Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Stratyfikowane kultura neuronów według płci w celu zbadania szlaków śmierci komórek niedokrwiennych

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/50758

⸱

9 grudnia 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Colorado School of Medicine, 2Oregon National Primate Research Center, Oregon Health & Science University, 3Department of Pharmacology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pierwotne odłączone embrionalne kultury neuronów hipokampa są przydatne do badania mechanizmów sygnalizacyjnych związanych ze śmiercią neuronów. Określenie płci zarodków przed izolacją i dysocjacją hipokampa pozwala na przygotowanie oddzielnych kultur męskich i żeńskich, co umożliwia badaczowi zidentyfikowanie i zbadanie sygnalizacji komórkowej specyficznej dla płci.

Streszczenie

Od dawna obserwowane są różnice płci w podatności neuronów na uszkodzenia niedokrwienne i choroby neurodegeneracyjne, ale mechanizmy sygnalizacyjne odpowiedzialne za te różnice pozostają niejasne. Pierwotna, odłączona hodowla neuronów embrionalnych zapewnia uproszczony model eksperymentalny, za pomocą którego można badać sygnalizację komórek neuronalnych zaangażowanych w śmierć komórki w wyniku niedokrwienia lub choroby; Jednak większość kultur neuronalnych stosowanych obecnie w badaniach jest płci mieszanej. Naukowcy mogą testować i testują efekty leczenia steroidami płciowymi w mieszanych kulturach neuronalnych płci w modelach uszkodzeń neuronów i chorób, ale coraz więcej dowodów sugeruje, że mózg kobiety reaguje na androgeny, estrogeny i progesteron inaczej niż mózg mężczyzny. Co więcej, nowonarodzone samce i samice gryzoni inaczej reagują na uraz niedokrwienny, przy czym samce doświadczają większych obrażeń po niedokrwieniu mózgu niż samice. W związku z tym mieszane płciowo hodowle neuronów mogą zaciemniać i zaciemniać wyniki eksperymentalne; Ważne informacje mogą zostać pominięte. Z tego powodu Herson Lab na University of Colorado School of Medicine rutynowo przygotowuje stratyfikowane płciowo pierwotne odłączone embrionalne kultury neuronalne zarówno z hipokampa, jak i kory mózgowej. Zarodki są określane pod względem płci przed pobraniem tkanki mózgowej, a tkanki męskie i żeńskie są oddzielane oddzielnie, powlekane oddzielnie i utrzymywane oddzielnie. Korzystając z tej metody, Herson Lab wykazało specyficzną dla mężczyzn rolę kanału jonowego TRPM2 w niedokrwiennej śmierci komórki. W tym manuskrypcie dzielimy się i omawiamy nasz protokół określania płci myszy embrionalnych i przygotowywania stratyfikowanych płciowo pierwotnych kultur neuronów hipokampa. Metoda ta może być dostosowana do przygotowania kultur korowych z warstwą płciową, a metoda określania płci zarodków może być stosowana w połączeniu z innymi protokołami w każdym badaniu, w którym uważa się, że płeć jest ważnym wyznacznikiem wyniku.

Wprowadzenie

Ssaki są dymorficzne płciowo, a samce i samice wykazują różne cechy i cechy. Różnice między płciami rozciągają się nawet na mózg i są widoczne w podatności neuronów na urazy i choroby (omówione w1-5). Na przykład męski mózg jest bardziej podatny na niedokrwienne uszkodzenie neuronów w wyniku udaru lub zatrzymania akcji serca, po którym następuje resuscytacja (przegląd w6). Choroba Parkinsona (omówiona w7) i schizofrenia (omówiona w8) występują częściej u mężczyzn niż u kobiet, podczas gdy mózg kobiety wydaje się bardziej podatny na chorobę Alzheimera (oceniony w9) i zaburzenia nastroju, takie jak depresja (oceniony w10). Pomimo zauważalnych różnic między płciami w podatności na uszkodzenia neuronów i choroby, większość obecnych paradygmatów leczenia nie uwzględnia płci i jest podobna zarówno u mężczyzn, jak i kobiet. Większy sukces można by osiągnąć, gdyby różnice między płciami zostały uwzględnione i zrozumiane.

Modele zwierzęce in vivo uszkodzeń i chorób neuronalnych wykazują dymorfizm płciowy podobny do ludzkiego i są kluczowe dla lepszego zrozumienia różnic płciowych i tego, jak te różnice przyczyniają się do przetrwania i funkcjonowania neuronów. Dowody wykazały na przykład, że samce gryzoni są bardziej podatne niż samice na niedokrwienne uszkodzenie neuronów11-15. Uważa się, że różnica ta jest przynajmniej częściowo zależna od sygnalizacji molekularnej testosteronu, głównego męskiego hormonu steroidowego płci i estrogenu, głównego żeńskiego hormonu steroidowego płci. Badania na samcach i samicach gryzoni po zgonektomii ujawniają, że testosteron i metabolit testosteronu, dihydrotestosteron (DHT) nasilają się, a estrogen zmniejsza uszkodzenia neuronów po niedokrwieniu mózgu12-14,16-18. Jednak różnice płci w niedokrwieniu mózgu występują zarówno u noworodków, jak i u dorosłych zwierząt19,20. Noworodki doświadczają skoków estrogenu lub testosteronu w macicy podczas rozwoju, ale mają stosunkowo niski poziom hormonu po urodzeniu do okresu dojrzewania (przegląd w21). Tak więc obecność lub brak pierwotnego hormonu płciowego nie jest jedynym wyznacznikiem podatności neuronów na uszkodzenia pod wpływem płci. Rzeczywiście, jest prawdopodobne, że dymorfizmy płciowe powstają podczas rozwoju, co powoduje różnice w sygnalizacji komórkowej i odpowiedzi na niedokrwienie, nawet gdy poziom hormonów jest niski.

