Multipleksowana mikromacierz fluorescencyjna do analizy ludzkich białek śliny przy użyciu mikrosfer polimerowych i wiązek światłowodowych

Summary

Opisujemy procedurę profilowania białek śliny za pomocą multipleksowanych układów przeciwciał opartych na mikrosferach. Przeciwciała monoklonalne zostały kowalencyjnie połączone z mikrosferami polimerowymi o wielkości 4,5 μm kodowanymi barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu chemii karmodiimidu. Zmodyfikowane mikrosfery zdeponowano w mikrostudzienkach światłowodowych w celu zmierzenia poziomu białka w ślinie za pomocą fluorescencyjnych testów immunologicznych typu sandwich.

Abstract

Tutaj opisujemy protokół jednoczesnego pomiaru sześciu białek w ślinie za pomocą światłowodowego układu przeciwciał opartych na mikrosferach. Zastosowana technologia immuno-array łączy w sobie zalety wytwarzania matryc zawiesinowych na bazie mikrosfery z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Jak opisano w protokole wideo, dostępne na rynku mikrosfery polimerowe o wielkości 4,5 μm zostały zakodowane w siedmiu różnych typach, różniących się stężeniem dwóch barwników fluorescencyjnych fizycznie uwięzionych wewnątrz mikrosfer. Zakodowane mikrosfery zawierające powierzchniowe grupy karboksylowe zmodyfikowano przeciwciałami wychwytującymi monoklonalne za pomocą chemii sprzężenia EDC/NHS. Aby złożyć mikromacierz białkową, różne typy kodowanych i funkcjonalizowanych mikrosfer zmieszano i losowo zdeponowano w mikrodołkach o wielkości 4,5 μm, które zostały chemicznie wytrawione na bliższym końcu wiązki światłowodowej. Wiązka światłowodowa została wykorzystana zarówno jako nośnik, jak i do obrazowania mikrosfer. Po złożeniu mikromacierz została wykorzystana do wychwycenia białek w supernatance śliny pobranej z kliniki. Wykrycie oparto na teście immunologicznym typu sandwich z użyciem mieszaniny biotynylowanych przeciwciał detekcyjnych dla różnych analitów z sondą fluorescencyjną sprzężoną ze streptawidyną, R-fikoerytryną. Mikromacierz została zobrazowana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w trzech różnych kanałach, dwóch do rejestracji mikrosfery i jednego do sygnału testowego. Mikrofotografie fluorescencyjne zostały następnie zdekodowane i przeanalizowane przy użyciu domowego algorytmu w MATLAB.

Introduction

Od czasu pierwszej mikromacierzy zgłoszonej przez Marka Schenę i współpracowników w połowie lat 90., to potężne narzędzie jest wykorzystywane w wielu dziedzinach badań biologicznych¹. Mikromacierze przeciwciał zdolne do jednoczesnego wykrywania wielu białek w płynach diagnostycznych, takich jak krew, mają ważne zastosowanie w diagnostyce klinicznej i badaniach przesiewowych biomarkerów^2-10. Ślina, zawierająca wiele takich samych analitów jak krew, została uznana za preferowaną alternatywę dla krwi, ponieważ pobieranie śliny jest bezpieczne, nieinwazyjne i może być przeprowadzane przez minimalnie przeszkolony personel medyczny^11-13. Obecnie multipleksowana analiza białek przy użyciu próbek śliny jest ograniczona przez kilka ważnych czynników, w tym niskie stężenie docelowego analitu¹⁴ i szeroki zakres stężeń różnych biomarkerów¹⁵.

Tutaj demonstrujemy analizę sześciu białek: ludzkiego czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), białka 10 indukowanego interferonem gamma (IP-10), interleukiny-8 (IL-8), naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), metallopeptydazy macierzy 9 (MMP-9) i interleukiny-1 beta (IL-1β). Skuteczność metody została wstępnie zweryfikowana przy użyciu roztworów wzorcowych stanowiących rekombinowane białka analitowe i bufor blokujący. Rzeczywiste próbki śliny pobrane od pacjentów z różnymi przewlekłymi chorobami układu oddechowego, a także od zdrowych osób z grupy kontrolnej zostały również przetestowane z zadowalającą wydajnością. Protokół powinien mieć zastosowanie do innych analitów białkowych i innych testów opartych na mikrosferach. Platforma ta oferuje znaczne korzyści w dziedzinie chemii analitycznej, ponieważ umożliwia szybką, dokładną i powtarzalną jednoczesną analizę niskich stężeń kilku białek o szerokim zakresie dynamiki, minimalnych interakcjach niespecyficznych, zmniejszonym zużyciu próbki i niskich kosztach w porównaniu z analogicznym testem immunoenzymatycznym (ELISA).

