Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Podsumowanie

Prezentujemy preparat do wizualizacji i manipulowania sygnalizacją wapniową w natywnym, nienaruszonym śródbłonku mikronaczyniowym. Śródbłonek świeżo wyizolowany z tętnic oporowych myszy zaopatrujących mięśnie szkieletowe zachowują morfologię in vivo i dynamiczną sygnalizację w sąsiednich komórkach i między nimi. Rurki śródbłonka można przygotować z mikronaczyń innych tkanek i narządów.

Streszczenie

Kontrola przepływu krwi przez układ naczyniowy reguluje dopływ tlenu i składników odżywczych wraz z usuwaniem produktów ubocznych przemiany materii, czego przykładem jest ćwiczenie mięśni szkieletowych. Komórki śródbłonka (EC) wyściełają błonę wewnętrzną wszystkich naczyń oporowych i odgrywają kluczową rolę w kontrolowaniu średnicy (np. zależnego od śródbłonka rozszerzenia naczyń krwionośnych), a tym samym wielkości i dystrybucji przepływu krwi w tkankach. Regulacja oporu naczyniowego przez EC odbywa się poprzez wewnątrzkomórkową sygnalizację Ca²⁺, która prowadzi do wytwarzania dyfuzyjnych autakoidów (np. metabolitów tlenku azotu i kwasu arachidonowego)^1-3 i hiperpolaryzacji^4,5, które wywołują rozluźnienie komórek mięśni gładkich. Tak więc zrozumienie dynamiki śródbłonkowej sygnalizacji Ca^{2 +} jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia mechanizmów rządzących kontrolą przepływu krwi. Izolowanie śródbłonka eliminuje zmienne zakłócające związane z krwią w świetle naczynia oraz z otaczającymi komórkami mięśni gładkich i nerwami okołonaczyniowymi, które w przeciwnym razie wpływają na strukturę i funkcję EC. W tym artykule przedstawiono izolację śródbłonka z tętnicy nadbrzusza górnego (SEA) przy użyciu protokołu zoptymalizowanego dla tego naczynia.

Aby odizolować rurki śródbłonka od znieczulonej myszy, SEA jest podwiązane in situ, aby utrzymać krew w świetle naczynia (aby ułatwić jej wizualizację podczas sekcji), a cały arkusz mięśni brzucha jest wycinany. SEA jest wycinane z otaczających włókien mięśni szkieletowych i tkanki łącznej, krew jest wypłukiwana ze światła i przeprowadza się łagodne trawienie enzymatyczne, aby umożliwić usunięcie przydanek, nerwów i komórek mięśni gładkich za pomocą delikatnego rozcierania. Te świeżo wyizolowane preparaty nienaruszonego śródbłonka zachowują swoją natywną morfologię, przy czym poszczególne EC pozostają funkcjonalnie sprzężone ze sobą, zdolne do przenoszenia sygnałów chemicznych i elektrycznych międzykomórkowo przez połączenia szczelinowe^6,7. Oprócz dostarczania nowych informacji na temat sygnalizacji wapniowej i biofizyki błon, preparaty te umożliwiają badania molekularne ekspresji genów i lokalizacji białek w natywnym śródbłonku mikronaczyniowym.

Wprowadzenie

W tym protokole opisujemy izolację rurek komórkowych śródbłonka od mysiego SEA. SEA powstaje z wewnętrznej tętnicy piersiowej i dostarcza natlenioną krew do przedniej części mięśni brzucha. Nasza praca z SEA jako modelem wynika z tego, że dostarcza on stosunkowo długich, nierozgałęzionych segmentów mikronaczyń, które dobrze nadają się do badania zdarzeń sygnalizacji międzykomórkowej leżących u podstaw roli śródbłonka w regulowaniu i koordynowaniu relaksacji komórek mięśni gładkich. Dla osób zainteresowanych tkankami innymi niż mięśnie szkieletowe stwierdziliśmy, że technika ta jest łatwo przystosowana do uzyskiwania rurek śródbłonka z mikronaczyń mózgu, jelit i układu limfatycznego.

Kluczowe cechy tej metody polegają na tym, że nienaruszone długości (1-3 mm) śródbłonka mikronaczyniowego są izolowane, zabezpieczane przed szklanym szkiełkiem nakrywkowym w komorze przepływowej, w której są przerośnięte PSS, i obrazowane dla sygnalizacji Ca^{2+ 7-9} lub nabijane na pal dla sygnalizacji elektrycznej^6,8. W komorze przepływowej górna połowa rurki jest wystawiona na działanie roztworu do superfuzji i reaguje na interwencje eksperymentalne, podczas gdy dolna połowa (w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym) jest chroniona i pozostaje w stanie spoczynku. Oprócz badania zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i międzykomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych Ca^{2 +}, rurki śródbłonka mogą być wykorzystywane do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym do oceny ekspresji genów^6,10, immunohistochemii do badania ekspresji białek^6,10 oraz badań elektrofizjologicznych do określenia biofizycznych właściwości przewodnictwa elektrycznego^6,11.