Niezależnie od tego, czy różnice płci są zależne od obecności hormonu płciowego, czy też są spowodowane dymorfizmami powstałymi podczas rozwoju, dzięki dalszym badaniom staje się jasne, że istnieją różnice w sygnalizacji komórkowej między mężczyznami i kobietami w mózgu. W Herson Lab na University of Colorado School of Medicine zidentyfikowaliśmy jedną z takich różnic. Odkryliśmy, że przepuszczalny dla wapnia, sodu i potasu kanał jonowy, TRPM2 (oceniony w22,23), indukuje śmierć komórek neuronalnych po niedokrwiennym uszkodzeniu in vivo u samca, ale nie samicy myszy24. Wykazaliśmy, że farmakologiczne hamowanie lub genetyczne knockdown TRPM2 działa ochronnie u samca, ale nie u samicy myszy w naszym modelu niedrożności tętnicy szyjnej środkowej (MCAO) in vivo udaru24.

Pomimo swojej użyteczności, zwierzęce modele niedokrwiennego uszkodzenia neuronów in vivo mogą czasami być ograniczone do badań molekularnych nad śmiercią neuronów, ze względu na trudność lub niemożność specyficznego namierzenia neuronów do badań. Z tego powodu nasze laboratorium wykorzystuje pierwotne odłączone neurony korowe lub hipokampa in vitro, aby uzupełnić naszą pracę in vivo. Pierwotne rozłączone hodowle neuronów stanowią użyteczne narzędzie do badania szlaków sygnalizacji komórkowej zaangażowanych w uszkodzenia i choroby neuronów. Neurony w kulturze mogą być utrzymywane w ściśle kontrolowanym środowisku, z lub bez danych glejowych. W przypadku braku gleju wszelkie reakcje obserwowane w kulturze są neuronalne. Środki farmakologiczne mogą być podawane do hodowli bez obaw o wchłanianie przez barierę krew-mózg, co pozwala na zahamowanie lub aktywację określonych składników danego szlaku transdukcji sygnału. Biologia molekularna może być wykorzystana do nadekspresji lub knockdown różnych białek będących przedmiotem zainteresowania, a pomiary elektrofizjologiczne mogą być przeprowadzane na pojedynczych komórkach, co nie byłoby możliwe w systemie modelowym in vivo.

Laboratorium Hersona rozszerza użyteczność pierwotnych oddzielonych kultur neuronalnych, najpierw określając płeć embrionów użytych do przygotowania kultur. Kultura neuronów stratyfikowanych płciowo u mężczyzn i samic wyraźnie pokazuje, że neurony męskie są bardziej podatne niż neurony żeńskie na śmierć komórek neuronalnych w wyniku niedoboru tlenu i glukozy25. Niedobór tlenu i glukozy jest akceptowanym modelem niedokrwienia neuronów in vitro, ponieważ niedokrwienie zmniejsza dostępność tlenu i glukozy do mózgu. Ponadto wykazaliśmy w eksperymentach elektrofizjologicznych na oddzielonych, stratyfikowanych płciowo neuronach, że TRPM2 jest aktywowany w neuronach męskich, ale nie żeńskich24,26. Obecnie badamy molekularne specyficzne dla płci regulatory aktywności TRPM224,26. Tutaj dzielimy się i omawiamy nasz protokół ustanawiania stratyfikowanych płciowo pierwotnych embrionalnych rozłączonych kultur neuronów hipokampa i przedstawiamy reprezentatywne dane przy użyciu tej metody, które sugerują, że enzym naprawy DNA, PARP-1, przyczynia się do śmierci niedokrwiennej komórki w sposób specyficzny dla płci, podobny do TRPM2. PARP-1 jest aktywowany przez pęknięcie DNA spowodowane stresem oksydacyjnym (przegląd w27,28). Gdy uszkodzenie DNA jest minimalne, aktywność PARP-1 zwiększa przeżycie komórek, ale gdy uszkodzenie jest nadmierne, zwiększona aktywność PARP-1 nasila śmierć komórki. PARP-1 wytwarza poli-(ADP)rybozę, znany aktywator kanałuTRPM2 28-31, a niektóre dowody sugerują, że PARP-1 jest aktywowany preferencyjnie w mózgu mężczyzny, ale nie kobiety w odpowiedzi na stres oksydacyjny32,33. W związku z tym stawiamy hipotezę, że PARP-1 aktywuje TRPM2 u mężczyzny, ale nie u kobiety, indukując śmierć komórek neuronalnych w odpowiedzi na niedobór tlenu i glukozy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącymi etycznego traktowania i opieki nad zwierzętami oraz zgodnie z zatwierdzonym protokołem wykorzystania zwierząt przez IACUC.

