Metoda STA-PUT pozwala na rozdzielanie różnych populacji komórek spermatogennych na podstawie wielkości i gęstości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Separacja typów komórek spermatogennych za pomocą sedymentacji prędkości STA-PUT
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Spermatogeneza ssaków to złożony proces różnicowania, który zachodzi w kilku etapach w kanalikach nasiennych jąder. Obecnie nie ma niezawodnego systemu hodowli komórkowej pozwalającego na różnicowanie plemników in vitro, a większość badań biologicznych komórek plemnikotwórczych wymaga pobrania tkanek z modeli zwierzęcych, takich jak myszy i szczury. Ponieważ jądro zawiera wiele typów komórek - zarówno niespermatogennych (Leydig, Sertoli, komórki szpikowe i nabłonkowe), jak i plemnikotwórczych (spermatogonia, spermatocyty, okrągłe spermatydy, plemniki kondensacyjne i plemniki) - badania mechanizmów biologicznych zaangażowanych w spermatogenezę wymagają izolacji i wzbogacenia tych różnych typów komórek. Metoda STA-PUT pozwala na oddzielenie niejednorodnej populacji komórek - w tym przypadku od jąder - poprzez liniowy gradient BSA. Poszczególne typy komórek osadzają się z różną prędkością sedymentacji w zależności od wielkości komórki, a frakcje wzbogacone o różne typy komórek mogą być zbierane i wykorzystywane w dalszych analizach. Chociaż metoda STA-PUT nie daje w wyniku wysoce czystych frakcji typów komórek, np. jak można uzyskać przy użyciu niektórych metod sortowania komórek, zapewnia ona znacznie wyższą wydajność całkowitej liczby komórek w każdej frakcji
(~1 x 108 komórek/typ komórek spermatogennych z początkowej populacji 7-8 x 108 komórek). Ta wysokowydajna metoda wymaga jedynie specjalistycznego szkła i może być wykonywana w dowolnej chłodni lub dużej lodówce, co czyni ją idealną metodą dla laboratoriów, które mają ograniczony dostęp do specjalistycznego sprzętu, takiego jak sortownik komórek aktywowany fluorescencją (FACS) lub elutriator.
Wprowadzenie
Spermatogeneza ssaków to złożony proces różnicowania, który zachodzi w kilku etapach w kanalikach nasiennych jąder1. Krótko mówiąc, spermatogonie przypominające łodygę, które znajdują się w pobliżu nabłonka kanalika nasiennego, dzielą się i różnicują w spermatocyty, które następnie przechodzą podziały mejotyczne. Po zakończeniu mejozy powstałe haploidalne komórki lub okrągłe spermatydy przechodzą spermiogenezę, proces różnicowania, który obejmuje zrzucanie cytoplazmy i zagęszczenie jądra. Spermatydy stopniowo rozwijają wić i ulegają wydłużeniu i kondensacji jądra, wytwarzając odpowiednio wydłużające, a następnie kondensujące spermatydy. Produktami końcowym....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół STA-PUT składa się z trzech etapów: 1) Przygotowanie aparatury i odczynników, 2) Przygotowanie zawiesiny komórek z całych jąder, oraz 3) Ładowanie komórek, sedymentacja i pobieranie frakcji. W przypadku wykonywania przez zespół dwóch badaczy, protokół trwa średnio osiem godzin.
1. Konfiguracja aparatu STA-PUT (Rysunek 1)
***Aparat STA-PUT powinien być umieszczony w dużej lodówce o temperaturze 4°C lub w chłodni, która może również pomieścić kolektor frakcji, jeśli ta metoda zbierania jest preferowana.