Istnieje kilka zalet przygotowania rurki śródbłonka do badania funkcji śródbłonka. Po pierwsze, proces izolacji zapewnia proste rozróżnienie między dwiema populacjami komórek: komórkami śródbłonka (które pozostają w tworzeniu rurki) i komórkami mięśni gładkich (indywidualnie zdysocjowanymi; zwykle w kształcie litery "C", gdy są zrelaksowane). Pozwala to na selektywne pobieranie próbek i badanie unikalnych właściwości leżących u podstaw wkładu poszczególnych komórek w funkcjonowanie naczyń krwionośnych. Po drugie, model ten umożliwia rozwiązywanie zdarzeń sygnalizacyjnych właściwych dla śródbłonka, niezależnie od wpływu przepływu krwi, otaczających mięśni gładkich, nerwów i miąższu. Po trzecie, śródbłonek jest badany świeżo wyizolowany, co pozwala uniknąć zmian w ekspresji genów lub białek związanych z hodowlą komórkową.

Protokół

1. Przygotowanie sprzętu: komora przepływowa, pipety i roztwory

1. Komora przepływowa: Użyj komory przepływowej ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 50 mm na dnie, aby połączyć izolowane rurki śródbłonka (patrz rysunek 1A). Przed montażem komory należy umyć szkiełka nakrywkowe zarówno 3% HCl, jak i 70% etanolem, spłukać ultraczystą wodą i osuszyć gazowym azotem.
2. Pipety: Podczas protokołu używane są trzy różne rodzaje pipet: kaniulacja, rozcieranie i przypinanie. Zarówno pipety kaniulacyjne, jak i pinowe można wykonać przed dniem eksperymentu, ale pipeta do trituracji powinna być wykonana w dniu eksperymentu, ponieważ wymaga znajomości średnicy naczynia, aby odpowiednio dobrać rozmiar światła.
   1. Pipety kaniulacyjne: Aby wypłukać czerwone krwinki ze światła, należy wyciągnąć rurki kapilarne ze szkła borokrzemianowego za pomocą ściągacza do mikropipet, aby miały długie, zwężające się końce. Połam końce kleszczami do średnicy zewnętrznej ~30% mniejszej niż średnica tętnic (~50-80 μm) i wypoleruj końcówkę, aby była gładka (patrz rysunek 1B). Pomocne jest również ustawienie końcówek pipet pod kątem około 45°.
   2. Pipety do rozcierania: Aby mechanicznie oddzielić komórki mięśni gładkich i przydanki od rurek śródbłonka, należy wykonać pipety do rozcierania z rurkami kapilarnymi ze szkła borokrzemianowego. Przygotuj rurki kapilarne jak powyżej i odłam koniec kleszczami. Wskazówka: Użyj szklanego urządzenia do nacinania, aby ułatwić czyste rozbicie grubszej ścianki szklanki pipety do pipet. Rozbić pipetę na średnicę wewnętrzną ustaloną w dniu eksperymentu, o około 10-20 μm większą niż średnica zewnętrzna naczynia, z którego zostaną wyizolowane rurki śródbłonka. Na ogień wypoleruj złamane końce, aż będą gładkie (patrz rysunek 1C).
   3. Pipety do przypinania: Aby ustabilizować rurkę śródbłonka w komorze przepływowej, należy wykonać pipety przypinające, aby przymocować rurkę śródbłonka do dna szkiełka nakrywkowego komory. Pociągnij szklane rurki kapilarne w taki sam sposób, jak pipety kaniulacyjne. Następnie połam końce kleszczami do średnicy ~100 μm i wypoleruj ogniem, aż końcówki będą uszczelnione, zaokrąglone i gładkie (patrz rysunek 1D). Uwaga: Jeśli końcówka pipety do przypinania nie jest całkowicie uszczelniona, płyn dostanie się do światła i może zakłócić wyniki eksperymentów.
3. Roztwory: Przygotuj wszystkie roztwory w ultraczystym (18,2 MΩ)_H2Oi wysterylizuj je przez filtr 0,2 μm. Upewnij się, że osmolalność roztworów mieści się w przedziale 285-300 mOsm. Roztwory pozostają dobre przez około dwa tygodnie, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C.
   1. Roztwór rozpisczy: Roztwór soli stosowany podczas rozwarstwiania tętnicy nadbrzusza górnego składa się z (w mmol/l): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl₂, 10 kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES), 10 glukozy, 0,01 nitroprusydku sodu (SNP) i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o pH 7,4. SNP dawcy NO jest dołączony, aby pomóc rozluźnić komórki mięśni gładkich, ułatwiając w ten sposób kanniurację tętnicy i ułatwiając usuwanie komórek mięśni gładkich podczas trituracji.
   2. Roztwór dysocjacyjny: Roztwór soli stosowany podczas dysocjacji rurki śródbłonka składa się z (w mmol/L): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl₂, 10 HEPES, 10 glukozy, 2 CaCl₂ i 0,1% BSA, o pH 7,4. Do 1 ml podwielokrotności tego buforu dodać: 0,62 mg/ml papainy, 1,5 mg/ml kolagenazy i 1,0 mg/ml ditioerytrytolu. Ponieważ enzymy pochodzące od różnych dostawców mogą mieć różne poziomy aktywności enzymatycznej, numery produktów użytych do tej pracy są zawarte w tabeli materiałów w celach informacyjnych. Uwaga: Podczas protokołu zarówno bufor dysocjacyjny, jak i bufor dysocjacyjny z enzymami są używane na różnych etapach.
   3. Roztwór do superfuzji: Fizjologiczny roztwór soli (PSS) stosowany do superfuzji izolowanej rurki śródbłonka składa się z (w mmol/l): 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl₂, 10 HEPES, 10 glukozy i 2 CaCl₂, o pH 7,4.
   4. Przygotuj i roztwory przed rozpoczęciem zabiegów chirurgicznych. Usunąć roztwory z 4 °C i podwielokrotność 50 ml buforu do rozwarstwienia do kolby Erlenmeyera o pojemności 200 ml i umieścić ją na lodzie. Dodatkowo podajcie porcję 50 ml buforu dysocjacyjnego bez enzymów i umieśćcie go na blacie stołu, aby zrównoważyć się do temperatury pokojowej. Usunąć roztwór przefuzyjny z temperatury 4 °C i pozostawić do osiągnięcia temperatury pokojowej na blacie stołu.