1. Przygotowanie naczyń do hodowli tkankowych, pożywek hodowlanych i narzędzi do preparacji co najmniej jeden dzień przed sekcją

  1. Przygotować 1 l buforu boranowego: 3,1 g/l kwasu borowego i 4,75 g/l boraksu w podwójnie destylowanymH2O. Dostosować pH do 8,4. Sterylizować filtrem i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  2. Rozcieńczyć poli-D-lizynę do 0,1 mg/ml.
    1. Pod kapturem do hodowli tkanek z przepływem laminarnym umieść wystarczającą ilość rozcieńczonej poli-D-lizyny, aby obficie pokryć dno każdej studzienki wielodołkowej, poddanej hodowli, sterylnej płytki do hodowli tkankowej. (W razie potrzeby na dno każdej studzienki można dodać wstępnie oczyszczone, sterylne szkiełka ze szklaną pokrywą przed dodaniem poli-D-lizyny. Szkiełka nakrywkowe mogą unosić się na wodzie po dodaniu poli-D-lizyny, dlatego w razie potrzeby należy je docisnąć sterylnymi kleszkami.)
    2. Inkubować płytki przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  3. Przygotować 1 l buforu rozwarstwiającego: 350 mg/L NaHCO3, 2,38 g/L HEPES, 1,44 g/LMgSO4 i 300 mg/L BSA w 1x Hanks Zrównoważony roztwór soli bez Ca, Mg, pirogronianu sodu lub czerwieni fenolowej. Dostosuj pH do 7,3. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
  4. Przygotuj 500 ml pożywki galwanicznej: 10% płodowej surowicy bydlęcej, po 100 jednostek/ml penicyliny i streptomycyny oraz 2,5 mM glutaminy w MEM bez czerwieni fenolowej. Filtruj - sterylizuj. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. Wyrzuć niewykorzystane podłoże po 1 miesiącu.
  5. Przygotuj 500 ml pożywki: 2% suplementu B-27, po 100 jednostek/ml penicyliny i streptomycyny oraz 2,0 mM GlutaMAX (nie glutaminy) w Neurobasel bez czerwieni fenolowej. Filtruj - sterylizuj. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna. Wyrzuć pozostałą pożywkę po 1 miesiącu.
  6. Przygotować 10 ml 100 mM CaCl2, 500 mM EDTA i 1 M NaOH w zależności od potrzeb zgodnie ze standardowymi metodami.
  7. Narzędzia chirurgiczne/preparacyjne należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w sterylnych warunkach do czasu, gdy będą potrzebne. Ta procedura wymaga dwóch ostrych, bardzo cienkich szczypiec kątowych, zakrzywionych kleszczy z cienką końcówką, ząbkowanych zakrzywionych kleszczy, małych kleszczy z zębami szczura, jednej pary nożyczek mikrochirurgicznych, jednej pary cienkich, wąskich nożyczek chirurgicznych, jednej pary nożyczek ze średnią końcówką i sondy preparcyjnej. Dodatkowe sterylne narzędzia mogą być dodawane zgodnie z osobistymi preferencjami.

2. Przygotowanie naczyń do hodowli tkankowych, pożywek hodowlanych, narzędzi do preparacji i obszaru preparacji, które mają być wykonane w dniu sekcji

  1. Umyć płytki do hodowli tkankowych pokrytych poli-D-lizyną. Pod komorą bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym odessać poli-D-lizynę za pomocą przewodu próżniowego lub pipety, dodać wodę do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez ~ 5 minut. Zassać wodę i zastąpić ją czystą, sterylną wodą. Powtórz 3 razy.
    1. Pozostaw płytki do całkowitego wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotuj obszar sekcji, wycierając licznik i lunetę preparacyjną 70% etanolem.
    1. Nasycić dużą dźwignię Kimwipe 70% etanolem i rozłożyć autoklawowane narzędzia do preparowania. Przykryj kolejną chusteczką Kimwipe.
    2. Napełnij duże, płaskie naczynie lodem. Oznaczyć i napełnić odpowiednią liczbę naczyń hodowlanych o średnicy 60 mm zimnym roztworem preparacyjnym. Przygotuj tyle potraw, aby oddzielić głowy, mózgi i hipokampy od samic (jeśli dotyczy).
    3. Napełnij dwie większe naczynia hodowlane o średnicy 100 mm zimnym buforem do rozwarstwiania.
    4. Odstawić osobne naczynie o średnicy 100 mm bez bufora (suche).
    5. Ustanowienie obszaru dla odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne i drugiego dla tkanek zwierzęcych (do odpowiedniej utylizacji po rozebraniu, zgodnie ze standardami instytucjonalnymi).
  3. Ogrzać 30 ml podłoża galwanicznego w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Ten ciepły roztwór zostanie użyty w fazie dysocjacji komórek w protokole.
  4. Umieścić 1 ml pożywki galwanicznej w każdym dołku 24-dołkowej, pokrytej poli-D-lizyną płytki do hodowli tkankowej. Użyj odpowiednio mniejszej objętości, jeśli używane są mniejsze płyty. Umieścić przykrytą płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 w celu ogrzania i zrównoważenia z CO2 podczas preparacji.
  5. Przygotuj roztwór papainy.
    1. Oznacz dwie sterylne stożkowe probówki o pojemności 15 ml, jedną jako "męską", a drugą jako "żeńskie".
    2. Do każdej probówki dodać następujące ilości: 10 ml buforu do rozwarstwiania, 150 μl 100 mM CaCl2, 10 μl 500 mM EDTA, 10 μl 1 M NaOH i 150 j. papainy.
    3. Delikatnie wymieszać, trzykrotnie odwracając rurkę, a następnie ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Uwaga: Każda fiolka papainy będzie miała inną jednostkę aktywności na mg papainy, dlatego objętość papainy dodanej do roztworu będzie się różnić w zależności od fiolki. Papaina będzie początkowo mętna, ale roztwór zostanie usunięty, gdy papaina całkowicie się rozpuści.

