Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stan zapalny jest fundamentalnym aspektem wielu chorób ludzkich. W tym raporcie wideo przedstawiamy nieinwazyjne techniki obrazowania bioluminescencyjnego, które rozróżniają ostry i przewlekły stan zapalny w modelach mysich. W przypadku uszkodzenia tkanek lub inwazji patogenu neutrofile są pierwszą linią obrony, odgrywając główną rolę w pośredniczeniu w ostrej odpowiedzi zapalnej. W miarę postępu reakcji zapalnej krążące monocyty stopniowo migrują do miejsca urazu i różnicują się w dojrzałe makrofagi, które pośredniczą w przewlekłym zapaleniu i wspomagają naprawę tkanek poprzez usuwanie resztek tkanek i wytwarzanie cytokin przeciwzapalnych. Dootrzewnowe wstrzyknięcie luminolu (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodion, sól sodowa) umożliwia wykrycie ostrego stanu zapalnego, w którym w dużej mierze pośredniczą neutrofile naciekające tkanki. Luminol specyficznie reaguje z ponadtlenkiem wytwarzanym w fagosomach neutrofili, ponieważ bioluminescencja wynika z reakcji za pośrednictwem mieloperoksydazy (MPO). Lucygenina (azotan bis-N-metyloakrydyny) reaguje również z ponadtlenkiem w celu wytworzenia bioluminescencji. Jednak bioluminescencja lucygeniny jest niezależna od MPO i opiera się wyłącznie na oksydazie fagocytów NADPH (Phox) w makrofagach podczas przewlekłego stanu zapalnego. Razem luminol i lucygenina umożliwiają nieinwazyjną wizualizację i ocenę podłużną różnych populacji fagocytów zarówno w ostrych, jak i przewlekłych fazach zapalnych. Biorąc pod uwagę ważną rolę stanu zapalnego w różnych chorobach człowieka, uważamy, że ta nieinwazyjna metoda obrazowania może pomóc w badaniu zróżnicowanych ról neutrofili i makrofagów w różnych stanach patologicznych.
Wprowadzenie
Stan zapalny to wysoce regulowana reakcja biologiczna związana z różnymi chorobami ludzkimi, w tym infekcją mikrobiologiczną 1, gojeniem się ran 2, cukrzycą 3, rakiem 4, sercowo-naczyniową 5, neurodegeneracyjną 6 i chorobami autoimmunologicznymi 7. Zapalenie tkanek wymaga prawidłowej koordynacji różnych komórek odpornościowych w celu osiągnięcia usunięcia patogenu, naprawy tkanek i rozwiązania choroby. Neutrofile i makrofagi są kluczowymi mediatorami immunologicznymi zapalenia tkanek. W ostrej fazie zapalenia neutrofile jako pierwsze reagują na różne szkodliwe bodźce i uszkodzenia tkanek 8. Neutrofile szybko wynaczyniają się z krążenia do miejsca urazu, gdzie komórki dezaktywują atakujące drobnoustroje, uwalniając ziarnistości przeciwdrobnoustrojowe i fagocytozę. Podczas fagocytozy neutrofile pochłaniają inwazyjne drobnoustroje w fagosomach, w których komórki wytwarzają wysoki poziom ponadtlenku (O2·-). Ponadtlenek fagosomalny jest głównym źródłem wielu reaktywnych form tlenu (ROS). Na przykład ponadtlenek może być zmutowany do nadtlenku wodoru (H2O2) przez spontaniczną dysmutację lub przez dysmutazę ponadtlenkową (SOD) 9, 10. W neutrofilach mieloperoksydaza (MPO) dalej przekształca nadtlenek wodoru w przeciwbakteryjny kwas podchlorawy (HOCl) 11. W miarę trwania reakcji zapalnych krążące monocyty stopniowo migrują do miejsca urazu i różnicują się w dojrzałe makrofagi 2, których funkcja fagocytarna pomaga usuwać inaktywowane patogeny i resztki komórek. Ponadto, jako kluczowy regulator w późniejszej fazie zapalenia, makrofagi wspomagają naprawę tkanek poprzez wytwarzanie cytokin przeciwzapalnych 12 i generowanie zewnątrzkomórkowych ROS na niższym poziomie 9. ROS generowane na tym późniejszym etapie regulują przebudowę tkanek, tworzenie nowych naczyń i reepitelializację 13.