2. Przygotowanie zwierząt

Upewnij się, że wszystkie procedury i protokoły dotyczące zwierząt są zgodne z Przewodnikiem Narodowych Instytutów Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Missouri.

1. Użyj samców lub samic myszy w wieku co najmniej 9 tygodni i zbadaj każdą z nich indywidualnie. Znieczulić mysz pentobarbitalem sodu (60 mg/kg) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.). Wskazówka: Rozcieńczenie pentobarbitalu do 10 mg/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej przed wstrzyknięciem zmniejsza możliwość przedawkowania.
2. Znieczulenie utrudnia regulację temperatury, więc utrzymuj mysz w cieple natychmiast po pierwszym wstrzyknięciu pentobarbitalu. Używanie metalowego nośnika (wentylowanego aluminiowego kosza) na górze płyty grzewczej (skalibrowanej na ~37 °C) dobrze sprawdza się w utrzymaniu stabilnej temperatury myszy. Alternatywnie użyj lampy grzewczej, zwracając uwagę na ustawienie jej w odpowiedniej odległości od myszy. Monitoruj mysz co 5-10 minut, aż do osiągnięcia odpowiedniego poziomu znieczulenia (brak wycofania do uszczypnięcia palca u nogi lub ogona). Po 15-20 minutach może być konieczne podanie dawki uzupełniającej. Najlepiej postępować powoli i ostrożnie, aby uniknąć przedawkowania, zwłaszcza w przypadku zwierząt otyłych, starszych lub w inny sposób zestresowanych.
3. Usuń włosy od strony brzusznej, ostrożnie goląc je małymi maszynkami do strzyżenia włosów dla zwierząt. Szczególną uwagę należy zwrócić na uniknięcie urazu zwierzęcia. Pomocne jest usunięcie wszystkich włosów z obszaru rozciągającego się od pach do okolicy łonowej. Usuń luźno przylegające włosy świeżym wacikiem nasączonym alkoholem.
4. Ustaw mysz na plecach, leżąc z rozłożonymi przednimi i tylnymi kończynami, aby odsłonić jak największą część ściany brzucha. W razie potrzeby użyj taśmy laboratoryjnej, aby zabezpieczyć nogi w sposób rozłożony.