3. Zbieranie, określanie płci i sekcja zarodków E18

  1. Znieczulić ciężarną samicę myszy izofluranem lub innym odpowiednim środkiem znieczulającym. Poddaj mysz eutanazji w głębokim znieczuleniu przez dekapitację lub zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Pracując szybko, oczyść brzuch samicy 70% etanolem. W razie potrzeby brzuch można ogolić przed spryskaniem etanolem, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia. Podnieś skórę brzucha za pomocą kleszczy z zębami szczura. Wykonaj duże nacięcie w jamie brzusznej nożyczkami ze średnią końcówką, przecinając skórę i mięśnie brzucha, odsłaniając narządy wewnętrzne.
  3. Ostrożnie usuń zarodki, unosząc każdy cały róg macicy z dala od brzucha, uważając, aby nie dopuścić do kontaktu z żadną tkanką zewnętrzną, jeśli to możliwe (aby uniknąć zanieczyszczenia). Umieść rogi macicy zawierające zarodki w naczyniu z zimną sekcją soli fizjologicznej i przenieś do lodu.
  4. Ostrożnie usuń każde młode z rogów macicy i woreczka embrionalnego. Szczenięta są delikatne, więc najlepiej zrobić to, przecinając tkankę macicy między każdym zarodkiem, aby odsłonić worek embrionalny, a następnie ostrożnie przecinając worek na powierzchni krawędzią małych, wąskich nożyczek. Płyn embrionalny i młode mogą być następnie delikatnie przepchnięte przez otwór bez uszkodzenia zarodka.
    1. Jeśli nacięcie w woreczku embrionalnym nie jest wystarczająco duże, aby płyn i szczenię łatwo wydostały się na zewnątrz, należy ostrożnie powiększyć nacięcie, aż szczenię wysunie się z minimalną siłą.
    2. Nie ściskaj woreczka zbyt mocno, aby wypchnąć zarodek, ponieważ może to również uszkodzić zarodki.
  5. Usuń głowę z pojedynczego zarodka. Pozostaw głowę w naczyniu z solą fizjologiczną na lodzie. Umieść ciało zarodka na plecach na suchej naczyniu o pojemności 100 mM pod zakresem sekcji. Używając zakrzywionych kleszczy ze średnią końcówką w jednej ręce i ząbkowanych zakrzywionych kleszczy w drugiej, delikatnie spłaszcz szczenię, popychając tylne nogi w dół i brzuszne, przednie nogi w dół i grzbietowe.
  6. W razie potrzeby usuń ogon nożyczkami; ogon ma tendencję do zwijania się na brzuchu i może przeszkadzać w rozwarstwieniu.
  7. Zwolnij tylne nogi i uszczypnij brzuch u nasady pępowiny, zwanej pępkiem. Podnieś się delikatnie. Zwolnij przednie nogi i drugą ręką oraz mikronożyczkami wykonaj małe odwrócone "v" w brzuchu tuż nad pępkiem z punktem "v" skierowanym w stronę czaszki.
  8. Ponownie wymień nożyczki na zakrzywione kleszcze. Odwróć kleszcze tak, aby punkt był podniesiony i oddalony od zwierzęcia. Z delikatną siłą popchnij w dół i grzbietowo klatkę piersiową zamkniętą, zaokrągloną krawędzią zakrzywionych kleszczy, jednocześnie ciągnąc w dół i brzusznie innymi kleszczami, rozkładając szczenię na zewnątrz brzuszne do grzbietowego. Ten ruch rozprzestrzeniający się otworzy jamę brzuszną, odsłaniając jelita, wątrobę i inne narządy wewnętrzne.
  9. Za pomocą zakrzywionych kleszczy bardzo delikatnie popychaj jelita i wątrobę czaszką, wykonując powtarzające się ruchy zamiatania. Spowoduje to stopniowe odsłonięcie nerek, pęcherza moczowego i, co najważniejsze, wewnętrznych narządów płciowych.
    1. Młode samce są identyfikowane na podstawie obecności prążkowanych jąder znajdujących się tuż pod nerkami po każdej stronie. Jądra są w przybliżeniu 1/3-1/2 wielkości nerek i czasami opadają, aby usiąść tuż nad pęcherzem.
    2. Samice są najłatwiej identyfikowane po braku jąder, ale można je również zidentyfikować po małej macicy, która znajduje się nad pęcherzem moczowym, i jajowodach, które rozciągają się w kierunku nerek. Pod wpływem dużej mocy w lunecie preparacyjnym jajniki można również zidentyfikować jako małe, ciemne narządy na końcu jajowodów bezpośrednio pod, a czasem pod nerkami obustronnie.
  10. Po ustaleniu płci wyrzuć ciało i umieść głowę w odpowiednio oznakowanym naczyniu (męskim lub żeńskim). Trzymaj głowy na lodzie w roztworze preparacyjnym.