- W noc poprzedzającą (lub przynajmniej kilka godzin przed) wykonaniem metody umyj cały sprzę....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Idealnym wynikiem procedury STA-PUT jest wyraźna separacja komórek jąder na podstawie ich wielkości i gęstości. Podczas sedymentacji komórek izolowanych z jąder w gradiencie BSA można zaobserwować kilka wyraźnych pasm komórkowych. Wszelkie skupiska komórek mają tendencję do opadania na dno gradientu, dzięki czemu nie zanieczyszczają one pozostałych frakcji. Nieco wyżej w gradiencie znajdują się duże komórki somatyczne i meiotyczne. Jeszcze wyżej w gradiencie znajdują się mniejsze okrągłe spermatydy. Na górze gradientu zn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ci, którzy badają spermatogenezę, polegają na modelach zwierzęcych w przypadku próbek komórek spermatogennych, ponieważ nie istnieje jeszcze niezawodny system hodowli komórkowych do generowania wszystkich typów komórek spermatogennych3. Chociaż komórki plemnikotwórcze są łatwo pobierane z całych jąder, powstaje tylko mieszana populacja. Stanowi to problem dla tych, którzy chcą badać określone podtypy tych komórek, takie jak komórki mejotyczne, okrągłe spermatydy i spermatydy kondensacyjne. Obecnie stosuje s.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Demonstrowany protokół obejmuje użycie myszy laboratoryjnych i został wykonany zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Zwierzęta wykorzystywane w tym protokole są utrzymywane pod nadzorem i aprobatą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Pensylwanii (protokół IACUC #804284).
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty NIH GM055360 SLB i U54HD068157 RGM. JMB był wspierany przez T32 Genetics Training Grant na Uniwersytecie Pensylwanii (GM008216).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| BSA | Affymetrix/USB | 10857 100MG | Alternate. |
| 0,5%, 2% i 4% roztwory BSA | Rozpuścić 0,25 g, 11 g i 22 g (odpowiednio) w łącznych objętościach 50 ml, 550 ml i 550 ml 1x KREBS (odpowiednio). | Do dnia przeprowadzenia procedury STA-PUT. Filtruj sterylizację. | |
| KREBS (10x) | 3,26 g KH2PO4 + 139,5 g NaCl +5,89 g MgSO4/7H20 + 40 g dekstroza + 3,78 g CaCl2/2H20 + 7,12 g KCl, doprowadzić do 2 l za pomocą autoklawu/filtra ddH20 | i przechowywać w temperaturze 4 &; C przez kilka miesięcy. | |
| KREBS (1x) | Rozpuścić 4,24 g NaHCO3 w 100 ml ddH20. Dodać 200 ml 10x KREBS. Doprowadzić do 2 l za pomocą ddH20. | Do dnia przeprowadzenia procedury STA-PUT. Filtruj sterylizację. | |
| Kolagenaza | Sigma | C9891-1G | |
| DNAse | Sigma | DNEP-5MG | |
| Trypsyna | Sigma | T9201-1G | |
| DAPI Preferencja | badacza | ||
| Triton-X100 | Preferencje badacza | ||
| Formaldehyd (~37%) | Preferencje badacza | ||
| TABELA 2: SPRZĘT | |||
| Sprzęt | firmy | # | Comments |
| Kompletna aparatura STA-PUT | Sklep | ze szkłem ProScienceSTA-PUT (w tej procedurze wykorzystuje się standardową komorę sedymentacyjną: Kat. Nr 56700-500) | Obejmuje wszystkie szkło i wyposażenie aparatu. Alternatywne szkło jest dostępne do wykonywania STA-PUT z mniejszymi numerami komórek. |
| 10 μ m filtr siatkowy | Fisherbrand | 22363549 | |
| Narzędzia do preparowania myszy | Preferencja badacza | ||
| 14 ml probówki do zbierania frakcji z okrągłym dnem z nakrętkami | Preferencja badacza | ||
| Potrzebujesz około 100 probówek | |||
| GE Healthcare Life Sciences | Model: Frac-920, Kod produktu: 18-1177-40 | Można użyć alternatywy. | |
| Szkiełka mikroskopowe, szkło nakrywkowe | Preferencje badacza | ||
| Mikroskop świetlny/fluorescencyjny | Preferencje badacza |
Bibliografia
- Wistuba, J., Stukenborg, J., Luetjens, C. M. Mammalian Spermatogenesis. Funct. Dev. Embryol. 1, 99-117 (2007).
- Hess, R. A., Cooke, P. S., Hofmann, M. C., Murphy, K. M. Mechanistic insights into the regulation of the spermatogonial stem cell niche. Cell Cycle. 5, 1164-1170 (2006)....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