3. Izolacja tętnicy nadbrzusza górnego

1. Wykonaj małe nacięcie przez skórę tuż nad obszarem łonowym. Upewnij się, że cięta jest tylko skóra, unikając uszkodzenia leżącego poniżej mięśnia brzucha; Przedłuż nacięcie na boki w każdym kierunku na odpowiednie kończyny tylne. Kontynuuj nacięcie rostralnie wzdłuż brzusznej linii środkowej do górnej części klatki piersiowej, a następnie przedłuż nacięcie bocznie w każdym kierunku do odpowiednich kończyn przednich.
2. Delikatnie unieś skórę i za pomocą nożyczek przeciąć tkankę łączną przytrzymującą skórę do leżącego poniżej mięśnia, odsłaniając w ten sposób całą powierzchnię mięśni brzucha (patrz ryc. 3A). Przepłukać odsłonięty mięsień 0,9% roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej.
3. Ze względu na mały rozmiar SEA, umieść zwierzę pod mikroskopem stereoskopowym w celu przeprowadzenia dalszych zabiegów. Podnieś poduszeczkę tłuszczową znajdującą się na dnie mostka za pomocą kleszczy i wykonaj przez nią nacięcie. Kontynuuj nacięcie wzdłuż dolnego żebra, uważając, aby nie wciąć się zbyt głęboko w znajdującą się poniżej tkankę. Strategiczna ocena oddziaływania na środowisko powinna być widoczna; Uważaj, aby go nie uszkodzić. Po zakończeniu nacięcia przepłukać odsłoniętą tkankę 0,9% roztworem soli fizjologicznej o temperaturze pokojowej.
4. Po cofnięciu się górnej warstwy mięśni szkieletowych można łatwo zidentyfikować SEA i leżący pod nim mięsień. Wskazówka: Zanotuj długość SEA in vivo przed izolacją, aby przedłużyć rurki śródbłonka (które skracają się wzdłuż swojej osi po izolacji), aby przybliżyć ich pierwotną długość. Za pomocą kleszczy i nożyczek ostrożnie wytnij cienką warstwę mięśni pod SEA.
5. Za pomocą kleszczy pod kątem przełóż jedwabny szew 6-0 pod SEA i podwiąż tętnicę i przylegającą do niej żyłę, aby utrzymać ją pod ciśnieniem i krew zatrzymaną w świetle naczynia, aby ułatwić wizualizację podczas późniejszej izolacji i czyszczenia.
6. Powtórz procedurę podwiązania SEA po stronie przeciwnej.
7. Po podwiązaniu obu SEA wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej mięśni brzucha, aby oddzielić odpowiednie strony.
8. Przedłuż nacięcie na boki w każdym kierunku, tak jak w przypadku skóry, a następnie kontynuuj nacięcie pionowo wzdłuż zewnętrznej krawędzi, aby całkowicie oddzielić mięsień brzucha od ciała. Unikaj uszkodzenia naczyń krwionośnych zasilanych przez SEA, aby utrzymać światło pod ciśnieniem.
9. Przeciąć morze powyżej podwiązania, aby utrzymać szczelność, i umieścić odizolowany mięsień i tętnicę w zlewce o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml buforu do preparacji o temperaturze 4 °C.
10. Powtórz procedurę dla drugiej strony brzucha i inkubuj tkanki w buforze preparacyjnym przez 10 minut.
11. Umieścić mięsień brzuszny zawierający SEA w schłodzonej (4 °C) komorze rozwarstwiającej zawierającej bufor preparacyjny (patrz rysunek 3B). Komora preparcyjna składa się z płytki Petriego z warstwą Sylgardu (polidimetylosiloksanu [PDMS]) na dnie.
12. Za pomocą szpilek przeciw owadom (0,15 mm) rozciągnij izolowany mięsień morski i mięsień brzucha do przybliżonych długości in vivo (wymienionych powyżej) i przymocuj je do Sylgarda. Wskazówka: Zorientowanie mięśnia w taki sposób, aby cienka warstwa skierowana w stronę otrzewnej znajdowała się na górze, sprawia, że SEA jest łatwo widoczne za pomocą transiluminacji.
13. Wykorzystując drobne instrumenty do mikrodysekcji i pracując od górnego miejsca podwiązania w kierunku dolnego końca, oczyść SEA z sparowanej żyły i otaczającej tkanki, aż do pierwszego głównego miejsca rozgałęzienia (1-2 cm). Następnie wytnij SEA, przecinając je tuż nad miejscem odgałęzienia i tuż poniżej podwiązania.
14. Aby usunąć krew zatrzymaną w świetle naczynia, należy kanulokować SEA i przepłukać je lodowatym buforem preparacyjnym. Za pomocą kawałka rurki silastycznej przymocuj tylny koniec pipety kaniulacyjnej do strzykawki o pojemności 5 ml zawierającej lodowaty bufor do rozwarstwiania i zabezpiecz mikropipetę w mikromanipulatorze, aby umieścić jej końcówkę w komorze rozwarstwiania w celu kaniulacji SEA.
15. Po wypłukaniu wszystkich erytrocytów wyjmij SEA z pipety kaniulacyjnej i wyjmij pipetę z naczynia rozwarstwiającego.
16. Pokrój SEA na mniejsze segmenty o długości 1-3 mm każdy. Te krótsze odcinki ułatwiają izolację rurek śródbłonka.

