferencje badacza
Mikroskop świetlny/fluorescencyjny	Preferencje badacza