Protocol

Rysunek 1. Przebieg pracy przy stosowaniu światłowodowej matrycy przeciwciał mikrosferycznych do profilowania śliny. (1) Mikrosfery są wewnętrznie kodowane dwoma barwnikami fluorescencyjnymi; (2) kodowane mikrosfery są zewnętrznie modyfikowane przeciwciałami monoklonalnymi specyficznymi dla białka; (3) multipleksowane mikrosfery są mieszane i (4) losowo osadzane w mikrostudzienkach wytrawionych na bliższym końcu wiązki światłowodowej; (5) białka śliny są wychwytywane przez mikrosfery za pomocą testu immunologicznego typu sandwich i (6) oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

1. Kodowanie mikrosfer

1. Zważyć trójwodny tenoilotrifluoroacetonian sodu europu (III) (Eu-TTA, MW = 869,54 g/mol) w fiolce ze szkła bursztynowego i przygotować 200 mM roztwór podstawowy w tetrahydrofuranie (THF). Delikatnie wymieszać pipetując; Sprawdź wzrokowo, czy barwnik jest całkowicie rozpuszczony.
2. Zważyć kumarynę 30 (C30, MW = 347,41 g/mol) w fiolce ze szkła bursztynowego i przygotować 12 mM roztwór podstawowy w THF. Delikatnie wymieszać pipetując; Sprawdź wzrokowo, czy barwnik jest całkowicie rozpuszczony.
3. Przygotować 700 μl roztworu roboczego dla każdego typu mikrosfery, używając roztworów podstawowych i THF do osiągnięcia końcowego stężenia wymienionego w tabeli 1.
4. Upewnij się, że mikrosfery (10% w/v) są dobrze zawieszone przez wirowanie, a następnie przenieś 60 μl zawiesiny do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
5. Dodać 600 μl PBS do zawiesiny mikrosfery i mieszać pipetując 20x. Odwirować probówkę z prędkością 10 000 obr./min przez 3 minuty i ostrożnie usunąć supernatant. Powtórz ten proces kolejne 2 razy, aby umyć mikrosfery.
6. Umyj granulkę mikrosfery 3x THF, stosując podobną procedurę jak w kroku 1.5.
7. Odwirować zawiesinę mikrosfery/THF z prędkością 10 000 obr./min przez 3 minuty, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w roztworze roboczym o stężeniu 600 μl wymienionym w tabeli 1. Przenieść mieszaninę do nowej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
8. Uszczelnij probówkę mikrowirówki Parafilmem i umieść ją na shakerze. Wstrząsnąć z prędkością 3 000 obr./min i inkubować przez 24 godziny, chronić przed światłem, przykrywając zestaw pudełkiem pokrytym folią aluminiową.
9. Odwiruj zawiesinę mikrosfery z prędkością 10 000 obr./min przez 3 minuty, aby uzyskać granulkę.
10. Usunąć sklarowany nad osadem roztwór barwnika, przemyć mikrosfery 6x 600 μl metanolu, a następnie 600 μl PBS zawierającego 0,01% Tween-20 kolejne 6x, jak opisano w kroku 1.5.
11. Zakodowane mikrosfery należy przechowywać w 600 μl PBS zawierającym 0,01% Tween-20 w temperaturze 4 °C do momentu użycia, chronić przed światłem.

Nazwa typu mikrosfery: 1 cyfra arabska 3 4 5 6 7 Eu-TTA (mM) 100 szt. 100 szt. 10 100 szt. 10 Prąd C30 (mM) 1 1 6 6 1 6

Tabela 1. Stężenia roztworów roboczych Eu-TTA i C30.