4. Izolacja rurki śródbłonka

1. Napełnij szklaną probówkę hodowlaną o wymiarach 12 mm x 75 mm do połowy lodowatym buforem do rozwarstwiania. Za pomocą kleszczy pod kątem przenieś kawałki tętnicy do rurki hodowlanej i umieść na lodzie. W tym czasie połączyć enzymy wytrawiające z buforem dysocjacyjnym do końcowej objętości 1 ml w oddzielnej probówce hodowlanej o wymiarach 12 mm x 75 mm (patrz 1.3.2 Roztwory) i podgrzać roztwór do temperatury 37 °C za pomocą bloku grzewczego.
2. Podczas gdy bufor dysocjacyjny i enzymy się nagrzewają, ostrożnie odessać bufor rozwarstwiający z probówki hodowlanej, pozostawiając niewielką objętość zawierającą segmenty naczynia.
3. Delikatnie dodać bufor dysocjacyjny w temperaturze pokojowej bez enzymów, aby zmyć pozostały bufor rozwarstwiający. Wskazówka: Bufor dysocjacyjny należy dodawać powoli, tak aby fragmenty tętnicy pozostały na dnie probówki hodowlanej, aby zaoszczędzić czas w oczekiwaniu na ich ponowne przemieszczenie. Podnieś temperaturę bufora w wielu krokach od lodu (4 °C) do temperatury pokojowej (~24 °C), do 37 °C, aby zminimalizować wstrząsy.
4. Ostrożnie odessać bufor dysocjacyjny z probówki hodowlanej, ponownie upewniając się, że pozostawiono niewielką objętość zawierającą segmenty naczynia.
5. Usunąć bufor dysocjacyjny do podgrzewania wstępnego z enzymami z bloku grzewczego, przenieść 1 ml roztworu enzymatycznego do probówki hodowlanej zawierającej segmenty naczynia i umieścić probówkę hodowlaną z powrotem w bloku grzewczym. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
6. Podczas inkubacji z enzymami należy przygotować pipetę do rozcierania, napełnić ją olejem mineralnym i zabezpieczyć na mikrostrzykawce zamontowanej w mikromanipulatorze. Następnie wycofać tłok mikrostrzykawki, aby napełnić pipetę buforem dysocjacyjnym o stężeniu 2 nl i umieścić końcówkę pipety nad komorą przepływową.
7. Pod koniec 30-minutowej inkubacji wyjąć probówkę hodowlaną z bloku grzewczego i ostrożnie zassać bufor jak powyżej.
8. Przemyć odcinki tętnicze 4 ml buforu dysocjacyjnego o temperaturze pokojowej. Uwaga: Nie jest już konieczne trzymanie segmentów naczynia na dnie probówki hodowlanej; Naruszenie fragmentów tętnic faktycznie pomaga zapewnić, że resztki enzymów są skutecznie usuwane.
9. Przenieść jeden segment naczynia do komory przepływowej, delikatnie zasysając go mikropipetą o pojemności 1 ml, a następnie umieścić go w komorze przepływowej z 1 ml buforu dysocjacyjnego.
10. Korzystając z mikromanipulatora zawierającego mikrostrzykawkę, umieść końcówkę pipety do rozcierania w pobliżu jednego końca segmentu naczynia.
11. Powoli (225 nl/s) zassać segment naczynia (500 nl wycofany) do pipety trójkowej, aby nie powodować mechanicznego naprężenia ECs, a następnie wyrzucić go z powrotem do komory. Jeśli trawienie zakończyło się sukcesem, komórki mięśni gładkich i przydanka zostaną oddzielone od rurki śródbłonka.
12. Powtarzaj triturację, aż wszystkie komórki mięśni gładkich zostaną zdysocjowane. Należy pamiętać, że nadmierne rozproszenie (4x lub więcej) może uszkodzić EC i sprawić, że przestaną reagować na agonistów. Wskazówka: za pomocą pipety do rozcierania odsuń przydankę od rurki śródbłonka tak szybko, jak to możliwe, aby nie zaplątała się w rurkę. Uwaga: Za pomocą pipety do rozdmuchiwania izolowaną rurkę śródbłonka można odessać i przenieść do oddzielnej komory.
13. Umieść rurkę śródbłonka na środku komory przepływowej, wyrównaną wzdłuż kierunku przepływu, i wyjmij pipetę do napełniania.
14. Zabezpiecz pipety pinowe w mikromanipulatorach zamontowanych na obu końcach komory przepływowej i umieść ich końcówki na odpowiednich końcach rurki śródbłonka.
15. Opuść pipetę przypinającą na jeden koniec probówki, aby docisnąć ją do dna komory. Umieść drugą pipetę do przypinania w ten sam sposób na przeciwległym końcu probówki. Uwaga: Umieszczenie pipet przypinających jest kompromisem między zabezpieczeniem probówki (umieszczenie ich dalej od końca probówki) a umożliwieniem uzyskania większej powierzchni obrazowania/eksperymentu (umieszczenie ich bliżej końca probówki). Dobrze sprawdza się ich zlokalizowanie ~50 μm z każdego końca rury. W momencie, gdy pipeta do przypinania dotyka probówki, powoli cofnij ją wzdłuż osi probówki, wydłużając ją w ten sposób do przybliżonej długości in vivo; Następnie dociśnij pipetę do dna komory, aby zabezpieczyć probówkę.
16. Rozpocząć przepływ roztworu do przeprofuzji i pozostawić rurkę śródbłonka na spoczynek przez co najmniej 20 minut, aby zrównoważyła się i przylegała (patrz rysunek 3C). Wykorzystaj pompę perystaltyczną, aby utrzymać stały przepływ płynu (superfuzję) przez rurkę śródbłonka. Uwaga: Pipety przypinające można wyjąć, gdy rurka śródbłonka przyklei się do dna komory przepływowej (~25 min) lub pozostawić na miejscu, aby upewnić się, że rurka śródbłonka nie zostanie przemieszczona.