  11. Powtarzaj kroki 3.5-3.10, aż każde szczenię zostanie płci określone. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wytrzyj naczynie do czysta za pomocą Kimwipe między każdym rozwarstwieniem; Płyn sprawia, że szczenięta są śliskie i trudne do uchwycenia do sekcji.
  12. Po ustaleniu płci wszystkich zarodków i oddzieleniu głów samca i samicy, należy przystąpić do dalszej części sekcji, zwracając szczególną uwagę na to, aby wszystkie tkanki pochodzące od mężczyzn i samic były oddzielone.
  13. Przenieś jeden mózg na raz do naczynia o wielkości 100 mM wypełnionego zimnym buforem preparacyjnym. Pod zakresem sekcji użyj zakrzywionych kleszczy, aby przebić oczy zarodka, aby zakotwiczyć go do sekcji. Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych wykonaj płytkie nacięcie w linii środkowej, dzieląc skórę i czaszkę wzdłuż linii środkowej, od podstawy czaszki do czubka głowy tuż nad przewodem nosowym.
  14. Delikatnie odepchnij skórę i czaszkę obustronnie i bardzo delikatnie wyciągnij mózg, ostrożnie zgarniając go od przodomózgowia w kierunku pnia mózgu podstawą nożyczek mikrochirurgicznych lub zamkniętymi, kątowymi kleszczami.
    1. Ostrożnie użyj kleszczy, aby przenieść wyekstrahowany mózg do czystego, oznakowanego naczynia wypełnionego zimnym buforem preparacyjnym. Trzymaj danie na lodzie.
    2. Powtarzaj ten proces, aż wszystkie mózgi zostaną zebrane.
    3. Ten krok powinien dać dwie płytki z całymi mózgami w buforze rozwarstwiającym, jedną dla tkanki męskiej i jedną dla żeńskiej.
  15. Umieść czyste naczynie pod lunetą preparacyjną i napełnij ją buforem do preparacji. Wlej tylko tyle roztworu, aby mózg był wilgotny przez cały okres rozwarstwiania hipokampa; Zbyt duża ilość spowoduje, że mózg będzie unosił się na wodzie i utrudni obsługę. W razie potrzeby pokryj naczynie do sekcji sterylnym woskiem. Wosk zapewnia antypoślizgową powierzchnię, na której można pracować i chroni końcówki delikatnych narzędzi sekcyjnych; Zarysowanie dna niepowlekanego naczynia może spowodować wygięcie lub stępienie ostrych krawędzi narzędzi.
  16. Zmień lunetę preparacyjną na ustawienie dużej mocy i odpowiednio dostosuj ostrość. Ostrożnie przenoś jeden mózg na raz do naczynia preparacyjnego. Za pomocą kleszczy z bardzo cienką końcówką rozsuń każdą półkulę mózgu i ściśnij je z pnia mózgu.
  17. Bardzo ostrożnie usuń opony mózgowe z każdej półkuli. (Opony mózgowe są różowawą błoną, bogatą w naczynia krwionośne i są częstym źródłem zanieczyszczenia glejowego w kulturze neuronów).
    1. Aby usunąć opony mózgowe, delikatnie uszczypnij, unieś i pociągnij za błonę, uważając, aby nie przebić tkanki mózgowej pod spodem.
    2. Odciągnij opony mózgowe od mózgu, pozwalając mózgowi przetoczyć się nieco pod kleszczami, ale utrzymując go na miejscu, aby można było odciągnąć błonę.
  18. W tym momencie możesz dalej analizować mózg, aby użyć wybranej tkanki. Na przykład przeanalizuj hipokamp z każdej półkuli. Umieść jedną półkulę boczną stroną do dołu. Obserwuj dużą jamę komorową, która tworzy płat zakrywający hipokamp. Delikatnie drażnij tę klapę z powrotem, aż będzie można zaobserwować hipokamp w kształcie półksiężyca. Hipokamp jest lekko uniesiony i znajduje się między śródmózgowiem a korą
    19. mózgową.
  19. Używając dwóch par ostrych, bardzo cienkich kleszczy, przytrzymaj półkulę mózgu otwartą jedną ręką, a drugą odetnij hipokamp od kory mózgowej i środkowej części mózgu.
    1. Umieść hipokamp w prawidłowo oznakowanym naczyniu (męskim lub żeńskim) wypełnionym buforem preparacyjnym i przechowywanym na lodzie.
    2. Wypreparuj hipokamp z pozostałej półkuli i powtórz ten proces z każdym mózgiem.
  20. Przenieś hipokampy do odpowiednio oznakowanych stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    1. Delikatnie przemyć dwukrotnie zimnym buforem preparacyjnym. Na tym etapie należy bardzo ostrożnie używać ssania próżniowego. Hipokampy są małe i mogą zostać bezpowrotnie utracone przez próżnię. Zapobiegaj temu, pozwalając chusteczce osiąść na dnie probówki, usuń jak najwięcej płynu z probówki za pomocą pipety, wyrzuć roztwór i zastąp świeżym, czystym buforem preparacyjnym.
    2. Powtórz krok 3.20.1.