2. Przygotowanie mikrosfer wychwytujących białka

1. Należy przygotować bufor MES [kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, SDS 0,01%, pH 5,7] i bufor PBS/SDS (fosforan sodu 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS 0,01%, pH 7,4) w temperaturze pokojowej.
2. Dodać 200 μl kodowanej zawiesiny mikrosfery (zawierającej ~2 mg mikrosfery) do probówki do mikrowirówki Safe-Lock o pojemności 1,5 ml. Ważne jest, aby używać tego typu probówki do mikrowirówki, aby uniknąć rozlania podczas inkubacji w kroku 2.6.
3. Przemyć mikrosfery 600 μl buforem MES 3x, jak opisano w kroku 1.5. Dodać 700 μl MES do mikrokulki i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
4. Przygotować 0,105 g/ml roztworów chlorowodorku 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karmodiimidu (EDC, MW = 191,7 g/mol) i 0,163 g/ml roztworu sulfo-N-hydroksysulfosukcynimidu (sulfo-NHS, MW = 217,13 g/mol) w buforze MES w oddzielnych probówkach.
5. Dodawać 150 μl świeżo przygotowanego roztworu EDC kropla po kropli do zawiesiny mikrosferycznej. EDC hydrolizuje bardzo szybko, dlatego ważne jest, aby używać świeżo przygotowanego roztworu, aby zapewnić skuteczność unieruchomienia. Natychmiast po dodaniu EDC dodać 150 μl roztworu sulfo-NHS do mikrosfer, dobrze wymieszać pipetując i sprawdzić, czy zawiesina jest jednorodna.
6. Zakryj tubę, uszczelnij ją Parafilmem i umieść na shakerze. Wstrząsać z prędkością 1 500 obr./min przez 4 godziny, chronić przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.
7. Odwirować zawiesinę mikrosfery z prędkością 10 000 obr./min przez 3 minuty, aby utworzyć osad i usunąć supernatant. Przemyć mikrosfery 500 μl buforem PBS/SDS 3x, jak opisano w kroku 1.5.
8. Dodać 200 μl buforu PBS/SDS do osadu, dobrze wymieszać mikrosfery i przenieść roztwór do 300 μl buforu PBS/SDS zawierającego 60 μg przeciwciał wychwytujących. Ważne jest, aby najpierw zawiesić osad mikrosfery, a następnie dodać zawiesinę mikrosfery do roztworu przeciwciała.
9. Mieszaninę przeciwciało-mikrosfery inkubować wytrząsając z prędkością 1 500 obr./min przez 4 godziny na shakerze, chronić przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.
10. Odwirować zawiesinę mikrosfery z prędkością 10 000 obr./min przez 3 minuty, aby utworzyć osad i usunąć supernatant. Przemyć mikrosfery buforem blokującym StartingBlock (TBS) o pojemności 500 μl 3x, zgodnie z opisem w kroku 1.5.
11. Wymieszać mikrosfery z 1 ml buforu blokującego TBS i inkubować mikrosfery z prędkością 1 500 obr./min przez 1 godzinę na shakerze, chronić przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.
12. Odwirować zawiesinę mikrosferyczną z prędkością 7 000 obr./min przez 3 minuty, aby utworzyć osad i usunąć supernatant. Przemyj osad 3x buforem blokującym TBS o pojemności 500 μl, zgodnie z opisem w kroku 1.5.
13. Odwirować roztwór mikrosfery z prędkością 7 000 obr./min przez 3 minuty, aby utworzyć osad i usunąć supernatant. Dodać 500 μl buforu blokującego TBS i wymieszać pipetując.
14. Zmodyfikowaną zawiesinę mikrosferyczną należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia, chronić przed światłem.
15. Powtórz tę procedurę, aby wytworzyć inne typy mikrosfer przy użyciu odpowiednich przeciwciał.