5. Ładowanie barwnika i obrazowanie wapnia

1. Aby uwidocznić wewnątrzkomórkowe odpowiedzi wapnia, załaduj rurkę śródbłonka barwnikiem fluo-4 AM w temperaturze pokojowej (~24 °C). Zatrzymać przepływ płynu w kąpieli i dodać fluo-4 AM do komory o końcowym stężeniu 10 μM. Odczekać 10 minut, aby barwnik mógł dostać się do komórek, a następnie przelać rurkę śródbłonka świeżym PSS przez 20 minut, aby upewnić się, że barwnik zewnątrzkomórkowy został usunięty, a barwnik wewnątrzkomórkowy został całkowicie zdeestryfikowany.
2. Wykonaj obrazowanie wapnia. Do tej pracy użyto mikroskopu pionowego (patrz ryc. 2) wyposażonego w system obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem w temperaturze pokojowej. Wzbudzić fluorescencyjny barwnik wapniowy za pomocą lasera o długości fali 491 nm i uzyskać obrazy (przy emisji 500-550 nm) za pomocą zintensyfikowanej kamery cyfrowej.

Wyniki

Reakcje wapniowe w świeżo wyizolowanych tubulach śródbłonkowych można zainicjować przy użyciu acetylocholiny (ACh). W tym filmie tubula śródbłonkowa obciążona 10 µM fluo-4 AM jest stymulowana przez superfuzję 1 µM ACh (Film 1). Kliknij tutaj, aby obejrzeć film. Barwnik jest wzbudzany przy 491 nm, a emisja jest rejestrowana w zakresie 500-550 nm przy użyciu kamery z wzmocnionym urządzeniem sprzężonych ładunków (ICCD). Stosy obrazów są pozyskiwane z częstotliwością 120 klatek/s przez okres 25 s, a następnie mogą zostać uśrednione (np. do 40 klatek/s). Reprezentatywne obrazy fluorescencji w czasie przedstawiono na Rysunku 4.

Rysunek 1. Komora przepływowa i pipety używane podczas izolacji rurek śródbłonkowych. A) Komora przepływowa z zastosowaniem szklanej lam książeczki o wymiarach 24 mm x 50 mm jako podstawy. B) Przykłady pipety do kaniulacji dociąganej (lewo) oraz dociąganej, złamanej, polerowanej i ściętej pod kątem (prawo). Pipeta ta służy do wypłukiwania erytrocytów z światła tętnicy po sekcji. Pasek skali = 200 µm. C) Przykłady pipety do tryturacji dociąganej (lewo) oraz dociąganej, złamanej i polerowanej (prawo). Średnica wewnętrzna tej pipety jest określona przez średnicę zewnętrzną tętnicy. Pasek skali = 200 µm. D) Przykłady pipety do mocowania dociąganej (lewo) oraz dociąganej, złamanej i polerowanej (prawo). Końcówka tej pipety jest zaokrąglona i całkowicie zamknięta, aby zabezpieczyć rurkę śródbłonkową w komorze przepływowej. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rysunek 2. Konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem do obrazowania sygnałów Ca²⁺. A>) Mikroskop odwrócony używany do obrazowania wapnia. B>) (a) Jednostka konfokalna z wirującym dyskiem wraz z (b>) kamerą CCD z wzmacniaczem obrazu. C>) Obiektywy imersyjne (a>) 63X (NA = 1) oraz (b>) 20X (NA = 0,5) wykorzystywane do obrazowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Rycina 3. Izolacja mięśnia brzusznego i tętnicy nadbrzusznej przyśrodkowej. A) Zznieczyszona mysz z odsłoniętym mięśniem brzusznym, przemywanym 0,9% roztworem soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej. Czerwone strzałki wskazują miejsca pod poduszeczkami tłuszczowymi, w których odpowiednie SEA wchodzą do każdego z mięśni prostych brzucha (t.j. miejsca, w których naczynia należy podwiązać). Pasek skali = 1 cm. B) Izolowany mięsień brzuszny (jednostronny) oraz SEA przypięte w komorze sekcyjnej do mikrodysekcji. Czerwona strzałka wskazuje miejsce pierwszej głównej bifurkacji SEA (t.j. punkt, w którym należy zakończyć oczyszczanie naczynia). Pasek skali = 1 cm. C) Izolowany fragment rurki komórek śródbłonka z SEA. Obraz w kontraście interferencyjnym (DIC) rurki śródbłonka po 1 h inkubacji w temperaturze pokojowej. Rurka śródbłonka była przepłukiwana buforem do superfuzji z prędkością 3 ml/min. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz.