Oksydaza NADPH (Phox) jest głównym źródłem produkcji ponadtlenkowej zarówno w neutrofilach, jak i makrofagach 9. Phox jest kompleksem wielopodjednostkowym, którego montaż jest ściśle regulowany 9. Holoenzym zawiera kilka cytozolowych podjednostek regulatorowych (p67phox, p47phox, p40phox i RAC) oraz związany z błoną heterodimerowy cytochrom b558 (składający się z podjednostki CYBA i CYBB). Cytochrom b558 jest rdzeniem reakcyjnym, w którym podjednostka CYBB (znana również jakop91 phox i NOX2) przeprowadza pierwotną reakcję łańcuchową redoks 9. Co ciekawe, miejsca jego gromadzenia różnią się między neutrofilami a makrofagami. W spoczynkowych neutrofilach cytochrom b558 jest głównie obecny w błonie wewnątrzkomórkowych granulek spichrzowych 14. Podczas fagocytozy neutrofile gromadzą holoenzymy w fagosomy 9, gdzie również występuje wysoki poziom aktywności MPO. Neutrofile Phox szybko zużywają tlen i wywierają swoją moc bakteriobójczą poprzez produkcję ROS, zjawisko określane jako wybuch oddechowy 11. Natomiast makrofagi mają niższy poziom ekspresji MPO, a cytochrom b558 znajduje się głównie w błonie komórkowej 15, 16. W ten sposób neutrofile wytwarzają wysoki poziom ponadtlenku dla aktywności przeciwdrobnoustrojowej, podczas gdy makrofagi wytwarzają mniej ponadtlenku dla funkcji regulacyjnych 15.
Ponieważ stan zapalny jest skomplikowanym procesem in vivo, nieinwazyjne metody obrazowania specyficzne dla różnych faz zapalenia pozwoliłyby na ilościową i podłużną ocenę modeli choroby. Korzystając z badań mechanistycznych, wykazaliśmy wcześniej stosowanie dwóch środków chemiluminescencyjnych, luminolu (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodionu) i lucygeniny (azotanu bis-N-metyloakrydyny), do nieinwazyjnego obrazowania odpowiednio ostrych i późnych (przewlekłych) stadiów zapalenia 17. Luminol umożliwia wizualizację aktywności MPO neutrofili w ostrej fazie zapalenia 18-20, podczas gdy bioluminescencja lucygeniny może być wykorzystana do oceny aktywności makrofagów w związku z późną fazą lub przewlekłym stanem zapalnym 17. W tym manuskrypcie użyliśmy dwóch eksperymentalnych modeli zapalenia (s.c. PMA i s.c. LPS), aby zademonstrować te techniki obrazowania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi i wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Odczynniki i roztwory
- Roztwór PMA do inokulacji s.c.: Przygotować roztwór podstawowy 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) w stężeniu 5 mg/ml w DMSO. Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze -20 °C. Przed inokulacją rozmrozić roztwór podstawowy i rozcieńczyć do 1 mg/ml PMA w PBS.
- Roztwór LPS do inokulacji s.c.: Rozpuścić lipopolisacharyd (LPS z serotypu enterica Salmonella enterica) w sterylnym PBS w dawce 1 mg/ml przed inokulacją s.c.
- Roztwór luminolu do obrazowania ostrej fazy: Rozpuścić luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodion, sól sodowa) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl) w stężeniu 10 mg/ml. Przed użyciem roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Roztwór lucygeniny do obrazowania w fazie przewlekłej: Rozpuścić lucygeninę (azotan bis-N-metyloakrydyny) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej o stężeniu 2,5 mg/ml. Przed użyciem roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Podskórny model zapalenia PMA
- Znieczulenie nagich myszy NCr w komorze indukcyjnej z 1-2% izofluranem. Potwierdź znieczulenie ogólne utratą ruchu i stałą częstością oddechów. Przenieś zwierzę do stożka nosowego zasilanego gazem zmieszanym z izofluranem i utrzymuj zwierzę w narkozie.
- Za pomocą chusteczki nasączonej alkoholem izopropylowym należy oczyścić i zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia na lewym boku.
- Stosując technikę sterylną, wstrzyknąć 50 μl roztworu do inokulacji PMA (zawierającego 50 μg PMA) w przestrzeń podskórną na lewym boku. Usunąć nadmiar płynu z miejsca wstrzyknięcia za pomocą wacika nasączonego alkoholem izopropylowym. Unikaj stosowania środka przeciwbólowego, ponieważ może on wpływać na reakcje zapalne.
- Przenieś zwierzę z powrotem do klatki i ściśle monitoruj jego powrót do zdrowia po znieczuleniu. Aby pomóc w powrocie do zdrowia, użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać zwierzę w cieple.
3. Podskórny model zapalenia LPS
- Znieczulenie myszy C57BL/6J 1-2% izofluranem w komorze indukcyjnej. Po ustaleniu znieczulenia ogólnego przenieś zwierzę do stożka nosowego zasilanego gazem izofluranowym i utrzymuj zwierzę w znieczuleniu.
- Za pomocą chusteczki nasączonej alkoholem izopropylowym oczyścić miejsce wstrzyknięcia na lewym podnóżku.
- Stosując sterylną technikę, wstrzyknąć 50 μl roztworu do inokulacji LPS (zawierającego 50 μg LPS) w lewą poduszkę stopy. Usunąć nadmiar płynu z miejsca wstrzyknięcia za pomocą wacika nasączonego alkoholem izopropylowym. Unikaj stosowania środka przeciwbólowego, ponieważ może on wpływać na reakcje zapalne.
