In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego

Podsumowanie

Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.

Streszczenie

Stan zapalny jest fundamentalnym aspektem wielu chorób ludzkich. W tym raporcie wideo przedstawiamy nieinwazyjne techniki obrazowania bioluminescencyjnego, które rozróżniają ostry i przewlekły stan zapalny w modelach mysich. W przypadku uszkodzenia tkanek lub inwazji patogenu neutrofile są pierwszą linią obrony, odgrywając główną rolę w pośredniczeniu w ostrej odpowiedzi zapalnej. W miarę postępu reakcji zapalnej krążące monocyty stopniowo migrują do miejsca urazu i różnicują się w dojrzałe makrofagi, które pośredniczą w przewlekłym zapaleniu i wspomagają naprawę tkanek poprzez usuwanie resztek tkanek i wytwarzanie cytokin przeciwzapalnych. Dootrzewnowe wstrzyknięcie luminolu (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodion, sól sodowa) umożliwia wykrycie ostrego stanu zapalnego, w którym w dużej mierze pośredniczą neutrofile naciekające tkanki. Luminol specyficznie reaguje z ponadtlenkiem wytwarzanym w fagosomach neutrofili, ponieważ bioluminescencja wynika z reakcji za pośrednictwem mieloperoksydazy (MPO). Lucygenina (azotan bis-N-metyloakrydyny) reaguje również z ponadtlenkiem w celu wytworzenia bioluminescencji. Jednak bioluminescencja lucygeniny jest niezależna od MPO i opiera się wyłącznie na oksydazie fagocytów NADPH (Phox) w makrofagach podczas przewlekłego stanu zapalnego. Razem luminol i lucygenina umożliwiają nieinwazyjną wizualizację i ocenę podłużną różnych populacji fagocytów zarówno w ostrych, jak i przewlekłych fazach zapalnych. Biorąc pod uwagę ważną rolę stanu zapalnego w różnych chorobach człowieka, uważamy, że ta nieinwazyjna metoda obrazowania może pomóc w badaniu zróżnicowanych ról neutrofili i makrofagów w różnych stanach patologicznych.

Wprowadzenie

Stan zapalny to wysoce regulowana reakcja biologiczna związana z różnymi chorobami ludzkimi, w tym infekcją mikrobiologiczną ¹, gojeniem się ran ², cukrzycą ³, rakiem ⁴, sercowo-naczyniową ⁵, neurodegeneracyjną ⁶ i chorobami autoimmunologicznymi ⁷. Zapalenie tkanek wymaga prawidłowej koordynacji różnych komórek odpornościowych w celu osiągnięcia usunięcia patogenu, naprawy tkanek i rozwiązania choroby. Neutrofile i makrofagi są kluczowymi mediatorami immunologicznymi zapalenia tkanek. W ostrej fazie zapalenia neutrofile jako pierwsze reagują na różne szkodliwe bodźce i uszkodzenia tkanek

Protokół

Uwaga: Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi i wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Odczynniki i roztwory

1. Roztwór PMA do inokulacji s.c.: Przygotować roztwór podstawowy 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) w stężeniu 5 mg/ml w DMSO. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C. Przed inokulacją rozmrozić roztwór podstawowy i rozcieńczyć do 1 mg/ml PMA w PBS.
2. Roztwór LPS do inokulacji s.c.: Rozpuścić lipopolisacharyd (LPS z serotypu enterica Salmonella enterica) w sterylnym PBS w dawce 1 mg/ml prze....

Wyniki

Przeprowadziliśmy podłużne obrazowanie bioluminescencyjne w celu oceny stanu zapalnego w fazie ostrej i przewlekłej w eksperymentalnych modelach zapalenia. Mirystanian fosforanu forbolu (PMA) jest silnym agonistą kinazy białkowej C (PKC), który aktywuje kompleks Phox do produkcji anionu ponadtlenkowego i wywołuje intensywne ostre reakcje zapalne ²¹. Podskórny zastrzyk 50 mg PMA u myszy nago NCr spowodował szybkie podrażnienie skóry i ostry stan zapalny w miejscach wstrzyknięcia ^{18, 22, 23}. Obrazowan.......

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiono metodę bioluminescencji do nieinwazyjnego obrazowania stanu zapalnego u żywych zwierząt. Wykorzystując dwa podłoża luminescencyjne, luminol i lucygeninę, metoda może rozróżnić różne fazy zapalenia. Bioluminescencja luminolu jest związana z neutrofilami w ostrej fazie zapalenia, podczas gdy bioluminescencja lucygeniny jest pośredniczona przez makrofagi w fazie przewlekłej. Stosunkowo mały (M.W. = 177,16 g/mol) i elektrycznie nienaładowany, luminol może łatwo przenikać zarówno przez plaz.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	P8139
Lipopolisacharyd z Salmonella enterica serotyp enteritidis	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	L2012
Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodion, sól sodowa)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	A4685
Lucygenina (azotan bis-N-metyloakrydyniowy)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	M8010
System obrazowania IVIS Spectrum z pakietem oprogramowania Living Imaging 4.2	Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA&		nbsp;