Rysunek 4. Fluorescencja wapnia w rurce z komórek śródbłonkowych. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne rurki śródbłonkowej w odpowiedzi na stymulację 1 µM acetylocholiny. A) Fluorescencja przed stymulacją. B) Fluorescencja rurki śródbłonkowej w momencie podania acetylocholiny, t=0 sec. C) Fluorescencja rurki śródbłonkowej w t=5 sec. D) Fluorescencja rurki śródbłonkowej w t=10 sec. E) Fluorescencja rurki śródbłonkowej w t=15 sec. F) Fluorescencja rurki śródbłonkowej w t=20 sec. Paski skali = 40 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy izolację śródbłonka z SEA i zastosowanie tego preparatu do wizualizacji zdarzeń sygnalizacyjnych Ca^{2 +} w obrębie jego składowych EC. Procedura ta została zaadaptowana z procedury pierwotnie opracowanej w celu wyizolowania śródbłonka z tętniczek mięśnia cremaster⁸ chomika. Wykorzystując drobne zmiany przedstawionych tu technik, wyizolowaliśmy śródbłonek z różnych łożysk naczyniowych, w tym: tętnic zasilających mięśnia retraktora chomika i tętniczek torebki policzkowej¹⁰, tętniczki nadbrzusza górnego górnego myszy^6,7,9, tętnice krezkowe i mózgowe myszy oraz mikronaczynia limfatyczne (obserwacje niepublikowane; dołączono odniesienia do izolacji naczyń krezkowych¹² i naczyń mózgowych¹³)). Izolowanie śródbłonka od nowych łożysk naczyniowych może wymagać modyfikacji oryginalnego protokołu. Jeśli izolacja się nie powiedzie, najlepiej zacząć od zmiany czasu trawienia: Wydłuż czas trawienia, jeśli rurki śródbłonka są trudne do wyizolowania od komórek mięśni gładkich i przydanki i skróć czas trawienia, jeśli rurka śródbłonka nie pozostaje nienaruszona. Jeśli zmiana czasu trawienia nie powiedzie się, należy spróbować dostosować stężenie enzymów trawiennych lub temperaturę trawienia. Inną opcją jest zmniejszenie średnicy wewnętrznej pipety cierniowej, co zwiększa siłę ścinającą podczas usuwania komórek mięśni gładkich. Zwiększenie prędkości wyrzutu płynu może być również wypróbowane w celu uzyskania tego samego efektu, ale z większym prawdopodobieństwem uszkodzi preparat. Należy zdawać sobie sprawę, że wyizolowanie nienaruszonych jajowodów śródbłonka z naczyń, w których komórki śródbłonka nie są dobrze połączone ze sobą białkami połączeniowymi, może nie być możliwe.

Dysocjację komórek mięśni gładkich po trawieniu enzymatycznym początkowo przeprowadzono przy użyciu pipetora ręcznego⁸. Udoskonaliliśmy procedurę trituracji za pomocą systemu mikrostrzykawek, który umożliwił konsekwentną izolację dłuższych rurek śródbłonka (do 3 mm)⁶. Podczas korzystania z tego systemu pipeta do rozcierania jest napełniana olejem mineralnym, aby zapewnić ciągłą kolumnę płynu między tłokiem sterującym ruchem płynu a PSS zawierającym segment naczynia. Nieściśliwość płynu wraz ze stałą siłą napędową tłoka mikrostrzykawki powoduje ciągłe ścinanie, gdy naczynie jest przepychane przez końcówkę pipety. Natomiast techniki ręczne często stosowane do dysocjacji komórek (np. ściskanie gumowej gruszki na końcu pipety Pasteura) polegają na sprężaniu powietrza, co wprowadza zmienność ciśnienia sterującego, a tym samym ścinanie wywierane na końcówkę pipety.

Przygotowanie rurki do badania funkcji śródbłonka w mikronaczyniach ma wiele zalet. Pierwszym z nich jest to, że proces izolacji zapewnia odrębne, jednorodne natywne populacje komórkowe EC i komórek mięśni gładkich. Ponieważ EC pozostają fizycznie połączone jako rurki, różnią się od pojedynczych komórek mięśni gładkich, które zachowują konfigurację "C", jeśli pozostają rozluźnione podczas trituracji. W ten sposób można łatwo rozróżnić poszczególne typy komórek, np. podczas pobierania próbek do technik molekularnych, takich jak PCR w czasie rzeczywistym i immunohistochemia¹⁰. Ponieważ wiele probówek jest izolowanych z jednego naczynia (lub z naczyń dwustronnych, jak ma to miejsce w przypadku SEA), dane molekularne i dane funkcjonalne można uzyskać z tych samych naczyń danego zwierzęcia. W ten sposób ekspresja molekularna może być skorelowana z funkcjonalnym zachowaniem śródbłonka mikronaczyniowego. Co więcej, zarówno wewnątrz-, jak i międzykomórkowe zdarzenia sygnalizacyjne nieodłącznie związane ze śródbłonkiem mikronaczyniowym mogą być rozwiązane niezależnie od wpływu sił hemodynamicznych (ciśnienie, przepływ), czynników wazoaktywnych przenoszonych w krwiobiegu (np. hormonów) lub od otaczających komórek mięśni gładkich (np. poprzez sprzężenie mięśniowo-śródbłonkowe^14-16), nerwów¹⁷ lub miąższu tkankowego¹⁸.