3. Montaż mikromacierzy światłowodowej

1. Wymieszaj 50 μl każdego rodzaju mikrosfer wychwytujących białka w nowej autoklawizowanej probówce do mikrowirówki. Odwirować pulę podstawowych mikrosfer z prędkością 7 000 obr./min przez 3 minuty i usunąć supernatant tak, aby pozostała objętość wynosiła około 100 μl.
2. Ręcznie przycinaj wiązki światłowodów do długości około 5 cm i sekwencyjnie poleruj oba końce na maszynie do polerowania za pomocą diamentowych folii docierających o wielkości 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 i 0,05 μm. Sonikuj wypolerowany pakiet w wodzie dejonizowanej przez 2 minuty, aby usunąć wszelkie cząstki.
3. Umieść małe mieszadło magnetyczne w probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml, dodaj 400 μl bezbiałkowego buforu PBS i mieszaj na magnetycznej płytce mieszającej przez 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
4. Wytrawić jeden koniec wiązki polerowanych włókien w roztworze 0,025 N HCl przez 150 sekund^10,16. Natychmiast zanurz i poddaj sonifikacji wytrawiony koniec w wodzie dejonizowanej na 1 minutę. Wysuszyć wiązki włókien sprężonym powietrzem.
5. Zamontuj wiązkę włókien na uchwycie światłowodowym i zablokuj wytrawiony koniec w pozbawionym pęcherzyków, wolnym od białka buforze PBS na 1 godzinę.
6. Umieść 1 μl podwielokrotności przechowywanego zawiesiny mikrosfery na wytrawionym końcu wiązki światłowodowej. Chroń zestaw przed światłem za pomocą pudełka z folią aluminiową i odczekaj 15 minut. Objętość zawiesiny zmniejszy się w wyniku odparowania i wepchnie mikrosfery do wytrawionych mikrostudzienek. Powtórz ten krok ładowania jeszcze raz.
7. Użyj wacika nasączonego roztworem próbki, aby usunąć mikrosfery, które nie są uwięzione w mikrostudzienkach. Mikromacierz białkowa jest teraz gotowa do użycia. Przejdź natychmiast do kroku 4.1 w celu analizy śliny.

4. Analiza próbki śliny za pomocą mikrosfery Mikromacierz

1. Dodać 200 μl roztworu próbki (100 μl supernatantu ze śliny rozcieńczonego równą objętością buforu blokującego StartingBlock T20 (PBS). Protokół pobierania supernatantu śliny został opublikowany wcześniej¹⁰). do autoklawizowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml. Zanurz mikromacierz białkową załadowaną na włókno do roztworu i inkubuj na wytrząsarce z prędkością 600 obr./min przez 2 godziny, chronić przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.
2. Przygotować 20 ml buforu do przemywania przez dodanie 200 μl 10% roztworu BSA i 200 μl 10% Tween-20 do 19,6 ml PBS, dobrze wymieszać, delikatnie wstrząsając.
3. Zanurz mikromacierz białkową w nowej autoklalawowanej probówce do mikrowirówek zawierającej 200 μl buforu do przemywania i wstrząsaj z prędkością 600 obr./min przez 2 min. Powtórz to płukanie 3 razy.
4. Inkubować mikromacierz w 100 μl roztworze koktajlu przeciwciał detekcyjnych zawierającego 5 μg/ml biotynylowanych przeciwciał detekcyjnych anty-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, IL-1β w buforze blokującym StartingBlock T20 (PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przy 600 obr./min, chronić przed światłem za pomocą pudełka pokrytego folią aluminiową.
5. Umyj mikromacierz 3x buforem myjącym, jak opisano w kroku 4.3.
6. Inkubować mikromacierz w 200 μl roztworu sprzężonego 20 μg/ml streptawidyny R-fikoerytryny (SAPE) w PBS z prędkością 600 obr./min na wytrząsarce przez 10 minut, chronić przed światłem w pudełku pokrytym folią aluminiową.
7. Umyj mikromacierz 5x buforem myjącym, jak opisano w kroku 4.3.
8. Oczyść dystalny koniec włókna (tj. koniec z dala od mikrosfer) za pomocą wacika nasączonego absolutnym etanolem.
9. Wysuszyć oba końce włókna sprężonym powietrzem. Zamontuj światłowód na mikroskopie epifluorescencyjnym i zobrazuj przez dystalny koniec światłowodu.
10. Pozyskiwanie obrazów mikrosfer odpowiadających intensywności emisji fluorescencji Eu-TTA, C30 i SAPE. Konfigurację filtrów optycznych i czasy naświetlania do obrazowania fluorescencyjnego Eu-TTA, C30 i SAPE przedstawiono w tabeli 2.

kanał Umowa Eu-TTA Zobacz materiał C30 SAPE (Język Maszynowy Impulsowe 365/10x 350/50x 546/10x Rozdzielacz wiązki Zobacz materiał 525DCLP 400DCLP 560 LP emiter 620/60m 460/50 m 580/30 m Czas naświetlania 1 sekund 0,3 sekundy 1 sekund

Tabela 2. Parametry dla trzech obrazów fluorescencyjnych mikromacierzy.