4. Dysocjacja neuronów

  1. Przenieś hipokamp do odpowiednio oznakowanego, wstępnie podgrzanego roztworu papainy. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 8-10 minut, delikatnie odwracając probówki do mieszania co 2-3 minuty.
  2. Wyjąć mieszaninę papainy i chusteczkę z łaźni wodnej. Poczekaj, aż tkanka się uspokoi, a następnie ostrożnie usuń jak najwięcej roztworu papainy za pomocą pipety, pozostawiając tkankę na dnie probówki. Umyj chusteczkę 3x środkiem galwanicznym. Surowica zawarta w pożywce galwanicznej wygasza trawienie enzymatyczne papainy. Inhibitor trypsyny jest potrzebny, jeśli surowica nie jest używana w pożywce galwanicznej.
  3. Usuń nośnik galwaniczny z powłoką.
    1. Dodać 2 ml świeżej pożywki nerwowo-podstawowej i delikatnie rozdzielić tkankę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml ustawionej na najmniejszą prędkość.
    2. Dysocjacja odbywa się poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół 8 razy. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków do roztworu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy pobrać roztwór i tkankę do pipety, a następnie wypuścić roztwór na bok stożkowej rurki, pozwalając chusteczce zsunąć się z boku i z powrotem na dno probówki.
  4. Po 8 roztarciu pozwól tkance osiąść i zbierz mętne podłoże na wierzchu. Ten nośnik zawiera odłączone komórki.
    1. Przenieś go do nowej, oznaczonej tuby.
    2. Dodać dodatkowe 2 ml do nierozłącznej tkanki.
    3. Potrysuj ponownie kolejne 8x.
    4. Zbierz mętne podłoże.
    5. Powtórz ten proces 3-5 razy. Pewna ilość niezdysocjowanej tkanki pozostanie. Chociaż możliwe jest trituration do momentu dysocjacji całej tkanki, nadmierne trituration powoduje słabe zdrowie neuronów i nie jest zalecane.
  5. W razie potrzeby dodaj dodatkowe podłoże do stożkowych rurek, aby wyrównać objętość i wagę między tkanką męską i żeńską. Odwirować komórki w wirującym wiadrze wirującym o stężeniu 228 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant.
  6. Delikatnie zawiesić komórki w 2 ml świeżej pożywki galwanicznej i przefiltrować roztwór przez sitko do komórek siatkowych do czystej, oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  7. Dodać 50 μl zawiesiny komórek do 450 μl 0,4% błękitu trypanowego. Inkubować komórki przez 2 minuty w błękitu trypanowym, delikatnie wymieszać i załadować 10 μl do hemocytometru. Policz komórki, z wyłączeniem tych, które wchłonęły barwnik błękitu trypanowego; Ciemnoniebieskie komórki są martwe lub umierające.