- Przenieś zwierzę z powrotem do klatki i ściśle monitoruj jego powrót do zdrowia po znieczuleniu. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać zwierzę w cieple podczas rekonwalescencji.
4. Obrazowanie bioluminescencyjne stanu zapalnego
- Znieczulić zwierzę w komorze indukcyjnej z 1-2% gazem zmieszanym z izofluranem. Potwierdź znieczulenie ogólne utratą ruchu i stałą częstością oddechów.
- Gdy zwierzę jest jeszcze pod narkozą, dootrzewnowo (i.p.) wstrzyknąć roztwór luminolu (10 mg / ml) lub roztwór lucygeniny (2,5 mg / ml) odpowiednio do obrazowania ostrego lub przewlekłego stanu zapalnego. Ostateczna dawka wynosi 100 mg/kg dla luminolu i 25 mg/kg dla lucigeniny. Można zastosować niższą dawkę lucygeniny (10-15 mg / kg), aby uniknąć możliwej toksyczności dla niektórych szczepów myszy. Objawy zatrucia obejmują duszność i niewydolność oddechową. Szczep C57BL/6J ma niższą tolerancję lucygeniny niż szczep NCr nude.
- Przenieś zwierzę do komory obrazowania systemu obrazowania bioluminescencyjnego.
- Wykonuj sekwencyjne obrazowanie bioluminescencyjne w odstępach 1-minutowych. Każdy etap obrazowania składa się z 1 minuty czasu akwizycji, przysłony / stop = 1, binningu = 16 i 0 sekund opóźnienia.
- W panelu akwizycji obrazu, aby włączyć sekwencyjne obrazowanie wieloetapowe, kliknij przycisk ustawień sekwencji. Zapewnij wystarczającą liczbę kroków obrazowania w profilu akwizycji, aby określić maksymalną moc wyjściową luminescencji (zwykle wystarczy 15 jednominutowych kroków). 15-minutowa sekcja obrazowania zapewnia wystarczający czas na wchłonięcie substratu i krążenie ogólnoustrojowe.
- Wyjąć zwierzę z komory obrazowania i przenieść je z powrotem do klatki w pomieszczeniu. Aby pomóc w powrocie do zdrowia, użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać zwierzę w cieple.
- Podczas analizy po akwizycji należy użyć pakietu oprogramowania do obrazowania, aby obliczyć szczytowy całkowity sygnał bioluminescencyjny za pomocą standaryzowanych obszarów zainteresowania (ROI). Obrazy są obecne jako promieniowanie w fotonach/s/cm2/sr ze wskazanym progiem minimalnym i maksymalnym. Dane ilościowe są prezentowane jako całkowity strumień w fotonach na sekundę na ROI.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przeprowadziliśmy podłużne obrazowanie bioluminescencyjne w celu oceny stanu zapalnego w fazie ostrej i przewlekłej w eksperymentalnych modelach zapalenia. Mirystanian fosforanu forbolu (PMA) jest silnym agonistą kinazy białkowej C (PKC), który aktywuje kompleks Phox do produkcji anionu ponadtlenkowego i wywołuje intensywne ostre reakcje zapalne 21. Podskórny zastrzyk 50 mg PMA u myszy nago NCr spowodował szybkie podrażnienie skóry i ostry stan zapalny w miejscach wstrzyknięcia 18, 22, 23. Obrazowan...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym raporcie przedstawiono metodę bioluminescencji do nieinwazyjnego obrazowania stanu zapalnego u żywych zwierząt. Wykorzystując dwa podłoża luminescencyjne, luminol i lucygeninę, metoda może rozróżnić różne fazy zapalenia. Bioluminescencja luminolu jest związana z neutrofilami w ostrej fazie zapalenia, podczas gdy bioluminescencja lucygeniny jest pośredniczona przez makrofagi w fazie przewlekłej. Stosunkowo mały (M.W. = 177,16 g/mol) i elektrycznie nienaładowany, luminol może łatwo przenikać zarówno przez plaz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów w tym badaniu.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Fundację Nancy Lurie Marks. Dziękujemy dr Nancy E. Kohl za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy Kin K. Wongowi za pomoc w przygotowaniu tego reportażu wideo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolisacharyd z Salmonella enterica serotyp enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazynodion, sól sodowa) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucygenina (azotan bis-N-metyloakrydyniowy) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| System obrazowania IVIS Spectrum z pakietem oprogramowania Living Imaging 4.2 | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA& | nbsp; |
Bibliografia
- Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
- Singer, A. J., Clark, R. A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. Inflammation, stress, and diabetes. J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).
- Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
- Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
- Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
- Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
- Harlan, J. M. Leukocyte-endothelial interactions. Blood. 65, 513-525 (1985).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
- Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
- Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
- Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
- Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
- Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
- Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
- Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
- Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
- Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
- Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
- Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
- Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
- Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
- Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
- Dahlgren, C., Karlsson, A. Respiratory burst in human neutrophils. J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).
- Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
- Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