Results

Obrazy fluorescencyjne z trzech kanałów, pokazujące mały wycinek wiązki światłowodów, są pokazane na rysunkach 2A-C. Obrazy te zostały przeanalizowane przy użyciu algorytmu napisanego w MATLAB (opisanego bardziej szczegółowo w sekcji Dyskusja). W analizie wykorzystano zarówno informacje z obrazu kodującego Eu-TTA (rysunek 2A), jak i obrazu kodującego C30 (rysunek 2B) do dekodowania mikrosfer, a także obliczono intensywności fluorescencji różnych mikrosfer w obrazie sygna...

Discussion

Badacze powinni zwrócić szczególną uwagę na następujące kroki: Aby uzyskać lepszą dokładność dekodowania, konieczne jest sprawdzenie, czy mikrosfery były jednorodnie zawieszone na wszystkich etapach inkubacji i płukania podczas procedury kodowania mikrosfer. Ponadto zakodowane mikrosfery muszą być chronione przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu. Po zastosowaniu odpowiednich procedur kodowania i przechowywania stwierdziliśmy, że ogólna dokładność dekodowania wynosiła ponad 99%. Zakodowane mikrosfery należy p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Barwnik Eu-TTA	Fisher Scientific	AC42319-0010
THF	Sigma-Aldrich	34865-100ML
Fiolka ze szkła bursztynowego	Fisher Scientific	03-339-23B
Kumaryna 30 barwnik	Sigma-Aldrich	546127-100MG
Mikrosfery	Bangslabs	PC05N/6698
1,5 ml probówki do mikrowirówek	Fisher Scientific	05-408-129
PBS 10x koncentrat	Sigma-Aldrich	P5493-1L
Woda	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Metanol	Sigma-Aldrich	34860-100ML
Tw-20	Sigma-Aldrich	P7949-100 ml
BupH MES buforowana sól fizjologiczna	Thermo Scientific	28390
SDS	Sigma-Aldrich	05030-500ML-F
Roztwór NaOH	Fisher Scientific	SS256-500
Probówka mikrowirówkowa z bezpiecznym zamkiem	VWR labshop	53511-997
EDC	Thermo Scientific	22980
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510
Ludzkie przeciwciało wychwytujące VEGF	R& D Systems	MAB293
Ludzkie przeciwciało wychwytujące IP-10	R& D Systems	MAB266
Ludzkie przeciwciało wychwytujące IL-8	R& D Systems	MAB208
Ludzkie przeciwciało wychwytujące EGF	R& D Systems	MAB636
Ludzkie przeciwciało wychwytujące MMP-9	R& D Systems	MAB936
Ludzka IL-1 i beta wychwytywanie przeciwciał	R& D Systems	MAB601
Mysz IgG1 przeciwciało kontrolujące izotyp	R& D Systems	MAB002
Bufor StartingBlock (TBS)	Thermo Scientific	37542
Roztwór wzorcowy HCl 1,0 N	Sigma-Aldrich	318949-500 ml
0,5 ml probówki mikrowirówkowe	Fisher Scientific	05-408-120
Bufor bez białka (PBS)	Thermo Scientific	37572
Rekombinowany ludzki VEGF 165	R& D Systems	293-VE
Rekombinowany ludzki IP-10	R& D Systems	266-IP
Rekombinowana ludzka IL-8	R& D Systems	208-IL
Rekombinowany ludzki EGF	R& D Systems	236-EG
Rekombinowany ludzki MMP-9	R& D Systems	911-MP
Rekombinowana ludzka IL-1β	R& D Systems	201-LB
Bufor StartingBlock T20 (PBS)	Thermo Scientific	37539
Bloker BSA w PBS	Thermo Scientific	37525
Biotynylowane przeciwciało wykrywające VEGF	R& D Systems	BAF293
Biotynylowane przeciwciało wykrywające IP-10	R& D Systems	BAF266
Biotynylowane przeciwciało wykrywające IL-8	R& D Systems	BAF208
Biotynylowane przeciwciało wykrywające EGF	R& D Systems	BAF236
Biotynylowane przeciwciało wykrywające MMP-9	R& D Systems	BAF911
Biotynylowane przeciwciało detekcyjne IL-1 i beta	R& D Systems	BAF201
Streptawidyna, R-fikoerytryna	Invitrogen	S-21388
Etanol (200 dowodów)	Sigma-Aldrich	E7023-500ML