5. Konserwacja poszycia i hodowli

  1. Oblicz prawidłową objętość zawiesiny komórek, którą należy dodać do każdej studzienki płytki do hodowli tkankowej, aby uzyskać pożądaną gęstość komórek. Hodowle neuronów są bardzo wrażliwe na gęstość komórek i najlepiej radzą sobie przy średniej lub wysokiej gęstości, chyba że są hodowane razem z glejem lub karmione pożywkami kondycjonowanymi glejowo. W tym protokole komórki są siane z prędkością 150 000-200 000 komórek/cm2.
  2. Wyjąć z inkubatora płytkę do hodowli tkankowej wypełnioną pożywką galwaniczną (przygotowaną w kroku 2 powyżej).
    1. Delikatnie zamieszać zawiesinę komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, a następnie odpipetować żądaną objętość zawiesiny komórek (obliczoną powyżej w kroku 5.1) do środka każdej studzienki.
    2. Powtórz tę czynność, obracając zawiesinę komórek za każdym razem przed pipetowaniem, aby zapewnić równą gęstość komórek w każdym dołku. Komórki szybko się osadzają, a gęstość komórek może zmienić się ze studni na studnię, jeśli pominie się etap wirowania.
  3. Po dodaniu komórek do każdej studzienki delikatnie zakręć płytką, aby rozproszyć komórki, a następnie natychmiast umieść naczynie w inkubatorze. Pozostaw komórki w spokoju przez co najmniej 24 godziny.
  4. Co najmniej 24 godziny po posianiu komórek należy ogrzać kompletną pożywkę do 37 °C. Odessać pożywkę galwaniczną z każdej studzienki i zastąpić ją pożywką do karmienia. Odsysaj i wymieniaj z jednej studzienki na raz, aby zminimalizować stres neuronalny i poprawić przeżycie komórek.
  5. Hodowle neuronów należy karmić co 4-7 dni, ostrożnie usuwając połowę pożywki i dodając z powrotem równą objętość świeżej pożywki. W tych warunkach kultury można utrzymywać przez dwa tygodnie. W przypadku pierwotnych kultur neuronalnych spodziewana jest pewna śmierć komórki. Tak więc, w miarę dojrzewania kultur, gęstość będzie się zmniejszać. W tym protokole gęstość komórek zmniejsza się o około 30% do 10 dnia in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Prawidłowe określanie płci embrionów myszy jest krytycznym etapem przygotowania stratyfikowanych ze względu na płeć kultur pierwotnych neuronów. Aby zapewnić, że hipokampy samców i samic były hodowane oddzielnie z poprawnie określonych pod względem płci płodów, embriony rozdzielono według płci i pobrano z nich korę mózgu oraz hipokamp. DNA genomiczne wyizolowano z pobranej tkanki każdego embrionu zgodnie ze standardowymi procedurami, dbając o zachowanie rozdzielności płci. Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przeprowadzo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stratyfikowane płciowo pierwotne odłączone kultury neuronów hipokampa, w których hipokampy męskie i żeńskie są preparowane, rozdzielane i hodowane oddzielnie, stanowią przydatne narzędzie do badania sygnalizacji komórkowej specyficznej dla płci w śmierci komórki neuronalnej. Podczas gdy neuronaukowcy często używają pierwotnych kultur neuronalnych, protokoły różnią się w zależności od ich konkretnych celów eksperymentalnych i zainteresowań. Wielu badaczy decyduje się na kokulturację neuronów z glejem, albo w kulturze mies...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca wspierana częściowo przez Fundację Waltera S. i Lucienne Driskill oraz NIH R01NS058792.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
B27 SuplementInvitrogen17504-044
BoraksSigma71997
Kwas borowySigmaB6768
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA4503
Surowica bydlęcaInvitrogen26140-079
GlutaMAXInvitrogen35050-061
GlutaminaInvitrogen25030-081
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowejInvitrogen14175-095
MEM, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowejInvitrogen51200-038
Neurobazal, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowejInvitrogen12348-017
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15070-063
Poli-D-lizyna, MW 70 000-150 000SigmaP0899
Trypan Blue 0,4%Invitrogen15250-061
SPRZĘT
Dumont #5/45 Kleszcze kątoweFine Science Tools11251-35
Dumont #7 – Kleszcze drobno zakrzywioneNarzędzia do nauki11274-20
Ząbkowane (Londyn) KleszczeNarzędzia do nauki11080-02
Bardzo cienkie kleszcze Graefe 1 x 2 zębyNarzędzia do nauki11153-10
Nożyczki sprężynowe MoriaNarzędzia do nauki15396-00
Średnie nożyczki operacyjneRoboz SurgicalRS-6812
Bardzo cienkie nożyczki do mikrodysekcjiRoboz SurgicalRS-5880
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowychFisher87721
Sitko do komórek, 40 i mikro; M Siatka nylonowaBD Biosciences352340