Co ważne, ponieważ śródbłonek jest świeżo wyizolowany z wyznaczonych mikronaczyń, nie ma zmiany fenotypu, która byłaby w inny sposób związana z hodowlą EC^19-21. Na przykład, hodowane EC tracą ekspresję receptora muskarynowego, a tym samym zmieniają swoje profile sygnalizacji wapniowej. Co więcej, właściwości elektrofizjologiczne EC mogą się zmieniać w kulturze²². Ponieważ poszczególne EC pozostają sprzężone przez funkcjonalne kanały połączeń szczelinowych, rurka śródbłonka stanowi idealny model do badania przewodzenia sygnałów elektrycznych i Ca²⁺ między komórkami^6,7. Należy również zauważyć, że zdysocjowane komórki mięśni gładkich są łatwo badane za pomocą technik patch-clamp w celu uzyskania uzupełniających danych leżących u podstaw funkcji mikrokrążenia²³.

Kluczowym ograniczeniem modelu rurki śródbłonkowej jest niestabilność preparatu wraz ze wzrostem temperatury. Podczas gdy nasze preparaty z SEA okazały się stabilne i zdrowe w temperaturze pokojowej otoczenia (~24 °C) i przez kilka godzin w temperaturze 32 °C, degradacja morfologiczna i funkcjonalna następuje w czasie krótszym niż godzina w temperaturze 37 °C⁹. Drugim ważnym ograniczeniem rurki śródbłonka jest utrata połączeń mięśniowo-śródbłonkowych i ich nieodłącznych domen sygnałowych, które są integralną częścią funkcji EC w nienaruszonej ścianie naczynia^14-16. Należy również zauważyć, że podczas gdy dłuższe rurki umożliwiają badanie sygnalizacji międzykomórkowej na stosunkowo duże odległości⁶, przygotowanie rurek jest skomplikowane w miarę ich wydłużania, ponieważ coraz trudniej jest w pełni dysocjować otaczające komórki mięśni gładkich i przydanki. Odkryliśmy, że rurki dłuższe niż 1-2 mm są również trudniejsze do ustawienia i zamocowania w komorze przepływowej. W przeciwieństwie do tego, podczas gdy krótsze rurki (np. <1 mm) umożliwiają badanie Ca²⁺ i sygnałów elektrycznych⁸, są one trudne do utrzymania podczas superfuzji w komorze przepływowej. Wreszcie, nawet przy optymalnej obustronnej izolacji rurek, nie ma wystarczającego materiału do tradycyjnej kwantyfikacji ekspresji białek przy użyciu zachodnich blotów, chociaż znakowanie immunologiczne zapewnia wskaźnik ekspresji i lokalizacji białka. Pomimo tych ograniczeń, rurka śródbłonka stanowi nowatorski preparat dostarczający nowych informacji na temat mechanizmów funkcjonowania komórek śródbłonka mikronaczyniowego in vivo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek sodu	Fisher	S642-212
Chlorek potasu	Sigma	P9541
Siarczan magnezu	Sigma	M2643
Chlorek wapnia	Sigma	C1016
Nitroprusydek sodu	Sigma	431451
Albumina surowicy bydlęcej	USB	9048-46-8
Papain	Sigma	P-4762
Collagenase	Sigma	C-8051
Dithioerythritol	Sigma	D-8255
Szkło boroscilicate (pipety do kaniulacji i pinów)	Warner Instruments	G150-4
Szkło boroscilicate (pipety Trituration)	World Precision Instruments	4897
Nanolitr Injector Microsyringe	World Precision Instruments	B203MC4	zaktualizowany do Nanoliter 2010 z Nanoliter 2000
Micro4 Controller	World Precision Instruments	SYS-MICRO4
12 mm x 75 mm Probówki hodowlane	Fisher	14-961-26
3-osiowy mikromanipulator	Siskiyou Corp	DT3-100	Trzymanie i ustawianie pipet
przypinającychKomora przepływowa	Warner Instruments	RC-27N
100-1,000 µ l Pipeta	Eppendorf	3120000062	Do przenoszenia przetrawionego segmentu naczynia do komory przepływowej
1 ml Końcówki do pipet	Fisher	02-707-405	Do przenoszenia przetrawionego segmentu naczynia do komory przepływowej
Mikroskop pionowy	Olympus	BX51W1	Rzeczywisty mikroskop zależy od użytkownika
System konfokalny z wirującym dyskiem Obrazowanie konfokalne	Yokogawa	CSU-X1	jest opcjonalne
Kamera XR/TURBO EX Stanford	Photonics	XR/TURBO EX	Idealny dla naszych potrzeb; może się różnić w zależności od użytkownika
Piper Control Software	Oprogramowanie do obrazowania Stanford Photonics		dla kamery TURBO EX
Stereo Microscrope	Leica	MZ8	może się różnić w zależności od użytkownika
Sylgard	Dow Corning	184
Nożyczki do mikrodysekcji	Narzędzia do nauki	15003-08
Dumont Kleszcze	Fine Science Tools	#5/45
Minutiens Szpilki do owadów	Austerlitz	Rozmiar M 0,15 mm
GP Millipore Express PLUS Membrana	Millipore	SCGPT05RE
Urządzenie do punktowania pipet	Austin Flameworks	Małe ręczne narzędzie do punktowania	austinflameworks.com
kompaktowy trymer dla zwierząt	Wahl Clipper Corp.	Model 9966	Dobrze wyczyść po każdym użyciu, aby zachować żywotność