Bibliografia

  1. Andreano, J. M., Cahill, L. Sex influences on the neurobiology of learning and memory. Learn Mem. 16, 248-266 (2009).
  2. Arnold, A. P., Burgoyne, P. S. Are XX and XY brain cells intrinsically different. Trends Endocrinol. Metab. 15, 6-11 (2004).
  3. Cahill, L. Why sex matters for neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 7, 477-484 (2006).
  4. Jazin, E., Cahill, L. Sex differences in molecular neuroscience: from fruit flies to humans. Nat. Rev. Neurosci. 11, 9-17 (2010).
  5. Morris, J. A., Jordan, C. L., Breedlove, S. M. Sexual differentiation of the vertebrate nervous system. Nat. Neurosci. 7, 1034-1039 (2004).
  6. Lang, J. T., McCullough, L. D. Pathways to ischemic neuronal cell death: are sex differences relevant. J. Transl. Med. 6, 33(2008).
  7. Van Den Eeden, S. K., et al. Incidence of Parkinson's disease: variation by age, gender, and race/ethnicity. Am. J. Epidemiol. 157, 1015-1022 (2003).
  8. Abel, K. M., Drake, R., Goldstein, J. M. Sex differences in schizophrenia. Int. Rev. Psychiatry. 22, 417-428 (2010).
  9. Vest, R. S., Pike, C. J. Gender, sex steroid hormones, and Alzheimer's disease. Horm. Behav. 63, 301-307 (2013).
  10. Fernandez-Guasti, A., Fiedler, J. L., Herrera, L., Handa, R. J. Sex, stress, and mood disorders: at the intersection of adrenal and gonadal hormones. Horm. Metab. Res. 44, 607-618 (2012).
  11. Hall, E. D., Pazara, K. E., Linseman, K. L. Sex differences in postischemic neuronal necrosis in gerbils. J. Cereb. Blood Flow Metab. 11, 292-298 (1991).
  12. Hawk, T., Zhang, Y. Q., Rajakumar, G., Day, A. L., Simpkins, J. W. Testosterone increases and estradiol decreases middle cerebral artery occlusion lesion size in male rats. Brain Res. 796, 296-298 (1998).
  13. Nakano, T., Hurn, P. D., Herson, P. S., Traystman, R. J. Testosterone exacerbates neuronal damage following cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in mouse. Brain Res. 1357, 124-130 (2010).
  14. Pan, Y., et al. Effect of testosterone on functional recovery in a castrate male rat stroke model. Brain Res. 1043, 195-204 (2005).
  15. Siegel, C., Turtzo, C., McCullough, L. D. Sex differences in cerebral ischemia: possible molecular mechanisms. J. Neurosci. Res. 88, 2765-2774 (2010).
  16. Uchida, M., et al. Dose-dependent effects of androgens on outcome after focal cerebral ischemia in adult male mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 29, 1454-1462 (2009).
  17. Yang, S. H., et al. Testosterone increases neurotoxicity of glutamate in vitro and ischemia-reperfusion injury in an animal model. J. Appl. Physiol. 92, 195-201 (2002).
  18. Cheng, J., Alkayed, N. J., Hurn, P. D. Deleterious effects of dihydrotestosterone on cerebral ischemic injury. J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1553-1562 (2007).
  19. Nunez, J. Sex and steroid hormones in early brain injury. Rev. Endocr. Metab. Disord. 13, 173-186 (2012).
  20. Renolleau, S., Fau, S., Charriaut-Marlangue, C. Gender-related differences in apoptotic pathways after neonatal cerebral ischemia. Neuroscientist. 14, 46-52 (2008).
  21. McCarthy, M. M., Konkle, A. T. When is a sex difference not a sex difference. Front Neuroendocrinol. 26, 85-102 (2005).
  22. Aarts, M. M., Tymianski, M. TRPMs and neuronal cell death. Pflugers Arch. 451, 243-249 (2005).
  23. Jiang, L. -H., Yang, W., Zou, J., Beech, D. J. TRPM2 channel properties, functions and therapeutic potentials. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 973-988 (2010).
  24. Jia, J., et al. Sex differences in neuroprotection provided by inhibition of TRPM2 channels following experimental stroke. J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 2160-2168 (2011).
  25. Fairbanks, S. L., et al. Mechanism of the sex difference in neuronal ischemic cell death. Neuroscience. 219, 183-191 (2012).
  26. Verma, S., et al. TRPM2 channel activation following in vitro ischemia contributes to male hippocampal cell death. Neurosci. Lett. 530, 41-46 (2012).
  27. Bai, P., Canto, C. The role of PARP-1 and PARP-2 enzymes in metabolic regulation and disease. Cell Metab. 16, 290-295 (2012).
  28. Blenn, C., Wyrsch, P., Bader, J., Bollhalder, M., Althaus, F. R. Poly(ADP-ribose)glycohydrolase is an upstream regulator of Ca2+ fluxes in oxidative cell death. Cell Mol. Life Sci. 68, 1455-1466 (2011).
  29. Buelow, B., Song, Y., Scharenberg, A. M. The Poly(ADP-ribose) polymerase PARP-1 is required for oxidative stress-induced TRPM2 activation in lymphocytes. J. Biol. Chem. 283, 24571-24583 (2008).
  30. Fonfria, E., et al. TRPM2 channel opening in response to oxidative stress is dependent on activation of poly(ADP-ribose) polymerase. Br. J. Pharmacol. 143, 186-192 (2004).
  31. Miller, B. A. Inhibition of TRPM2 function by PARP inhibitors protects cells from oxidative stress-induced death. Br. J. Pharmacol. 143, 515-516 (2004).
  32. Vagnerova, K., et al. Poly (ADP-ribose) polymerase-1 initiated neuronal cell death pathway--do androgens matter. Neuroscience. , 166-476 (2010).
  33. Yuan, M., et al. Sex differences in the response to activation of the poly (ADP-ribose) polymerase pathway after experimental stroke. Exp. Neurol. 217, 210-218 (2009).
  34. Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2496-2500 (1986).
  35. Dumesic, D. A., Renk, M., Kamel, F. Estrogenic effects of phenol red on rat pituitary cell responsiveness to gonadotropin-releasing hormone. Life Sci. 44, 397-406 (1989).
  36. Ernst, M., Schmid, C., Froesch, E. R. Phenol red mimics biological actions of estradiol: enhancement of osteoblast proliferation in vitro and of type I collagen gene expression in bone and uterus of rats in vivo. J. Steroid Biochem. 33, 907-914 (1989).
  37. Hubert, J. F., Vincent, A., Labrie, F. Estrogenic activity of phenol red in rat anterior pituitary cells in culture. Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 885-891 (1986).
  38. Ortmann, O., Sturm, R., Knuppen, R., Emons, G. Weak estrogenic activity of phenol red in the pituitary gonadotroph: re-evaluation of estrogen and antiestrogen effects. J. Steroid Biochem. 35, 17-22 (1990).
  39. Rajendran, K. G., Lopez, T., Parikh, I. Estrogenic effect of phenol red in MCF-7 cells is achieved through activation of estrogen receptor by interacting with a site distinct from the steroid binding site. Biochem. Biophys. Res. Commun. 142, 724-731 (1987).
  40. Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Mol. Cell Endocrinol. 57, 169-178 (1988).
  41. Moreno-Cuevas, J. E., Sirbasku, D. A. Estrogen mitogenic action. III. is phenol red a "red herring"? In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 36, 447-464 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Określanie płci embrionów myszyizolacja neuronów hipokampadeprywacja tlenu i glukozyinhibicja kanałów TRPM2myszy z nokautem genu PARP1powlekanie poli-D-lizynąprzygotowanie pożywki Neurobasalwysiew komórek o określonej gęstościanaliza Western blot
Stratyfikowane kultura neuronów według płci w celu zbadania szlaków śmierci komórek niedokrwiennych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.